Mittlere Vorbereitung für den Anbau von Mikroorganismen unter streng anaeroben/anoxischen Bedingungen

Im Gegensatz zu aeroben Organismen erfordern streng anaerobe Mikroorganismen das Fehlen von Sauerstoff. Da Sauerstoff in der Luft allgegenwärtig ist, ist die Aufbewahrung sauerstofffreier Bedingungen während des Anbaus eine Voraussetzung für die anaerobe Kultivierung. Die angewandte Technik stellt eine einfache und kostengünstige Methode dar, um anoxische Bedingungen zu schaffen, um eine gemischte mikrobielle Population in flüssiger Kultur zu kultivieren.

Diese Technik kann auch für den Anbau reiner Kulturen angewendet werden. Für hochsauerstoffempfindliche Mikroorganismen ist dieses Verfahren jedoch möglicherweise nicht anwendbar. Beginnen Sie mit dem Wiegen der mittleren Zutaten in einem geeigneten Kolben und lösen Sie sie mit einem halben Volumen destilliertem Wasser auf.

Fügen Sie dann Milliliter REDOX-Indikator hinzu, gefolgt von Vitaminen in Spurenelementlösung. Stellen Sie den pH-Wert entsprechend den Anforderungen des Organismus ein und bringen Sie das Endvolumen mit destilliertem Wasser auf 1 Liter. Die Farbe des REDOX-Indikators ist pH-abhängig und kann einige Zeit benötigen, um sich anzupassen.

120 Milliliter Serumkolben mit 50 Milliliter Medium füllen und in einem 100 Grad Celsius Wasserbad 20 bis 30 Minuten lang bebrüten, um die Löslichkeit des Sauerstoffs in der flüssigen Phase zu reduzieren. Spülen Sie den Kopfraum mit Stickstoff. Achten Sie bei der Arbeit mit Stickstoff auf eine angemessene Raumlüftung.

Schließen Sie die Kolben mit Butylgummi-Septa, und fixieren Sie die Aluminiumkappen. Als nächstes fügen Sie 0,1 Milliliter Reduktionsmittel zu jedem Kolben hinzu, um das REDOX-Potenzial weiter zu reduzieren. Und autoklavieren Sie die Kolben für 20 Minuten bei 121 Grad Celsius.

Bei der Anwendung dieses Protokolls muss ein Autoklav verwendet werden, der für die Sterilisation geschlossener Gefäße zertifiziert ist. Andernfalls kann ein Durchdruck, der durch temperaturauflösende Temperaturerhöhungen entsteht, dazu führen, dass Serumkolben explodieren. Um Inokulum aus anaeroben Fermenter vorzubereiten, 400 Milliliter destilliertes Wasser in einen Kolben geben und zum Kochen bringen.

Kühlen Sie es auf ca. 30 Grad Celsius ab, während Sie den Kopfraum dauerhaft mit Stickstoff spülen. Fügen Sie etwa 100 Gramm Schlamm, abgeleitet von einem anaeroben Fermenter, um sicherzustellen, dass die genaue Masse des Schlamms für die Bestimmung der Verdünnung aufzeichnet. Den Kopfraum des Kolbens mit Stickstoff tauschen und mit einem Butylgummiseptum schließen.

Schütteln Sie den Kolben 30 Minuten bei 120 U/min. Lassen Sie größere Schlammpartikel sedimentieren, verwenden Sie dann eine Spritze und Kanüle, um 5 Milliliter Inokulum zu entfernen und in einen zuvor vorbereiteten Serumkolben zu injizieren. Inkubieren Sie den geimpften Serumkolben bei einer geeigneten Temperatur für das Experiment, um sicherzustellen, dass der durch den Temperaturanstieg verursachte Überdruck etwa 15 bis 30 Minuten nach Beginn der Inkubation entleert wird.

Um die Produktion und Zusammensetzung von Biogas während der Inkubationszeit zu bewerten, erfassen Sie den aktuellen Luftdruck und bereiten Sie ein Manometer vor, um den Druck innerhalb des Kolbens zu bewerten. Schütteln Sie die Kolben und entfernen Sie 1 Milliliter Kopfraumgas mit der Spritze und Kanüle. Messen Sie die Wasserstoff-, Sauerstoff-, Methan- und Kohlendioxidkonzentration mithilfe der Gaschromatographie.

Verwenden Sie 1 Milliliter Flüssigkeit aus dem Kolben, um die Konzentrationen aller hohen Fettsäuren gemäß Manuskriptanweisungen zu überwachen, und entleeren Sie die Kolben über Druck, nachdem Sie sie auf die entsprechende Temperatur zurückgebracht haben. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Miniatur-Bioreaktoren zu erstellen, die anaerobe Verdauungen durchführen. Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin, Fleischextrakt und Kasein wurden in 3 verschiedenen Konzentrationen zugegeben, und die Methanproduktion wurde über eine 28-tägige Inkubationszeit überwacht.

Methanogene wurden durch Dieasie nasprogiert, indem das Co-Enzym F420, ein Elektronenträger in der Methanogenese, ausstrahlt wurde und eine blaugrüne Fluoreszenz mit einem Absorptionsmaximum von 420 Nanometern aufweist. Gleichzeitig mit der Gasanalyse wurden Proben auf flüchtige Fettsäure und Phenylsäurekonzentrationen während der Inkubationszeit analysiert. Molekularbiologische Methoden, die auf die Fülle spezifischer Mikroorganismen und/oder die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft an einem bestimmten Punkt des Experiments abzielen, können mit dem beschriebenen Verfahren angewendet werden.