Charakterisierung des Sicklings bei kontrollierter automatisierter Deoxygenierung mit Sauerstoffgradientektacytometrie

Sauerstoffgradientektacytometrie ist ein funktioneller Test, der die individuelle Besickerungsneigung bewertet. Bis heute sind keine anderen funktionalen Assays verfügbar oder verwendet. Sauerstoffgradient ektacytometry ist in der Lage, die Sauerstoffspannung zu bestimmen, bei der Blutzellen von Patienten mit Sichelzellerkrankung beginnen, sichzuersten.

Diese Sauerstoffspannung ist patientenspezifisch und kann als Biomarker für die Schwere der Erkrankung dienen. Bei Sichelzellerkrankungen kann diese Technik zur Überwachung der Wirksamkeit der Behandlung verwendet werden und kann für die Entwicklung neuer Behandlungen verwendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist wichtig, da sie sehr empfindlich ist.

Es gibt zahlreiche Faktoren, die die Messung beeinflussen, die Sie nicht wissen, wenn Sie mit dieser Technik beginnen. Jemand, der dies zum ersten Mal versucht, kann feststellen, dass die Technik sehr empfindlich für die Probenvorbereitung und Probenhandhabung ist. Mein Rat ist, so standardisiert wie möglich zu arbeiten und eine Routine zu entwickeln.

Um dieses Verfahren zu starten, schalten Sie den Computer und das Ektacytometer ein und öffnen Sie die Software auf dem Computer. Öffnen Sie den Stickstoffzylinder, um sicherzustellen, dass der Stickstoff zur Entsauerstofferisierung der Probe zur Verfügung steht. Senken Sie den Bob in der Tasse und stellen Sie sicher, dass der Becher frei drehen kann.

Wenn die Software ausgeführt wird, überprüfen Sie, ob die Meldung geöffnet ist, und klicken Sie auf OK. Stellen Sie sicher, dass das Ektacytometer den Selbstkontrollprozess startet, und wählen Sie Start aus. Wenn die Selbstprüfung fehlschlägt, führen Sie sie erneut aus, indem Sie auf Hardwareprüfung, pO2, Selbstprüfung klicken. Wählen Sie pO2-Scan aus den verschiedenen Tests auf der linken Seite.

Wählen Sie Einstellungen auf der rechten Seite des Bildschirms und stellen Sie sicher, dass sie gemäß den in Tabelle 1 des Textprotokolls aufgeführten Parametern festgelegt sind, um sicherzustellen, dass die gleichen Einstellungen für jede Messung beibehalten werden. Speichern Sie diese Einstellungen, indem Sie auf OK und dann erneut auf OK klicken. Zuerst sammeln Sie Blutproben durch Venepunktur in einer Tube, die EDTA enthält, und lagern Sie das Blut bei vier Grad Celsius für mindestens 30 Minuten, aber nicht länger als 24 Stunden.

Danach die Proben vorsichtig durch Inversion mischen, um zu homogenisieren. Lassen Sie die Proben vor der Messung auf einer Rollbank auf Raumtemperatur erwärmen. Verwenden Sie einen Hämatologie-Analysator, um das komplette Blutbild zu messen, indem Sie die Aspiration in die Röhre legen und die Taste hinter der Nadel des Hämatologie-Analysators drücken, um die Messung zu beginnen, und der Analysator wird zwischen 20 und 200 Mikroliter Vollblut verwenden.

Dann standardisieren Sie die Blutprobe auf eine RBC-Anzahl von 200 Millionen roten Blutkörperchen in fünf Milliliter PVP durch Berechnung des Volumens der Probe, die hinzugefügt werden. Zu Beginn eine Pipettenspitze schneiden und vorbefeuchten, indem Sie das Blut dreimal wieder aufhängen. Dann pipette das berechnete Probenvolumen in eine PVP-Durchstechflasche.

Mischen Sie die Probe vorsichtig manuell durch Inversion, bis sie homogen ist. Ziehen Sie langsam zwei Milliliter Blut und PVP-Mischung in eine Drei-Milliliter-Spritze ohne Nadel. Drücken Sie den Kolben, um sichtbare Luftblasen und überschüssige Probenlösung zu entfernen, bis zwischen 1,5 und 1,8 Milliliter in der Spritze verbleiben.

Injizieren Sie das gesamte Probenvolumen langsam und gleichmäßig durch den Stecker in den Bob. Stellen Sie sicher, dass der Füllstand der Probe über dem Sauerstoffsensor und dem kleinen Saugloch liegt. Klicken Sie in der Software auf Neu und geben Sie die Beispielkennung, Die Anmerkungen, das Spendendatum und die Viskosität von PVP ein.

Klicken Sie auf OK und aspirieren. Nach 60 Sekunden des Ansaugens dreht sich der Becher und saugt wieder für 15 Sekunden. Wenn die Drehung beendet wird, klicken Sie auf OK. Schließen Sie den Maschinendeckel.

