Name: Analyse des hämatopoetischen Stamm-Vorläufer-Zellstoffwechsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Erfahren Sie die optimierte Messung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse in hämatopoetischen Stamm-Vorläuferzellen aus murinem Knochenmark. Diese Methode verbessert die Zellviabilität und ermöglicht präzise metabolische Analysen.

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Diese Arbeit wird zum Teil durch die finanzielle Unterstützung der National Institutes of Health (HL131645, CA016058), der St. Baldrick es Foundation und der Pelotonia Foundation unterstützt.

Dieses Protokoll wurde vom Nationwide Children es Hospital Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
HINWEIS: Das Protokoll wird in chronologischer Reihenfolge beschrieben, die sich über einen Zeitraum von zwei Tagen erstreckt. Verwenden Sie frische Reagenzien, wie im folgenden Protokoll beschrieben.
1. Herstellung von Reagenzien am Tag vor dem Assay
<ol><li>
Hydratisieren Sie die Sensorpatrone.
	<ol>
<li>Inkubieren Sie 5 ml des Kalibranten (Materialtabelle) in einem Nicht-CO2 37 °C Inkubator über Nacht.</li>
		<li>Öffnen Sie das Fluss-Assay-Kit (Materialtabelle) und trennen Sie die Sensorpatrone (grün; oben) von der Nutzplatte (transparent; unten). Stellen Sie als Nächstes die Sensorpatrone auf den Kopf und neben der Versorgungsplatte.</li>
		<li>Füllen Sie mit sterilem Wasser die Brunnen der Versorgungsplatte (200 l) und die Kammern um die Brunnen (400 l).</li>
		<li>Tauchen Sie die Sensorpatrone in die Netzteilplatte ein, um sicherzustellen, dass die Sensoren vollständig mit Wasser bedeckt sind. Tippen Sie auf 3x, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.</li>
		<li>Legen Sie die Patrone über Nacht in einen Nicht-CO2 37 °C-Inkubator ein. Um eine Verdunstung des Wassers zu verhindern, stellen Sie sicher, dass der Inkubator ordnungsgemäß befeuchtet ist. Legen Sie einen offenen Becher mit H2O als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme neben die Patronen-Utility-Platte, insbesondere bei Verwendung eines normalen Ofens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie die Assay-Platte vor.
	<ol>
<li>Sterilisieren Sie die Oberfläche des Biosicherheitsschranks Klasse 2 mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die Assayplatte unter der Haube.</li>
		<li>Fügen Sie 40 l der handelsüblichen 0,01% (w/v) Poly-L-Lysin (PLL) Lösung zu jedem Brunnen der Assayplatte unter der Haube hinzu.</li>
		<li>Bedecken Sie die Assayplatte mit dem im Kit enthaltenen Deckel. Inkubieren Sie die geschlossene Assayplatte bei Raumtemperatur (RT) unter der Haube für 1 h. HINWEIS: Das Ziel der Inkubation ist es, PLL die Oberfläche der Assayplatte beschichten zu lassen, um die Haftung von Suspensionszellen an der Oberfläche der Assayplatte zu erleichtern.</li>
		<li>Nach 1 h Inkubation der Assayplatte die überschüssige Lösung mit einem sterilen Vakuum-Sauger entfernen und den Brunnen unter der Haube an der Luft trocknen. HINWEIS: Es dauert 30 bis 60 min, um die Brunnen der Assayplatte nach der übermäßigen PLL-Entfernung mit dem Aspirator lufttrocken zu trocknen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tag des Assays
<ol><li>Bereiten Sie die Patrone vor.
	<ol>
<li>Heben Sie die Sensorpatrone an. Legen Sie es auf den Kopf in die Gewebekulturhaube und entsorgen Sie das Wasser von der Nutzplatte.</li>
		<li>Füllen Sie die Nutzplattenbrunnen mit 200 l des vorgewärmten Kalibrants.</li>
		<li>Füllen Sie die Kammern um die Brunnen mit 400 l des Kalibranten.</li>
		<li>Tauchen Sie die Sensorpatrone in die Nutzplatte ein, um sicherzustellen, dass die Sensoren vollständig vom Kalibrant abgedeckt sind. Tippen Sie auf 3x, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.</li>
		<li>Equilibrate die Sensorpatrone in der Versorgungsplatte in einem Nicht-CO2 37 °C Inkubator für 45-60 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Ernte murinen Knochenmark abgeleiteten LSK HSPCs.
