Name: Messung der Chitinase-Aktivität in biologischen Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 s
Description: Erfahren Sie eine vereinfachte Methode zur Messung der Chitinase-Aktivität in biologischen Proben wie Serum. Diese Technik ermöglicht die Überwachung therapeutischer Wirksamkeit bei Erkrankungen wie Morbus Gaucher.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Forschung wurde von der American Lung Association und der American Thoracic Society Awards an LS unterstützt. Die Autoren möchten Dr. Jack Elias und Dr. Chun Geun Lee aufrichtig für die Bereitstellung transgener Mausstämme danken.

Alle tierischen Eingriffe wurden im Rahmen eines von der IACUC zugelassenen Protokolls an der Yale University School of Medicine durchgeführt.
1. Maus-Sample-Sammlung
<ol><li>
Anästhesisierung
	<ol>
<li>Anästhesisieren Sie Mäuse mit Ketamin und Xylazin (100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blutprobenentnahme
	<ol>
<li>Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Nicht-Reaktion auf eine Zehenklemme.</li>
		<li>Öffnen Sie chirurgisch die Brusthöhle, um das Herz freizulegen.</li>
		<li>Legen Sie eine 26,5 G Nadel in den linken Ventrikel ein und sammeln Sie Blut in eine Spritze. HINWEIS: In der Regel können etwa 0,5-1 ml Blut von einer gesunden 20-25 g Maus geerntet werden.</li>
		<li>Sammeln Sie das Blut in heparinisierten Röhren, für die Plasmasammlung, oder nicht-heparinisierte Röhren für die Serumsammlung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammlung von Bronchoalveolar-Lavageflüssigkeit (BAL)
	<ol>
<li>Um die BAL zu sammeln, machen Sie einen vertikalen Schnitt am Hals, um die Luftröhre freizulegen.</li>
		<li>Die Luftröhre mit einem 22 G Katheter anfassen und mit einer Schnur fest sichern, um ein Auslaufen aus der Nase der Maus zu verhindern.</li>
		<li>Proginzieren Sie langsam zwei Aliquots steriler Phosphat-gepufferter Salzin (PBS, je 0,75 ml) über die Luftröhre in die Lunge und holen Sie sie zurück.</li>
		<li>Pool Aliquots und halten Sie auf Eis für weitere Analysen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verarbeitung der biologischen Proben.
	<ol>
<li>Blutprobe: Entweder frisch (Plasma) oder nach Zulassung der Gerinnung für 4 h (Serum), Zentrifuge bei 600 x g für 10 min. Nehmen Sie den Überstand und frieren Sie entweder für die Lagerung oder für Experimente.</li>
		<li>BAL: Zentrifugieren Sie die Probe bei 350 x g für 5 min. Nehmen Sie den Überstand und frieren Sie entweder für die Lagerung oder für Experimente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Chitinase Assay
HINWEIS: Die Wissenschaft hinter dem Test ist relativ einfach. Ein nicht fluoreszierendes Substrat wird durch enzymatisch aktive Chitinase zu einem fluoreszierenden Produkt spaltet, das dann als indirekter Marker der Chitinaseaktivität gemessen wird. Die Chitinasen innerhalb der Proben brechen das Substrat 4-Methylumbelliferyl-D-N, N'-Diacetylchitobiose im 1x McIlvain Puffer auf. Ein fluoreszierendes Molekül 4-Methylumbelliferyl wird freigesetzt. Durch die Messung der Gesamtfluoreszenz jedes Brunnens erhalten wir eine genaue Messung der aktiven Chitinase in jeder Probe. Da der Abbau von Chitin durch Chitinase eine hydrolytische Reaktion ist, beendet der Stop-Puffer, eine Mischung aus 0,3 m Glycin und NaOH (12,0 g/l bei pH 10,6), den Abbau von Chitin, indem er eine Umgebung schafft, die zu einfach ist, um das Enzym zu funktionieren.
<ol><li>
Bereiten Sie die Substrate, Standards und Lösungen vor.
	<ol>
<li>Bereiten Sie den McIlvain-Puffer vor. McIlvain Buffer besteht aus 0,1 M Citrat und 0,2 M Phosphat bei einem pH-Wert von 5,2. Bei einem Verhältnis von 1:1 für 1x McIlvain Puffer verdünnen.</li>
		<li>Lösen Sie sowohl 4-Methylumbelliferyl-D-N, N'-Diacetylchitobiose als auch 4-Methylumbelliferyl ß-D-N, N', N"-triacetylchitotriose in 1x McIlvain Buffer bis zu einer Konzentration von je 500 m. HINWEIS: Lagerlösung kann bei -20 °C für weitere Anwendungen gelagert werden; am besten in Aliquots gelagert.</li>
		<li>Standard, 4-Methylumbelliferon, auf eine Konzentration von 0,1 mM im Stop-Puffer (Mischung aus 0,3 m Glycin und NaOH (12,0 g/l bei pH 10,6)) auflösen, um die Standard-Kurvenstammlösung zu erstellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Erstellen und verkleben Sie die Arbeitslösung.
	<ol>
<li>Kombinieren Sie 1x McIlvain Buffer und Chitin Substrat 4-Methylumbelliferyl-D-N, N'-Diacetylchitobiose, um die Arbeitslösung zu schaffen. Für 10 Proben 100 l Substrat mit 2,17 ml 1x McIlvain-Puffer mischen. Weitere Berechnungen, die auf dem Stichprobenumfang basieren, finden Sie in Tabelle 1. HINWEIS: Verwenden Sie 4-Methylumbelliferyl ß-D-N, N', N"-Triacetylchitotriose für menschliche Proben. Während beide Substrate entweder durch menschliche oder Mausenzyme zerkpft werden können, wurden sie entweder für menschliche oder Mausproben auf der Grundlage der Effizienz der Spaltung6zugeordnet.</li>
