Name: Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs in Glioblastom und deren Engineering in künstliche Cluster für die Gentherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Erfahren Sie die simultane Modulation mehrerer microRNAs in eukaryotischen Zellen durch künstliche DNA-Cluster. Diese flexible Methode minimiert molekulare Klonierungsschritte und ermöglicht Gentherapieansätze bei Glioblastom.

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Die Autoren bedanken sich bei den Mitgliedern des Harvey Cushing Neuro Oncology Laboratory für die Unterstützung und konstruktive Kritik. Diese Arbeit wurde durch die NINDS-Zuschüsse K12NS80223 und K08NS101091 an P. P. unterstützt.

1. Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs bei Glioblastom
<ol><li>Analyse der breiten differentialen miRNA-Expression bei Glioblastom vs. Gehirn
	<ol>
<li>Bestimmen Sie zunächst die am deutlichsten deregulierten miRNAs im Tumor. Dies kann mit mindestens drei verschiedenen Methoden erreicht werden:<ol>
<li>Mine the Cancer Genome Atlas, gefunden in https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, zur Sequenzierung von Daten11.</li>
			<li>Führen Sie eine Mikroarray-Analyse von einer frischen operativen Probe12durch.</li>
			<li>Verwenden Sie zuvor veröffentlichte Datasets13. HINWEIS: Unabhängig davon, welche Methode gewählt wird, stellt die Ausgabe einen Massensatz von miRNAs bereit, deren Ausdruck statistisch (entweder direkt oder umgekehrt) mit der Tumorbiologie korreliert. Diese anfängliche Gruppe bildet den Pool von miRNAs, die weiter analysiert werden, um eine Teilmenge von miRNAs zu identifizieren, die die strengste funktionelle Assoziation anzeigen, indem eine dynamischere Analyse von Ausdrucksänderungen durchgeführt wird, wie unten erläutert.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Bedingungsspezifische miRNA-Expressionsanalyse
	<ol>
<li>Induktion der Zelldifferenzierung:<ol>
<li>Verwenden Sie vorbeschichtete Poly-D-Lysin (PDL) Kunststoffschalen, um die Bildung einer Monolayer-Kultur zu begünstigen. Für die Schalenbeschichtung PDL in Wasser in einer Konzentration von 100 g/ml auflösen. Verwenden Sie 1 ml Lösung pro 25 cm2 Oberfläche. 2x mit PBS 6 h nach Anwendung der PDL-Lösung abspülen.</li>
			<li>Platte menschliche neuronale Stammzellen in gleichen Mengen (100.000 Zellen/5 ml) entweder im Stammzellmedium (neurobasales Medium + B27-Ergänzung + 20 ng/mL EGF/FGF), astrozytäres Differenzierungsmedium (DMEM + 10% FBS) oder neuronales Differenzierungsmedium (neurobasales Medium + B27 Ergänzung, + 2 M Retinsäure)14. Das Protokoll für Oligodendrozyten Differenzierung erfordert Zugabe von IGF-1 (200 ng/mL) nach EGF/FGF Entfernung14,15.</li>
			<li>Nach der Zellbeschichtung 1 Woche bei 37 °C, 5%CO2in den Inkubator geben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>RNA-Extraktion:<ol>
<li>Entfernen Sie nach 7 Tagen die Zellen aus dem Inkubator und entfernen Sie das Medium.</li>
			<li>Waschen Sie die Zellen mit PBS (5 ml). Fügen Sie dann 1 ml Lysereagenz (siehe Materialtabelle) hinzu, um die Zellen zu lysieren und die Zellen mit einem Zellschaber in ein 1,5 ml Mikrofugerohr zu zerkleinern. Bewahren Sie die Rohre, die die lysierten Zellen enthalten, bei Raumtemperatur (RT) 5 min aufbewahren.</li>
			<li>Fahren Sie mit der vollständigen RNA-Isolierung gemäß den Anweisungen des Herstellers fort.</li>
		</ol>
</li>
		<li>miRNA-Expressionsanalyse:<ol>
<li>Quantifizieren Sie die differenzielle Expression spezifischer miRNAs, die in Schritt 1.1 unter den drei Differenzierungsmustern durch Echtzeit-PCR identifiziert wurden, mit Hilfe von TaqMan-Sonden und nach den Protokollen des Herstellers für Reverse Transkription und PCR-Verstärkung ( Abbildung 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Validierung von miRNA-Clustern durch stressspezifische Herausforderungen
	<ol>
<li>Kultur G34 Glioblastom Stamm-ähnliche Zellen in neurobasalen Medium + B27 Ergänzung + 20 ng/mL EGF/FGF. Beginnen Sie mit 1 x 106 Zellen in 5 ml in einem 25 cm2 niedrigen Befestigungskolben.</li>
		<li>Ab 48 h nach der Beschichtung, fügen Sie die Verdoppelung der Konzentrationen des DNA-Alkylierungsmittels Temozolomid (TMZ) alle 5 Tage wie folgt hinzu:<ol>
<li>Beginnen Sie mit 5 m für 5 Tage. Nach 5 Tagen, entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie mit frischem Medium ohne Temozolomid, damit die überlebenden Zellen sich erholen können. Nach 48 h 10 'M TMZ hinzufügen und weitere 5 Tage brüten.</li>
			<li>Wiederholen Sie Schritt 1.3.2.1, wobei die TMZ-Konzentration jedes Mal verdoppelt wird, bis eine Konzentration von mindestens 100 m erreicht ist und die Zellen gegen das Medikament10resistent werden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bestrahlen Sie in einem parallelen Experiment G34-Zellen wie folgt:<ol>
