Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs in Glioblastom und deren Engineering in künstliche Cluster für die Gentherapie

Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Modulation vieler Mikro-RNAs in eukaryotischen Zellen und basiert auf einer sehr einfachen und flexiblen Methode, die molekulare Klonschritte minimiert. Diese Technik hat Auswirkungen auf die Untersuchung von Mikro-RNA-Funktionsinteraktionen in vitro, aber noch wichtiger ist, dass sie eine Plattform für einen effektiveren Einsatz von Mikro-RNAs in der Therapie bietet. Wir haben es hauptsächlich im Zusammenhang mit Hirntumor entwickelt und verwendet, aber es gilt für alle Krankheiten, bei denen mehrere Veränderungen der Genexpression beteiligt sind.

Wir haben unsere künstlichen Transgene in anderen Modellen wie Brust- und Schilddrüsenkrebslinien getestet, die die Reproduzierbarkeit dieser Technik zeigen. Grundkenntnisse der Bioinformatik und Mikro-RNA-Biologie sind für dieses Protokoll hilfreich, aber nicht unentbehrlich. Ein bioinformatischer Ansatz ist wichtig, um relevante Mikro-RNA-Kombinationen und die TRK-11 zu definieren, während die Vertrautheit mit der Mikro-RNA-Verarbeitung messbar wichtig ist, um zu verstehen, wie diese verschiedenen Mikro-RNAs zu künstlichen DNA-Clustern zusammengesetzt werden können, die erfolgreich verarbeitet werden können, sobald sie stabil zu den spezifischen Zellen sind.

Um die Schale zu beschichten, lösen Sie zunächst Poly-D-Lysin in Wasser in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter auf. Gießen Sie die Lösung in der Menge von einem Milliliter Lösung pro 25 Quadratzentimeter Oberfläche. Wirbeln Sie das Gericht, um sicherzustellen, dass die Abdeckung des gesamten Gerichts.

Nach sechs Stunden die Poly-D-Lysin-Lösung ansaugen und zweimal mit PBS abspülen. Platte menschliche neuronale Stammzellen in der Menge von 100. 000 Zellen pro fünf Milliliter des Mediums, entweder in Stammzellmedium, astrozytische Differenzierung Medium oder neuronale Differenzierung simon. Legen Sie die Schale nach der Zellbeschichtung eine Woche lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid und führen Sie eine Mikro-RNA-Expressionsanalyse gemäß dem Manuskript durch.

Um GBM-34 Glioblastom-Stammzellen zu kulturieren, beginnen Sie mit einem mal zehn bis fünf Meter fünften Zellen und fünf Millilitern neurobasalen Mediums in einem 25 Quadratzentimeter niedrigen Befestigungskolben. Legen Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid in einen Brutkasten. 48 Stunden nach der Beschichtung, fügen Sie doppelliche Konzentrationen von DNA-Alkylierungsmittel Temozolomid alle sieben Tage.

Beginnen Sie mit der Zugabe von fünf Mikromolaren TMZ in fünf Milliliter Medium für fünf Tage ergänzt. Nach fünf Tagen, entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie mit frischem Medium ohne Temozolomid, damit sich die überlebenden Zellen erholen können. Nach 48 Stunden 10 mikromolares Temozolomid hinzufügen und weitere fünf Tage brüten.

Wiederholen Sie die Verdoppelung der Temozolomid-Behandlung, bis eine Konzentration von mindestens 100 Mikromolaren erreicht ist und die Zellen gegen das Medikament resistent werden. Nach der Induktion des Widerstands liegen Zellen mit 1 Milliliter Lysis-Reagenz. Extrahieren Sie die gesamte RNA und analysieren Sie die Expression der spezifischen Mikro-RNAs gemäß dem Manuskript.

Um das vorhergesagte Targetome jeder zuvor definierten Mikro-RNA zu erhalten, verwenden Sie Mikro-RNA-Targeting-Vorhersagewerkzeuge. Wählen Sie auf der Titelseite von TargetScan die micro-RNA aus dem vorab ausgefüllten Dropdown-Menü aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Absenden".

Laden Sie die resultierende Liste der Ziele als Tabellenkalkulation über den Link zum Herunterladen der Tabelle herunter. Um die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Vorhersagen zu verringern, schließen Sie nur Ziele innerhalb der Spalte "Konservierte Standorte" und die nachgelagerte Analyse ein. Zusätzliche Mikro-RNA-Vorhersageprogramme erhalten eine weitere Stringenz und enthalten nur Ziele, die allen Algorithmen gemeinsam sind.

Öffnen Sie dann die ToppGene Suite 20. Um die Anreicherung von Signalwegen zu bewerten, die jeder Mikro-RNA gemeinsam sind, fügen Sie die Liste der Ziele ein, die im Fenster der Trainingsgensätze erhalten wurden. Klicken Sie auf HGNC-Symbol als Eintragstyp.

Klicken Sie auf Senden und starten Sie. Das Programm stellt eine Ausgabetabelle mit den wichtigsten GO-Kategorien für die eingegebene Liste der Gene bereit. Um schließlich den Beitrag jeder Mikro-RNA zur Regulierung eines gemeinsamen Signalwegs oder zellulären Prozesses zu ermitteln, öffnen Sie die Venn-Diagramm-Funktion, die auf der Website bioinformatics and Evolutionary Genomics bereitgestellt wird.