		<li>Pipette 95 l Arbeitslösung in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fügen Sie der Arbeitslösung Biospecimenproben hinzu.
	<ol>
<li>Als nächstes fügen Sie jedem Brunnen 5 l der Testprobe (Blut/BAL/Gewebelysat/andere biologische Flüssigkeit) hinzu.</li>
		<li>Mischen Sie die Probe in die Arbeitslösung, um die genauesten und zuverlässigsten Ergebnisse zu erzielen. HINWEIS: Die Proben sollten in Duplikaten/Triplicaten ausgeführt werden, wobei den potenziellen Kanteneffekten besondere Aufmerksamkeit gewidmet wird. Alle Proben sollten vorgewärmt werden, um den Kanteneffekt zu minimieren. Da der Test eine Reaktion zwischen Chitinasen in der Probe und Substrat in der Arbeitslösung beinhaltet, ist es am besten, relativ schnell zu arbeiten, um den Zeitunterschied zwischen der Vergoldung der ersten Probe und der letzten Probe plattiert zu minimieren. Mehrkanalpipetten werden empfohlen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bei 37 °C inkubieren.
	<ol>
<li>Die Platte bedecken und kurz schütteln (5 s).</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 15 min. Dies ermöglicht die enzymatische Reaktion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie die Standardkurve vor.
	<ol>
<li>Während die Proben inkubieren, bereiten Sie eine serielle Verdünnung von 4-Methylumbelliferon vor, einem Standard, der häufig bei der fluorimetrischen Bestimmung der Enzymaktivität verwendet wird.</li>
		<li>Verdünnen Sie den Vorrat der Standardlösung im Stop-Puffer auf eine Konzentration von 5 m.</li>
		<li>Führen Sie eine Reihe von Verdünnungen durch, wie in Tabelle 2angegeben. Fügen Sie die Komponenten in der angegebenen Menge hinzu und mischen Sie sie gut. HINWEIS: Die Standardkurve trägt dazu bei, dass gemessene Proben in den linearen Bereich der Standardkurve fallen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stoppen Sie die Reaktion mit Stopppuffer.
	<ol>
<li>Fügen Sie jedem Bohrwert 200 L Stop-Puffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plate die Standards.
	<ol>
<li>Fügen Sie 300 l jedes Standards pro Brunnen in Duplikaten auf der gleichen Platte hinzu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lesen Sie die Platte mit einem fluorometrischen Lesegerät.
	<ol>
<li>Lesen Sie die Platte bei einer Anregung von 360 nm und einer Emission von 455 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Datenanalyse
<ol><li>
Subtrahieren der Leerzeichen
	<ol>
<li>Durchschnitt der Werte der doppelten Standardverdünnungen, die kein 4-Methylumbelliferon haben. Subtrahieren Sie diesen Wert von allen anderen aufgezeichneten Werten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nehmen Sie den Durchschnitt der technischen Replikationen und zeichnen Sie die Standards.
	<ol>
<li>Durchschnittlich die beiden Messwerte für jede Konzentration und grafisch den durchschnittlichen Messwert nach Konzentration. HINWEIS: Das resultierende Diagramm sollte linear aussehen und einen R2-Wert nahe 1 aufweisen. Ist dies nicht der Fall, kann es erforderlich sein, die Standards zu wiederholen und die Platte erneut zu lesen, um die Qualität der Datenanalyse zu gewährleisten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Standardisieren Sie die Auslesewerte.
	<ol>
<li>Erstellen Sie eine am besten passende Linie für die dargestellten Standarddaten. Teilen Sie die Auslesungen der Proben durch die Neigung der am besten passenden Linie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vergleichen Sie Werte aus Steuerelementgruppe und Variablengruppe.
	<ol>
<li>Verwenden Sie einen t-Test oder ANOVA für mehr als zwei Gruppen, um zu bestimmen, ob der Unterschied zwischen Gruppen statistisch signifikant ist. Die Werte nehmen die Einheiten nmol/mL.h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinases%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li>
<li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chitotriosidase+%28chitinase+1%29+under+normal+and+disease+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Epithelial+Biology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/</a> 1-9 (2012).</li>
<li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Chitin+and+Chitinase%2FChitinase-Like+Proteins+in+Inflammation%2C+Tissue+Remodeling%2C+and+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li>
<li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase%3A+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li>