<li>Ab 48 h nach der Beschichtung von 1 x 106 Zellen in 5 ml in einem 25 cm2 Niedrigbefestigungskolben, bestrahlen Zellen mit 2 Gy Energie (jeder Bestrahlungskörper, der Photonenemission liefert, ist akzeptabel). Geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück und stören Sie nicht. Nach 48 h die Zellen wieder mit zusätzlichen 2 Gy Energie bestrahlen.</li>
			<li>Wiederholen Sie Schritt 1.3.3.1 4x, bis insgesamt 10 Gy Energie verabreicht wird.</li>
			<li>Geben Sie die Zellen in den Inkubator zurück und lassen Sie sie sich mindestens 5 Tage vor der nachgelagerten Analyse in frischem Medium erholen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nach der Induktion der Resistenz, Lyse-Zellen mit Lyse-Reagenz und extrahieren gesamt RNA nach dem Herstellerprotokoll.</li>
		<li>Analysieren Sie die Expression der spezifischen miRNAs, die in den Abschnitten 1.1-1.2 identifiziert sind, wie in Schritt 1.2.1 (Abbildung 2) beschrieben.</li>
	</ol></li>
	<li>Charakterisierung der funktionalen Konvergenz von gruppierten miRNAs
	<ol>
<li>Erhalten Sie das vorhergesagte Targetome jedes miRNAs, das in den Abschnitten 1.2-1.3 definiert ist, die mit miRNA-Targeting-Vorhersagewerkzeugen erhalten wurden. HINWEIS: Wir greifen in der Regel auf TargetScan zurück, da sein Algorithmus regelmäßig aktualisiert wird16. Weitere Vorhersagetools sind miRanda17, miRDB18und DIANA-miRPath19. Alle diese Programme sind kostenlose, webbasierte Anwendungen.<ol>
<li>Wählen Sie auf der Titelseite von Targetscan die miRNA aus dem vorab ausgefüllten Dropdown-Menü aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden.</li>
			<li>Laden Sie die resultierende Liste der Ziele als Tabellenkalkulation mithilfe des Link Tabelle herunterladen herunter (ergänzende Abbildung 1).</li>
			<li>Um die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Vorhersagen zu verringern, beziehen Sie nur Ziele innerhalb der Spalte "Konservierte Standorte" in nachgelagerte Analysen ein. Darüber hinaus kann eine weitere Stringenz durch die Verwendung zusätzlicher miRNA-Vorhersageprogramme (siehe oben) und nur mit Zielen erreicht werden, die allen Algorithmen gemeinsam sind.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Klassifizieren Sie die resultierenden Targetome nach Gene Ontology Kategorien mit ToppGene Suite20, um die Anreicherung von Pfaden zu bewerten, die jeder miRNA gemeinsam sind.<ol>
<li>Fügen Sie die Liste der Ziele, die aus Schritt 1.4.1 stammen, in das Fenster "Training gene set" ein, indem Sie das HGNC-Symbol als Eintragstyp verwenden. Klicken Sie auf Senden > Starten. Das Programm stellt eine Ausgabetabelle mit den wichtigsten "Go"-Kategorien für die eingegebene Liste der Gene bereit (Ergänzende Abbildung 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Um schließlich den Beitrag jeder miRNA zur Regulierung eines gemeinsamen Signalwegs oder zellulären Prozesses (in diesem Fall der Chromatinregulation) zu ermitteln, überprüfen Sie jedes in Schritt 1.4.1 erhaltene Targetome anhand der vollständigen Liste der Gene, die am spezifischen zellulären Prozess beteiligt sind ( z.B. Chromatinregulation), mit der Venn-Diagrammfunktion, die auf der Website bioinformatics and Evolutionary Genomics http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn bereitgestellt wird. HINWEIS: Dieses Programm ermöglicht den Schnittpunkt mehrerer Gruppen gleichzeitig (Abbildung 3). Die spezifischen einzigartigen Ziele, die von jeder miRNA zur Verfügung gestellt werden, werden dann mit Anmerkungen versehen und für nachgelagerte funktionelle Experimente ausgewählt.<ol>
<li>Laden Sie auf der Startseite des Programms die Liste hoch oder kopieren/kleben Sie sie, wenn Sie die Ziel-mRNAs für jede miRNA oder das Interesse an den jeweiligen Fenstern ansprechen. Benennen Sie jede Liste mit einem eindeutigen Bezeichner.</li>
			<li>Klicken Sie auf Senden. Das Programm wird eine visuelle Ausgabe eines Venn-Diagramms mit einer Anzahl von Genen in jedem Sektor sowie eine vollständige Liste der mRNAs für jede Teilmenge und Schnittpunktkombinationen bereitstellen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Montage von miRNA-Modulen in einen polycistronischen Transgenen Cluster
<ol><li>
Herstellung eines transgenen Gerüsts auf Basis von miR-17-92 Cluster-Lokus
	<ol>
<li>Die Nukleotidsequenz des miR-17-92-Clusters beziehen Sie sich über den Ensembl Genombrowser21. Wählen Sie die Sequenz "Kern" des Basispaares mit der Basispaarsequenz aus, die alle sechs codierten miRNA-Haarnadeln des Locus und mindestens 200-Nukleotid-Flankensequenzen sowohl vor- (5') als auch nachgeschaltet (3') der Kernsequenz umfasst.</li>