Überprüfen Sie jedes erhaltene Targetome mit der vollständigen Liste der Gene, die am spezifischen zellulären Prozess beteiligt sind. Wenn sich Ziel-Messenger-RNAs für jeden Micro-RNAs von Interesse in den jeweiligen Fenstern befinden, laden Sie die Liste zum Kopieren und Einfügen ein. Benennen Sie jede Liste mit einem eindeutigen Bezeichner.

Klicken Sie auf Absenden. Das Programm bietet eine visuelle Ausgabe eines Venn-Diagramms mit Zahlen von Genen in jedem Sektor sowie eine vollständige Liste der Messenger-RNAs für jede Teilmenge und Schnittpunktkombinationen. Um die ausgewählten Mikro-RNAs in ein funktionelles Transgen zu gruppieren, erhalten Sie ein transgenes Gerüst auf Basis des miR-17-92-Cluster-Lokus.

Erhalten Sie die Nukleotidsequenz aus dem ensembleierten Genombrowser. Wählen Sie die ca. 800 Basispaar-Kernsequenz aus, die alle sechs kodierten Mikro-RNA-Haarnadeln des Locus und mindestens 200 Nukleotid-Flankensequenzen vor und nach der Kernsequenz umfasst. Fügen Sie die Sequenz in ein beliebiges Wortbearbeitungsprogramm ein.

Definieren Sie die Reihenfolge jedes der sechs nativen Haarnadeln, indem Sie sie in miR-Basis abrufen. Markieren Sie jede dieser Sequenzen innerhalb der Spanne der zuvor identifizierten Kernsequenz. Alle Sequenzen zwischen den einzelnen Haarnadeln stellen Abstandssequenzen dar.

Als nächstes erhalten Sie die Haarnadelsequenzen von Mikro-RNAs, die im Transgen von der miR-Basis überexprimiert werden sollen. Beachten Sie sorgfältig die spezifischen Nukleotide, die sich an den Standorten der Mikroprozessorspaltung befinden. Löschen Sie die nativen Haarnadelsequenzen aus der Kernsequenz mit Ausnahme von drei bis fünf Nukleotiden an den fünf und sieden Enden jeder Haarnadel, die als Akzeptor für die neuen Haarnadeln dienen.

Fügen Sie die Haarnadelsequenzen der gewünschten Micro-RNAs ein, um die zuvor gelöschten Haarnadeln zu ersetzen. Fügen Sie gewünschte Restriktionssequenzen an beiden flankierenden Bereichen des Transgens hinzu, um das Subklonen in Dietionsvektoren ihrer Wahl zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Einschränkungssequenzen nicht innerhalb der Sequenz selbst vorhanden sind.

Um die zweidimensionale Struktur des Transgens zu verifizieren, kopieren Sie die vollständige transgene Sequenz in das RNA-Strukturvorhersageprogramm RNA Webfold. Wählen Sie die Standardprogrammeinstellungen aus, und klicken Sie auf Fortfahren. Analysieren Sie die grafische Ausgabe, insbesondere für das Vorhandensein von gut definierten Haarnadeln in Gegenwart von doppelsträngigen Stammstrukturen, die mindestens 11 Nukleotide proximal zur Mikroprozessorspaltungsstelle sind.

Achten Sie auch auf das Fehlen von Verzweigungspunkten innerhalb der Haarnadelsequenzen. An dieser Stelle ist das Transgen bereit, durch Gensynthese produziert und in die gewünschten Liefervektoren geklont zu werden. Diese Methode ermöglichte die Charakterisierung eines Moduls von drei Mikro-RNAs, die konsequent nach unten in Hirntumoren reguliert sind, die speziell während der neuronalen Differenzierung koexprimiert werden.

Co-Expressionsmuster von Mikro-RNA-Modulen während genotoxischer Belastung wurden bestätigt und deuteten auf eine starke synergistische Aktivität unter diesen drei Mikro-RNAs hin. Das entwickelte Transgen könnte gleichzeitig die Expression der drei Mikro-RNAs in Glioblastomzellen rekapitulieren, sowohl in vitro als auch in vivo, mit erheblichen Eingriffen in die Tumorbiologie und vielversprechender translationaler Anwendbarkeit. Darüber hinaus war der transgene Cluster auch in einem Brustkrebsmodell funktionsfähig.

Die entscheidenden Anforderungen dieses Protokolls sind die Beibehaltung der ursprünglichen Größe der Prozessorspaltung im Transgen. Und stellen Sie sicher, dass die Stammschleifenstruktur von chimer Mikro-RNA-Haarnadeln erhalten bleibt. Mit dieser Methode können wir mehrere biologisch aktive Mikro-RNA-Gene in sehr kurze DNA-Sequenzen konzentrieren, die buchstäblich vitro in alle Liefervektoren für die Gentherapie eingesteckt werden können.

Diese Methode ist ideal, um die funktionelle Wechselwirkung zwischen verschiedenen Mikro-RNAs zu untersuchen und komplexe multifaktorielle zelluläre Bahnen zu stören, die sonst mehrere Wirkstoffkombinationen erfordern.