<li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li>
<li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+Deficiency%3A+A+Mutation+Update+in+an+African+Population%5BTitle%5D)+AND+%22JIMD+Reports%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population.</a> JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).</li>
<li>Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+CHI3L-1+and+CHIT-1+Expression+in+Differentiated+and+Polarized+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages.</a> Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).</li>
<li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701(2015).</li>
<li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Research%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li>
<li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+sensitive+and+easy+colorimetric+assay+for+chitinase+and+cellulase+activity+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection.</a> Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).</li>
<li>Schales, O., Schales, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+for+the+determination+of+glucose+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Fed+Clin+Res%22%5BJournal%5D)">Simple method for the determination of glucose in blood.</a> Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623</a> 78(1945).</li>
<li>Zarei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Chitinase+with+Antifungal+Activity+from+a+Native+Serratia+Marcescens+B4A%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+Mammalian+Chitinase+in+Asthmatic+Th2+Inflammation+and+IL-13+Pathway+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation.</a> Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).</li>
<li>Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+elevation+of+plasma+chitotriosidase+activity.+A+novel+hallmark+of+Gaucher+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).</li>
<li>Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+in+colostrum+from+African+and+Caucasian+women%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).</li>
<li>Maddens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase-like+Proteins+are+Candidate+Biomarkers+for+Sepsis-induced+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).</li>
<li>Hector, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+activation+in+patients+with+fungus-associated+cystic+fibrosis+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).</li>
<li>Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chitotriosidase+is+expressed+in+the+eye+and+lacrimal+gland+and+has+an+antimicrobial+spectrum+different+from+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme.</a> Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).</li>
<li>Kim, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMCase+is+a+crucial+regulator+of+type+2+immune+responses+to+inhaled+house+dust+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).</li>
<li>Olkhovych, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitotriosidase+activity+as+additional+biomarker+in+the+diagnosis+of+lysosomal+storage+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ukrainian+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases.</a> Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).</li>
<li>Bouayadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease%3A+An+Underdiagnosed+Pathology+in+the+Eastern+Moroccan+Population%5BTitle%5D)+AND+%22eJIFCC%22%5BJournal%5D)">Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population.</a> eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).</li>
<li>Tasci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+serum+chitotriosidase+activity+in+early+treatment+of+patients+with+active+tuberculosis+and+a+negative+sputum+smear%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutics+and+Clinical+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).</li>
<li>Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+chitotriosidase+activity+in+acute+Plasmodium+falciparum+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria.</a> Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).</li>
<li>Kitamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitinase+inhibition+promotes+atherosclerosis+in+hyperlipidemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice.</a> American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).</li>
<li>Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Chitinases+and+Chitinase-Like+Proteins+as+Indicators+for+Infl+Ammation+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer.</a> Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).</li>
</ol>