		<li>Fügen Sie die Sequenz oben in ein beliebiges Wortbearbeitungsprogramm ein.</li>
		<li>Definieren Sie die Reihenfolge jeder der sechs nativen Haarnadeln, indem Sie sie in miRBase22abrufen. Markieren Sie jede dieser Sequenzen innerhalb der zuvor identifizierten "Kernsequenz". Alle Sequenzen zwischen den einzelnen Haarnadeln stellen Abstandssequenzen dar, die für die korrekte Verarbeitung des Transgens wichtig sind.</li>
		<li>Entfernen Sie die nativen Haarnadelsequenzen aus der "Kern"-Sequenz, mit Ausnahme von 3-5 Nukleotiden an den 5' und 3' Enden jeder Haarnadel, die als Akzeptor für die neuen Haarnadeln dienen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Erstellen einer neuen Transgencodierung mehrerer miRNAs der Wahl
	<ol>
<li>Erhalten Sie Haarnadelsequenzen von miRNAs, die im Transgen von miRBase überexprimiert werden sollen. Beachten Sie sorgfältig die spezifischen Nukleotide, die die Standorte der Mikroprozessorspaltung sind.</li>
		<li>Ersetzen Sie die entfernten Haarnadeln (Schritt 2.1.4) durch die Haarnadelsequenzen der gewünschten miRNAs, die in Schritt 2.2.1 erhalten wurden.</li>
		<li>Fügen Sie gewünschte Restriktionssequenzen an beiden flankierenden Bereichen des Transgens hinzu, um das Subklonen in Dietionsvektoren ihrer Wahl zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Einschränkungssequenzen nicht innerhalb der Sequenz selbst vorhanden sind.</li>
		<li>Für negative Kontrollen verwenden Sie 20-Nukleotid-Scrambled-Sequenzen, um die natürliche 20-Nukleotid-Sequenz jeder reifen miRNA zu ersetzen. Generieren Sie diese verschlüsselten Sequenzen mit einem Online-Tool wie https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Überprüfung der zweidimensionalen Struktur des Transgens
	<ol>
<li>Kopieren Sie die vollständige transgene Sequenz in das RNA-Strukturvorhersage-Softwareprogramm RNAweb Fold23.</li>
		<li>Klicken Sie unter Verwendung der Standardprogrammeinstellungen auf Fortfahren.</li>
		<li>Analysieren Sie die grafische Ausgabe, insbesondere für das Vorhandensein von gut definierten Haarnadeln und das Vorhandensein von doppelsträngigen Stammstrukturen mindestens 11 Nukleotide proximal zur Mikroprozessorspaltungsstelle. Achten Sie auch auf das Fehlen von Verzweigungspunkten innerhalb der Haarnadelsequenzen (Abbildung 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Erhalt von Transgenen durch DNA-Synthese
<ol><li>Nach dem Entwurf und in der Silico-Validierung des chimeric miRNA Clusters erhalten Sie die Arbeitssequenz mittels DNA-Synthese von kommerziellen Anbietern24 und gehen Sie mit nachgelagertem Klonen in Vektoren und Transgenabgabe fort. Wir haben lentivirale Vektoren für die In-vitro-Verabreichung10 und Adeno-assoziierte Viren (AAVs) für die intrakranielle In-vivo-Verabreichung25verwendet.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+integrative+analysis+implicates+miRNA+dysregulation+in+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder.</a> Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).</li>
<li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).</li>
<li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer%27s+Disease%3A+A+Meta-Analysis+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767(2018).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+deletions+and+down-regulation+of+micro-+RNA+genes+miR15+and+miR16+at+13q14+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciencesof+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).</li>
<li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+miRNA+dysregulation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).</li>
<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs%3A+tiny+regulators+with+great+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li>
<li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A miRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435, 828-833 (2005).</li>
<li>Santos, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124%2C+%E2%88%92128%2C+and+%E2%88%92137+orchestrate+neural+differentiation+by+acting+on+overlapping+gene+sets+containing+a+highly+connected+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network.</a> Stem Cells. 34, 220-232 (2016).</li>
<li>Bhaskaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+synergism+of+miRNA+clustering+provides+therapeutically+relevant+epigenetic+interference+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma.</a> Nature Communications. 10 (1), 442(2019).</li>
<li>Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+taxonomy+of+glioblastoma+defined+and+maintained+by+MiRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs.</a> Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).</li>