Klicken Sie auf Weiter und starten Sie jetzt, da die Sauerstoffgradientenektacytometrie mit einer festen Verstärkung durchgeführt wird. Drucken Sie nach der Messung den Bericht, der die Kurve und die Parameter anzeigt, die automatisch von der Software berechnet werden. Stellen Sie sicher, dass die Rohdaten automatisch in dem angegebenen Ordner in den Einstellungen gespeichert werden.

Entfernen Sie zunächst die Probenspritze und ersetzen Sie sie durch eine Spritze, die mit destilliertem Wasser oder entionisiertem Wasser gefüllt ist. Drücken Sie sauber und spülen Sie den Stecker während des Spülens, um sicherzustellen, dass er in beide Richtungen spült. Entfernen Sie anschließend die Spritze und heben Sie den Bob an.

Verwenden Sie ein weiches Tuch, um den Bob und den Stecker gründlich zu trocknen. Verwenden Sie dann eine große Spritze, um den Stecker zu spülen, um das im Rohr und bob verbleibende Wasser zu entfernen. Halten Sie die Spritze am Einlass und blockieren Sie den Auslass des Bobs, um den Gegendruck in den Rohren zu erhalten und so das restliche Wasser zu entfernen.

Trocknen Sie dann die Tasse, während Sie vermeiden, den Sauerstofffleck zu berühren. Senken Sie den Bob und den Becher, der die Maschine für die nächste Messung vorbereitet. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Maschine ordnungsgemäß gespült ist, stellen Sie sicher, dass sich die richtigen Rohre auf die Reinigungslösung beziehen.

Schließen Sie die Software, drücken Sie schließen, und drücken Sie den Start, um das End-of-Day-Reinigungsprogramm zu beginnen. Dann leeren Sie die Abfallflasche und verwenden Sie ein weiches Tuch, um den Bob und die Tasse zu trocknen. Schließen Sie den Deckel der Maschine.

Schließen Sie den Stickstoffzylinder, und schalten Sie Computer und Maschine aus. Sauerstoffgradientektacytometrie kann verwendet werden, um das Sichelverhalten roter Blutkörperchen unter einer Reihe von Sauerstoffkonzentrationen zu untersuchen. In der Sauerstoffgradientenektacytometrie folgt auf die kontinuierliche Desoxygenierung der Probe durch Stickstoffgas eine schnelle Reoxygenierung durch Umgebungsluft.

Unter diesen Bedingungen kann die Kränkung roter Blutkörperchen unter Deoxygenierung beobachtet werden. Dies führt zu einer Verzerrung des Beugungsmusters, da gekränkte rote Zellen unter der angewendeten Scherspannung nicht richtig ausgerichtet werden. Die sichlerote Blutkörperchen zeigen eine Formänderung während der Deoxygenierung, die Bedingungen während der Sauerstoffgradientenektacytometrie imitiert, aber keine Formänderung zeigt, wenn sie mit Sauerstoff versorgt wird.

Dieser Prozess führt zu einer Verzerrung des Beugungsmusters während der Sauerstoffgradientenektacytometrie und damit zu einer Abnahme des Dehnungsindex. Eine repräsentative Kurve, die durch das Ektacytometer erhalten wird, zeigt die sechs Parameter, die unterschiedliche Merkmale des Sicklingverhaltens widerspiegeln: den maximalen Dehnungsindex, den minimalen Dehnungsindex, das Delta-EI, den Seilenpunkt, den Bereich unter der Kurve und die Erholung. Repräsentative Kurven roter Blutkörperchen aus gesunden Kontrollen, Patienten mit HbS-Merkmalen und ein homozygoter Sichelzellpatienten werden hier gezeigt.

Die deutlichen Unterschiede in den repräsentativen Kurven homozygoter Sichelzellpatienten, die mit Hydroxylharnstoff und Transfusion behandelt werden, unterstreichen die Nützlichkeit dieses Assays. Es gibt zahlreiche Faktoren, die die Sauerstoffgradientenektacytometrie beeinflussen, wie Temperatur, pH und Osmolarität des PVP, aber auch Wasserreste und der Grad der Vermischung der Blutprobenlösung können die Messungen beeinflussen. Daher ist eine standardisierte Probenhandhabung unerlässlich.

Das Ergebnis der Sauerstoffgradientenektacytometrie kann direkt in der klinischen Praxis umgesetzt werden und trägt so zur personalisierten Medizin bei. Diese Technik ermöglicht es, das Sichelverhalten zu untersuchen, um das Potenzial neuer Behandlungen für Sichelzellerkrankungen zu untersuchen und kann als klinisch relevanter Biomarker für den Schweregrad von Krankheiten dienen.