Chitinase-Aktivität hat sich als wichtiger Biomarker für die Vorhersage der Schwere der Krankheit, Krankheitsprogression, therapeutische Wirksamkeit und das Vorhandensein von spezifischen Krankheitserregern18. Obwohl viele der lang postulierten Theorien über die Rolle von Chitinasen nicht experimentell nachgewiesen wurden19, neue Studien haben wichtige Einblicke in die Rolle von Chitinasen und Chitinase wie Proteine in verschiedenenKrankheiten2 ,<sup...

Chitin ist das zweithäufigste Polysaccharid auf der Erde nach Zellulose und dient als wichtiger struktureller Bestandteil einer Vielzahl von Organismen, einschließlich des Exoskeletts von Insekten, Pilzen, Hefen und Algen; einige Wirbeltiere haben auch Chitin1. Chitinasen sind eine Familie von Enzymen, die in der Lage sind, Chitin zu brechen und sind hoch konserviert während der Evolution in Arten von Bakterien bis Säugetiere2,3. Neben Chitinasen haben Säugetiere auch chitinaseähnliche Proteine, die Chitinasen in ihrer Fähigkeit, Chitin zu binden, ähnlich sind, sich aber dadurch unterscheiden, dass sie nicht enzymatisch in der Lage sind, das Chitin zu spalten4.
Obwohl Chitin und Chitinasen seit langem untersucht werden – mit Untersuchungen aus den frühen 1900er Jahren –, lag der Schwerpunkt auf ihrer Rolle bei Insekten und anderen wirbellosen Tieren. Tatsächlich war es erst in den 1960er Jahren, als Wirbeltiere überhaupt Chitinasen hatten. Mit Hilfe eines Chitobias-basierten Assays wurden Chitinasen im Verdauungstrakt einer Reihe von Wirbeltieren, einschließlich Eidechsen und Amseln, nachgewiesen – eine Beobachtung, die auf den Verzehr von Chitin-haltigen Organismen wie Insekten zurückzuführen ist5 .
Säugetiere haben zwei enzymatisch aktive Formen der Chitinase: saure Säugetierchitinase (AMCase; auch bekannt als CHIT2 und CHIA) und Chitotriosidase (CHIT1)4. Beide Proteine sind in der Lage, Chitin zu hydrolysieren. CHIT1 ist jedoch enzymatisch aktiver beim Menschen, wo fast die gesamte Chitinase-Aktivität von CHIT1 abgeleitet ist. 4 Bei Mäusen tragen sowohl Chit1 als auch AMCase fast zu gleichen Teilen zur Gesamtchartase-Aktivitätbei 6. Auf der anderen Seite, Chitinase-ähnliche Proteine fehlt Chitinase-Aktivität.
Chit1 wird hauptsächlich durch Makrophagen abgesondert und wird oft als Immunantwort auf Chitin-haltige Krankheitserregerangesehen 7. Das Enzym hat sich auch bei der Reifung von Monozyten in M1- und M2-Makrophagensubtypen beteiligt, auch ohne das Vorhandensein des Substrats Chitin8. Darüber hinaus kann es auch an der Reifung anderer Immunzellen einschließlich T-Helfer Typ 2 (Th2) Zellen und Eosinophile beteiligt sein – wie sich bei kryptokokkalen Lungeninfektionen gezeigt hat9. Diese Studien deuten auf eine komplexe Rolle von Chitinasen im Immunsystem hin.
In den letzten Jahren wurden Chit1-Spiegel als wichtiger Biomarker für die Progression von über 40 verschiedenen menschlichen Krankheiten, einschließlich lysosomaler Speichererkrankungen, Infektionskrankheiten, Atemwegserkrankungen, endokrinologischen Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Erkrankungen, neurologischen Erkrankungen und anderen (überprüft10). Bei vielen dieser Krankheiten sind die Konzentrationen von Chit1 ein starker Prädiktor für die Schwere der Erkrankung und die therapeutische Wirksamkeit10.
Da Chitinasen einen Ruf als Biomarker für zahlreiche Erkrankungen einschließlich Gaucher-Krankheit gewonnen haben, wurden Werkzeuge und Assays entwickelt, um Tests auf Chitinase-Präsenz zu erleichtern. Zu den älteren Methoden gehören Schales' Verfahren, ein Protokoll, das an einen Blutzuckertest angepasst wurde, und die 3,5 Dinitrosalicylsäure (DNS) Methode. Diese Methoden sind jedoch oft zeitsensibel und technisch schwierig11. Das Verfahren für beide Tests erfordert die Reduktion von anorganischen Oxidationsmitteln, Ferricyanid beispielsweise im Falle des Schales-Verfahrens, wodurch eine Farbänderung entsteht, die nur spektrophotometrisch gemessen werden kann. Darüber hinaus beinhalten beide Tests einen Heiz- oder Siedeschritt, der sowohl zeitaufwändig als auch notwendig ist, damit die Farbe12,13entwickelt werden kann.
Beschrieben hier ist ein schneller und einfacher fluorimetrischer Test zur Bestimmung des Chitinase-Spiegels in Säugetierproben14,15. Zwei der hier verwendeten Proben sind Serum- und Bronchoalveolar-Lavage-Flüssigkeiten (BAL); Chitinase-Aktivität wurde auch in Muttermilch- und Urinproben gemessen, und die Technik kann in dieser Art von Proben sowie in jeder anderen biologischen Flüssigkeit16,17durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>4-Methylumbelliferon</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Standard: wird häufig in fluorimetrischen Assays zur Bestimmung der Enzymaktivität</td></tr><tr><td>verwendet 4MU-GlcNAc2</td><td>Sigma</td><td>M9763</td><td>fluoreszierendes Chitinase-Substrat zur Verwendung in Mausproben</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc3</td><td>Sigma</td><td>M5639</td><td>fluoreszierendes Chitinase-Substrat zur Verwendung in menschlichen Proben</td></tr><tr><td>Zitronensäure-Monohydrat</td><td></td><td></td><td>zur Verwendung in McIlvain-Puffer</td></tr><tr><td>Glycin</td><td></td><td></td><td>zur Verwendung in Stop-Puffer in einer Konzentration von 0,3 M</td></tr><tr><td>Na2HPO4xH2O</td><td></td><td></td><td>zur Verwendung in McIlvain-Puffer</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td></td><td>zur Verwendung in Stopp-Puffer bei einer Konzentration von 12 g/L</td></tr><tr><td>Vision Plate: Unsterile, unbehandelte schwarze 96-Well-Platte</td><td>4titude</td><td>4ti-0224</td><td></td></tr></tbody></table>