<li>Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA+Expression+Profiling+Using+Agilent+One-Color+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).</li>
<li>Silber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-124+and+miR-137+inhibit+proliferation+of+glioblastoma+multiforme+cells+and+induce+differentiation+of+brain+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells.</a> BMC Medicine. 6 (14), (2008).</li>
<li>Hester, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+factor+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+into+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).</li>
<li>Hsieh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-I+instructs+multipotent+adult+neural+progenitor+cells+to+become+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+miRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> eLife. 4, e05005(2015).</li>
<li>Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miRNA.org+resource%3A+targets+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The miRNA.org resource: targets and expression.</a> Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).</li>
<li>Wong, N., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRD%28B%29+an+online+resource+for+miRNA+target+prediction+and+functional+annotations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations.</a> Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).</li>
<li>Vlachos, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIANA-miRPath+v3.0%3A+deciphering+miRNA+function+with+experimental+support%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).</li>
<li>Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppGene+Suite+for+gene+list+enrichment+analysis+and+candidate+gene+prioritization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization.</a> Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembl+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ensembl 2017.</a> Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).</li>
<li>Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+from+miRNA+sequences+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: from miRNA sequences to function.</a> Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).</li>
<li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vienna+RNA+Package+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Vienna RNA Package 2.0.</a> Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).</li>
<li>Hughes, R. A., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+DNA+synthesis+and+assembly%3A+Putting+the+synthetic+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).</li>
<li>Crommentuijn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+AAV-sTRAIL+combined+with+lanatoside+C+prolongs+survival+in+an+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+invasive+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma.</a> Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).</li>
<li>Ivey, K. N., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNAs+as+regulators+of+differentiation+and+cell+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions.</a> Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+for+the+Recognition+of+Primary+miRNAs+by+the+Drosha-DGCR8+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex.</a> Cell. 125, 887-901 (2006).</li>
<li>Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-302-367+cluster+as+a+potential+stemness+regulator+in+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs.</a> Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).</li>
<li>Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+by+multiple+shRNAs+expressed+from+a+single+miRNA+polycistron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron.</a> Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).</li>
<li>Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Multiple+Artificial+MiRNAs+from+a+Chicken+miRNA126-Based+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).</li>
<li>Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Evaluation+of+An+Anti-HCV+miRNA+Cluster+for+Treatment+of+HCV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection.</a> Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Dieses Protokoll basiert auf der Vorstellung, dass miRNAs, anstatt isoliert zu funktionieren, biologisch relevant sind, indem sie in Gruppen arbeiten, und diese Gruppen werden transkriptionsweise durch spezifische zelluläre Kontexte bestimmt26. Um diesen Ansatz aus einer translationalen Perspektive zu rechtfertigen, wird ein Follow-up-Protokoll eingeführt, das die Nachbildung dieses Multi-miRNA-Musters in Zellen/Geweben ermöglicht. Dies ist möglich durch die relativ einfache Biogenese von miRNAs, ...

miRNAs bieten eine unübertroffene Möglichkeit für die Entwicklung eines breiten Gentherapie-Ansatzes für viele Krankheiten1,2,3, einschließlich Krebs4,5. Dies basiert auf mehreren einzigartigen Merkmalen dieser biologischen Moleküle, einschließlich ihrer kleinen Größe6, einfache Biogenese7, und natürliche Tendenz, in Assoziation zu funktionieren8. Viele Krankheiten sind durch spezifische miRNA-Expressionsmuster gekennzeichnet, die oft auf die Regulierung komplexer biologischer Funktionen konvergieren9. Der Zweck dieser Methode ist zunächst eine Strategie zu definieren, um Gruppen von miRNAs zu identifizieren, die synergistisch relevant für bestimmte zelluläre Funktionen sind. Folglich bietet sie eine Strategie für die Wiederherstellung solcher miRNA-Kombinationen in nachgelagerten Studien und Anwendungen.
Diese Methode ermöglicht die funktionelle Analyse mehrerer miRNAs auf einmal, indem sie ihre gleichzeitige Ausrichtung auf eine große Anzahl von mRNAs nutzt und so die komplexen Landschaften von Krankheiten rekapituliert. Dieser Ansatz wurde vor kurzem verwendet, um eine Gruppe von drei miRNAs zu definieren, die 1) gleichzeitig bei Hirntumor enregulierung sind und 2) ein starkes Ko-Expressionsmuster während der neuronalen Differenzierung sowie als Reaktion auf genotoxischen Stress durch Strahlung oder DNA-Alkylierungsmittel. Die kombinatorische Reexpression dieses Moduls von drei miRNAs durch die unten beschriebene Clustering-Methode führt zu tiefgreifenden Eingriffen in die Biologie von Krebszellen und kann leicht als Gentherapiestrategie für präklinische Studien verwendet werden10. Dieses Protokoll kann für diejenigen von besonderem Interesse sein, die an der miRNA-Forschung und ihren translationalen Anwendungen beteiligt sind.