messung der chitinase-aktivität in biologischen proben

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Chitinasen sind die Enzyme, die Chitin spalten. Auch in Ermangelung von Chitin, Säugetiere haben erhebliche Mengen an Chitinasen im Körper vorhanden, auch an der Basis. Die genaue Rolle der Chitinase ist nicht bekannt, aber es wurde geglaubt, um eine wichtige Rolle bei der Verdauung und Host-Verteidigung gegen Chitin-haltige Lebensmittel und Krankheitserreger zu spielen. Jüngste Arbeiten, einschließlich unserer, haben eine wichtige Rolle von Chitinase und Chitinase-ähnlichen Proteinen bei der Wirtsimmunität und allergischen Erkrankungen gezeigt. Wichtig ist, dass Chitinase-Aktivitäten als wichtige Biomarker der Krankheitsschwere bei einer Vielzahl von Krankheiten dienen, einschließlich typ-2-entzündlichen Erkrankungen wie Asthma und Lungenfibrose. In ähnlicher Weise haben Patienten mit genetischen Störungen wie der Gaucher-Krankheit deutlich erhöhte Chitinase-Spiegel, die nicht nur mit der Schwere der Erkrankung korrelieren, sondern auch als zuverlässiger Biomarker für die therapeutische Wirksamkeit dienen. Das hier skizzierte Protokoll beschreibt eine einfache, schnelle und unkomplizierte Methode zur Messung der Chitinase-Aktivität in BAL- oder Serumproben von Mäusen und kann aufgrund der stark konservierten Natur der Enzyme weitgehend an menschliche Probanden und andere Modellorganismen angepasst werden.