<table><tbody><tr><td>0,4% niedrige Schmelztemperatur Agarose&nbsp;</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70058</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &Mikro; M Sterilfiltereinheit</td><td>Merck Millipore</td><td>SLH033RS</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Athyme Mäuse (FoxN1 nu/nu)</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflasche</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber, 16cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>Cäsium 137 Bestrahlungsgerät&nbsp;</td><td>JL Sheperd and Associates</td><td>Core Facility (Harvard Medical School)</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439142-4L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco s phosphatgepufferte Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Lösung&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Formalinlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Ergänzung&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1051750500</td><td></td></tr><tr><td>Humane primäre Gliom-Stammzellen (GBM62)</td><td></td><td></td><td>Zur Verfügung gestellt von Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Humane primäre Gliom-Stammzellen (MGG4)</td><td></td><td></td><td>Zur Verfügung gestellt von Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Lentiviraler Vektor pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td><td>System Biosciences</td><td>CD511B-1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge gekühlt</td><td>Eppendorf</td><td>Modell Nr. 5424 R, Kat.-Nr.5404000138</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4112APG</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat mit rundem Boden&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>Neuronale Vorläuferzellen (NPC)</td><td></td><td></td><td>Zur Verfügung gestellt von Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon eclipse Ti motorisiertes Fluoreszenzmikroskopsystem</td><td>Nikon, Japan</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhren&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6571-960EA</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 94/16&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes EGF&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante humane FGF-basisch&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Gibco</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA Miniprep Kit</td><td>Direct-zol</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Thermocycler&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Kleintier-Mikrobestrahlung&nbsp;</td><td>Xstrahal Life Sciences, Großbritannien</td><td>Haupteinrichtung (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX+ Ultrazentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75000100</tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Echtzeit-PCR-System</td><td>für angewandte Biosysteme&nbsp;</td><td></td><td></td>4376357</tr><tr><td>SterilGARD Biosicherheitswerkbank</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>T98-G</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transkriptionskit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 4366596</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Temozolomid</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek optimale Schnitttemperatur&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9636948</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol-Reagenz&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Lysereagenz</td></tr><tr><td>U251-MG</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>U87-MG&nbsp;</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>ViraPower Lentivector Expressionssystem&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K4970-00</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, HPLC-Qualität</td><td>Fisher</td><td>W54</td><td></td></tr><tr><td>Xylol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung von funktional assoziierten mirnas in glioblastom und deren engineering in künstliche cluster für die gentherapie

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

Die biologische Relevanz von microRNAs (miRNAs) in Gesundheit und Krankheit hängt signifikant von spezifischen Kombinationen vieler gleichzeitig deregulierter miRNAs ab und nicht von der Wirkung einer einzelnen miRNA. Die Charakterisierung dieser spezifischen miRNAs-Module ist ein grundlegender Schritt zur Maximierung ihrer Anwendung in der Therapie. Dies ist äußerst relevant, da ihre kombinatorischen Eigenschaften praktisch ausgenutzt werden können. Hier wird eine Methode beschrieben, um eine spezifische miRNA-Signatur zu definieren, die für die Kontrolle von onkogenen Chromatin-Repressoren bei Glioblastom relevant ist. Der Ansatz definiert zunächst eine allgemeine Gruppe von miRNAs, die bei Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe dereguliert werden. Die Analyse wird durch differenzielle Kulturbedingungen weiter verfeinert, was eine Untergruppe von miRNAs unterstreicht, die gleichzeitig während bestimmter Zellzustände mitexprimiert werden. Schließlich werden die miRNAs, die diese Filter zufriedenstellen, zu einem künstlichen polycistronischen Transgenes kombiniert, das auf einem Gerüst natürlich vorhandener miRNA-Clustergene basiert und dann zur Überexpression dieser miRNA-Module in empfangende Zellen verwendet wird.

Diese Methode ermöglichte die Charakterisierung eines Moduls von drei miRNAs, die bei Hirntumoren konsequent downreguliert werden, die speziell während der neuronalen Differenzierung koexprimiert werden (Abbildung 1) und an der Tumorüberlebensreaktion nach Therapie (Abbildung 2). Dies wird durch die Regulierung eines komplexen onkogenen Chromatin-Repressionswegs erreicht. Dieses Co-Expressions-Muster deutete auf eine starke syner...

Hier wird ein Protokoll zur Charakterisierung von Modulen biologisch synergistischer miRNAs und deren Montage in kurze Transgene beschrieben, das eine gleichzeitige Überexpression für Gentherapieanwendungen ermöglicht.

Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs in Glioblastom und deren Engineering in künstliche Cluster für die Gentherapie

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Modulation vieler Mikro-RNAs in eukaryotischen Zellen und basiert auf einer sehr einfachen und flexiblen Methode, die molekulare Klonschritte minimiert. Diese Technik hat Auswirkungen auf die Untersuchung von Mikro-RNA-Funktionsinteraktionen in vitro, aber noch wichtiger ist, dass sie eine Plattform für einen effektiveren Einsatz von Mikro-RNAs in der Therapie bietet. Wir haben es hauptsächlich im Zusammenhang mit Hirntumor entwickelt und verwendet, aber es gilt für alle Krankheiten, bei denen mehrere Veränderungen der Genexpression beteiligt sind.Wir haben unsere künstlichen Transgene in anderen Modellen wie Brust- und Schilddrüsenkrebslinien getestet, die die Reproduzierbarkeit dieser Technik zeigen. Grundkenntnisse der Bioinformatik und Mikro-RNA-Biologie sind für dieses Protokoll hilfreich, aber nicht unentbehrlich. Ein bioinformatischer Ansatz ist wichtig, um relevante Mikro-RNA-Kombinationen und die TRK-11 zu definieren, während die Vertrautheit mit der Mikro-RNA-Verarbeitung messbar wichtig ist, um zu verstehen, wie diese verschiedenen Mikro-RNAs zu künstlichen DNA-Clustern zusammengesetzt werden können, die erfolgreich verarbeit

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Research

Forschung

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Genetics

Genetik

Hier beschreiben wir ein effizientes und vielseitiges Protokoll zur Induktion, Überwachung und Analyse neuartiger Glioblastome (GBM) unter Verwendung von Transposon-DNA, die in die Ventrikel von neugeborenen Mäusen injiziert wird. Zellen der subventrikulären Zone, die das Plasmid aufnehmen, transformieren, vermehren und Tumore mit histopathologischen Merkmalen des menschlichen GBM erzeugen.

Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in die Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen zu Novel Modelle von Glioblastoma generieren

MicroRNAs spielen eine entscheidende Rolle im Gehirn und sind potenzielle Ziele für die Modellierung der Neurodegeneration. Die Störung des miRNA-Spiegels ist jedoch aufgrund der kurzen Länge der miRNA und der Unzugänglichkeit des Hirngewebes eine Herausforderung. Dieses Video stellt eine Methode für das Antagomir-Design und die gehirnspezifische Verabreichung unter Verwendung eines Neuropeptids bei Mäusen vor.