Die hier gezeigten Ergebnisse stammen aus einer Studie zur Messung der Chitinase-Aktivität in Serum- und BAL-Proben des wilden Typs (C57BL/6) und der transgenen Chit1-Mäuse (auf C57BL/6-Hintergrund), die das Chit1-Gen auf einem Doxycyclin-Promotor überexprimieren. Unsere Daten zeigen, dass sowohl Serum- als auch BAL-Proben eine nachweisbare Chitinase-Aktivität bei Derkgrundwerten von 698,2 x 189,9 nmol/ml und 485,7 x 114 nmol/ml-h aufweisen. Die Überexpression des Chit1-Gens unter Verwendung von Doxycyclin im Trinkwasser...

Hier wird eine einfache Methode zur Messung der Chitinase-Aktivität in biologischen Flüssigkeiten wie Bronchoalveolar-Lavage oder Serum vorgestellt.

Messung der Chitinase-Aktivität in biologischen Proben

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Diese Methode ermöglicht eine effektivere Möglichkeit, die Chitinase-Aktivität in biologischen Proben zu quantifizieren. Chitinase-Aktivität hat sich als ein guter Marker für die Diagnose und therapeutische Wirksamkeit bei zahlreichen Bedingungen und Krankheiten dienen. Frühere Methoden zur Messung der Chitinase-Aktivität waren oft zeitaufwändig und schwierig durchzuführen, beides Probleme, die durch den hier gezeigten Test gelöst wurden.Diese Technik wird dazu beitragen, die potenziellen Chitinasen als diagnostischen und therapeutischen Marker zu erfüllen, indem sie es einfacher macht, die Chitinase-Aktivität zu messen; zum Beispiel kann es verwendet werden, um die Behandlung der Gaucher-Krankheit zu überwachen, da die Chitinase-Aktivität nachweislich während der effektiven Behandlung abnimmt. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Substraten, Standards und Lösungen für den Assay. Bereiten Sie 1x McIlvain Puffer nach den Manuskriptrichtungen vor und verwenden Sie ihn, um Chitinsubstrate auf jeweils 500 Mikromolar zu verdünnen.4-Methylumbelliferon, den Standard, auf eine Konzentration von 0,1 Millimolar im Stop-Puffer auflösen, um eine Standard-Kurvenstammlösung zu erstellen. Mischen Sie für 10 Proben 2,17 Milliliter 1x McIlvain-Puffer mit 100 Mikrolitern des Chitinsubstrats, um eine funktionierende Lösung zu schaffen, und pipette dann 95 Mikroliter der Arbeitslösung in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte. Fügen Sie fünf Mikroliter der Testprobe zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie sie in die Arbeitslösung.Bedecken Sie die Platte und schütteln Sie sie für fünf Sekunden, und bebrüten Sie die Platte dann 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit die enzymatische Reaktion stattfinden kann. In der Zwischenzeit verdünnen Sie die Stammlösung von 4-Methylumbelliferon, um eine Fünf-Mikromolar-Arbeitsstandardlösung zu machen und eine Standardkurve zu erstellen, indem Sie eine Reihe von Verdünnungen nach dem Manuskript vorbereiten. Beginnen Sie mit der Fünf-Mikromolar-Konzentration und mischen Sie jede Verdünnung gut.Nach der Inkubation 200 Mikroliter Stop-Puffer zu jedem Brunnen hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen. Fügen Sie 300-Mikroliter-Duplikate jedes Standards auf dieselbe Platte, dann lesen Sie die Platte bei einer Anregung von 360 Nanometern und einer Emission von 455 Nanometern. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um die Chitinase-Aktivität in bronchoalveolaren Spülen und Serumflüssigkeit endenden Wilden und Chitotriosidase zu exzierenden transgenen Mäusen zu messen.Der Test bestätigt, dass eine Überexpression des CHIT-1-Gens bei Mäusen zu einer erhöhten Chitinase-Aktivität führt. Eine Standardkurve wurde verwendet, um Chitinase basierend auf der Fluoreszenz der Proben zu bestimmen. Das Wichtigste, was Sie beim ersten Versuch des Protokolls beachten sollten, ist, die Proben so schnell und effizient wie möglich hinzuzufügen und dabei noch gründlich zu mischen.Wenn Sie zum ersten Mal beginnen, kann es vorteilhaft sein, weniger Proben pro Durchlauf zu machen, um die Genauigkeit der Messungen zu gewährleisten, aufgrund einer kürzeren Inkubationszeit.

measurement-of-chitinase-activity-in-biological-samples

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben eine niedrige Kosten, hohe Durchsatz-Verfahren zum Screening von Pilzen Endoglucanaseaktivität...