Eine einfache Alternative zur stereotaktische Injektion für Hirnspezifische Knockdown von miRNA

Neurosphären als 3D Kulturen angebaut sind ein mächtiges Werkzeug um Gliom Biologie zu studieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Immunohistochemistry durchführen unter Beibehaltung der 3D-Struktur von Gliom Neurospheres durch Paraffin einbetten. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung von Gliom Neurosphäre Eigenschaften wie Stemness und neuronale Differenzierung.

Bewertung von Biomarkern in Gliom von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten 3D Gliom Neurosphäre Kulturen

MiRNA-Therapeutika haben erhebliches Potenzial bei der Regulierung der Tumorprogression. Hier demonstriert werden analytische Ansätze zur Identifikation der Aktivität einer kombinatorischen MiRNA-Behandlung in der Eindämmung des Zellzyklus und Angiogenese verwendet.

Analyse der kombinatorischen MiRNA Behandlungen zur Regulierung des Zellzyklus und Angiogenese

Dieses Protokoll verwendet eine sondenbasierte Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einen Sulforhodamin-B-Assay (SRB), 3' unübersetztes Klonen (3' UTR) und einen Luziferase-Assay, um die Zielgene einer miRNA von Interesse zu verifizieren und die Funktionen von miRNAs zu verstehen.

Ein In-Vitro-Protokoll zur Bewertung von MicroRNA-Spiegeln, -Funktionen und assoziierten Zielgenen in Tumorzellen

Lasermikrodissektion (LMD) ist eine empfindliche und hochreproduzierbare Technik, die verwendet werden kann, um Wege aufzudecken, die Gliomheterogenität und Invasion vermitteln. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Isolierung diskreter Bereiche aus Gliomgewebe mittels Laser LMD, gefolgt von transkriptomischer Analyse.

Lasercapture Mikrodissektion von Glioma Subregionen für räumliche und molekulare Charakterisierung der intratumoralen Heterogenität, Oncostreams und Invasion

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Cluster-Clustered-Regular-Interspaced-Short-Palindromic-Repeats-Gen-Editing-Workflow für die microRNA-Cluster-Netzwerkanalyse, der die schnelle Generierung eines Panels genetisch veränderter Zelllinien mit einzigartigen miRNA-Cluster-Deletionskombinationen von bis zu 35 kb innerhalb eines einzigen Experiments ermöglicht.

CRISPR-Gen-Editing-Tool für die MicroRNA-Cluster-Netzwerkanalyse

Die Blut-Hirn-Schranke ist eine große Hürde bei der Bereitstellung von Therapien für das Glioblastom, eine Krankheit, für die es keine Heilung gibt. Hier berichten wir über eine in vivo bildgesteuerte therapeutische Nanoplattform für Eisenoxid, die diese physiologische Barriere aufgrund ihrer Größe umgehen und sich im Tumor anreichern kann.

Nanopartikel-Verabreichung einer Oligonukleotid-Nutzlast in einem Glioblastom-Multiforme-Tiermodell

Das Protokoll beschreibt einen Tandem-Immunfluoreszenz-Hybridisierungsassay mit formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zum gleichzeitigen Nachweis und zur Quantifizierung von microRNA und Multiplexproteinen.

MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

Wir berichten hier über Methoden zur molekulargenetischen Manipulation des Yarrowia lipolytica Po1g-Stammes zur Verbesserung der Gendeletionseffizienz. Die daraus resultierenden gentechnisch veränderten Y. lipolytica-Stämme haben potenzielle Anwendungen in der Biokraftstoff- und biochemischen Produktion.

Genetic Engineering eines Unconventional Hefe für Erneuerbare Biokraftstoff- und Biochemie Produktion

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Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs in Glioblastom und deren Engineering in künstliche Cluster für die Gentherapie (Video) | JoVE Journal

Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs in Glioblastom und deren Engineering in künstliche Cluster für die Gentherapie

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