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Dieses Video zeigt einen Assay zum Screening von Enzymen, die beim Abbau komplexer Polysaccharide in pflanzlicher Biomasse unter Verwendung von unlöslicher chromogener Biomasse oder ICB wirksam sind. Die Enzyme hydrolysieren ICB, um lösliche farbstoffgebundene Oligosaccharide freizusetzen, und die Enzymaktivität wird durch kolorimetrische Analyse des Reaktionsprodukts bewertet.

Screening von unlöslichen chromogenen biomassebasierten Enzymen: Ein Assay zur Bewertung der Abbauaktivität von pflanzlichen biomasseabbauenden Enzymen

Dieses Video zeigt die In-vitro-Messung der Enzymaktivität für α-Galactosidase A und saure α-Glucosidase in Proben, die synthetische 4-Methylumbelliferyl-Substrate verwenden.

In-vitro-Messung der Aktivität von α-Galactosidase A und sauren α-Glucosidase-Enzymen

Hier präsentieren wir Protokolle zum schnellen Screening und zur Charakterisierung von Enzymen auf antimikrobielle Aktivität. Der Mikroschiebe-Diffusionsassay und der Farbstofffreisetzungsassay verwenden bakterielle Zielsubstrate für die qualitative und quantitative Bewertung der enzymatischen Aktivität.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Ein Hochdurchsatz-Assay für das Enzym-Screening wird beschrieben. Dieses gebrauchsfertige Multiplex-Assay-Kit besteht aus vorausgewählten C-hromogenen P-Olymer-H-Ydrogel-Substraten (CPH) und komplexenI-nlöslichen C-hromogenen B-iomasse(ICB)-Substraten. Zielenzyme sind Polysaccharid-abbauende Endoenzyme und Proteasen.

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Wir beschreiben ein grundlegendes Protokoll zur Quantifizierung der in vitro ATPase-Aktivität. Dieses Protokoll kann basierend auf dem Aktivitätsgrad und den Anforderungen an eine bestimmte gereinigte ATPase optimiert werden.

Messung<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase Aktivität für die enzymatische Charakterisierung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation der geänderten Histone aus der angehende Hefe Saccharomyces Cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wird anschließend für die quantitative PCR verwendet, um die Fülle und die Lokalisierung von Histon post-translationalen Modifikationen während des Genoms zu befragen.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Wir beschreiben eine modifizierte Agar-basierte Methode zur Quantifizierung der antimykotischen Wirkung pflanzlicher Produkte. Sowohl flüchtige als auch nichtflüchtige Beiträge zur Antimykotika-Aktivität können durch dieses Protokoll bewertet werden. Darüber hinaus kann die Wirksamkeit gegen Pilze in wichtigen Entwicklungsstadien in einem einzigen Versuchsaufbau gemessen werden.

Messung der flüchtigen und nichtflüchtigen Antimykotika-Aktivität von Biocontrol-Produkten

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung quantitativer Daten über die antimykotische Aktivität von Peptiden und anderen Verbindungen, wie z. B. niedermolekularen Antimykotika, gegen Candida albicans. Die Verwendung der optischen Dichte anstelle der Zählung koloniebildender Einheiten zur Quantifizierung der Wachstumshemmung spart Zeit und Ressourcen.

Quantifizierung der antimykotischen Aktivität von Peptiden gegen Candida albicans

In dieser Arbeit werden standardisierte ökotoxikologische Methoden zur Bewertung von Biomarkern in neotropischen Anura-Arten vorgestellt. Insbesondere werden in diesem Artikel verschiedene Methoden auf verschiedenen Ebenen der ökotoxikologischen Bewertung beschrieben, wie z. B. auf genetischer, zellulär-histologischer, biochemischer, morphologischer und individueller Ebene.

Ökotoxikologische Methoden zur Bewertung von Biomarkern auf verschiedenen Skalen in neotropischen Anuren

Erfahren Sie eine vereinfachte Methode zur Messung der Chitinase-Aktivität in biologischen Proben wie Serum. Diese Technik ermöglicht die Überwachung therapeutischer Wirksamkeit bei Erkrankungen wie Morbus Gaucher.

Messung der Chitinase-Aktivität in biologischen Proben

Weitere Videos entdecken