	<ol>
<li>Um ausreichende biologische Replikationen aufzunehmen, planen Sie die Verwendung von HSPCs, die von einer Maus pro Bohrung der Assayplatte abgeleitet wurden. HINWEIS: Diese Knochenmark-Erntemethode bietet von jeder Maus 50.000 bis 80.000 LSK-HSPCs. Dieses Protokoll zur Messung des extrazellulären Flusses ist für 70.000 LSK HSPCs pro Bohrung einer 96-Well-Platte optimiert.</li>
		<li>Euthanisieren Sie Mäuse mitCO2-Überdosierung und Zervixdislokation nach lokalen IACUC-zugelassenen Methoden.</li>
		<li>Sterilisieren Sie die Oberfläche von Sezieren von Werkzeugen und die Bank mit 70% Ethanol.</li>
		<li>Für jede Maus eine Petrischale mit 1x phosphatgepufferter Saline (PBS) vorfüllen, die 2% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS) bei RT enthält. HINWEIS: Verwenden Sie keine vorgekühlten PBS, da in den folgenden Schritten Klumpen entstehen.</li>
		<li>Sprühen Sie 70% Ethanol (v/v) auf die gesamte eingeschläferte Maus. Isolieren Sie alle Knochen, einschließlich der oberen und unteren Gliedmaßen, Hüftknochen, Brustbein, Rippenkäfig und Wirbelsäule, von der Maus17,18. Ziehen Sie weiße Materie aus dem Rückenmark der Maus, da sie LSK-Zellen kontaminieren kann. Legen Sie alle Knochen in 1x PBS (+ 2% FBS), wie sie gesammelt werden, in eine Petrischale bis zur weiteren Verwendung.</li>
		<li>Invertieren Sie ein 50 ml kegelförmiges Rohr (jedes Mal neu) und verwenden Sie es, um Knochen, die in 1x PBS (+ 2% FBS) in der Petrischale getaucht sind, zu trituieren.</li>
		<li>Mit einer 10 ml serologischen Pipette, Pipette nach oben und unten (ca. 10x) gleichmäßig ausspülen Zellen aus Knochen, nach dem Zerkleinern der Knochen.</li>
		<li>Legen Sie ein 40 m Zellsieb auf ein 50 ml konisches Rohr. Vorbefeuchten der Oberfläche des Siebs durch Durchgang 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS).</li>
		<li>Ernteknochenmark-abgeleitete Zellsuspension aus Schritt 2.2.7 und passieren Sie es durch die vornasse Oberfläche des Zellsiebs, um Knochenablagerungen zu entfernen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6 bis 2.2.9, bis alle Knochenmaterialien weiß werden, als Marker dafür, dass die meisten Knochenmarkzellen in der 50 ml konischen Röhre gesammelt werden. HINWEIS: Es dauert oft zwei 50 ml konische Röhren pro Maus, um alle Knochenmark-abgeleiteten Zellen zu sammeln.</li>
		<li>Zentrifuge 50 ml konische Röhren mit Knochenmark-abgeleiteten Zellen für 5 min bei 500 x g und RT.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand. Aussetzen von Knochenmark-abgeleiteten Zellen (Kombinationsgehalte beider 50 ml-Röhren) in 5 ml 1x PBS (+ 2% FBS) als Endvolumen und Halten sie die Zellen bei RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Ernte mononukleierte murinierte Knochenmarkzellen.
	<ol>
<li>Fügen Sie 5 ml Dichtegradientenmedium (d. h. Ficoll) zu einem 15 ml konischen Rohr hinzu. Dann langsam 5 ml der Knochenmarkzellsuspension hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass Zellen als Schicht über dem Dichtegradientenmedium verbleiben.</li>
		<li>Zentrifuge für 30 min bei 500 x g und RT. Verwenden Sie keine Bremse in der Zentrifuge. Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge bei der geringstmöglichen Beschleunigung ist (z. B. 1 Beschleunigung und 0 Verzögerung).</li>
		<li>Ernten Sie die mittlere Schnittstelle von mononukleierten Zellen (weiße Farbe) nach Zentrifugation in ein frisches 15 ml konisches Rohr.</li>
		<li>Waschzellen, geerntet aus Dichtegradientenmedium, mit 5 ml 1x PBS (+ 2% FBS). Zentrifuge für 5 min bei 500 x g und 4 °C. Entfernen Sie den Überstand.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.3.4.</li>
		<li>Den Zellinhalt des Rohres in 300 l 1x PBS (+ 2% FBS) wieder aufsetzen. Aliquot 10 l Zellsuspension zur ungefärbten oder einfarbigen Kontrolle in einem FACS-Rohr.</li>
	</ol></li>
	<li>Ernte LSK HSPCs aus mononukleierten murinen Knochenmarkzellen.
	<ol>
<li>Machen Sie einen Cocktail aus Biotin-Antikörpern, indem Sie 3 l pro Probe der folgenden Antikörper mischen: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Fügen Sie 15 L des Biotin-Antikörper-Cocktails zu 300 l mononukleierten Knochenmarkzellen hinzu. HINWEIS: Jeder Antikörper wird bei 1:100 Verdünnung verwendet.</li>
		<li>Inkubieren Sie Zellen mit dem Biotin-Antikörper-Cocktail für 30 min bei 4 °C mit Agitation, um zu vermeiden, dass Zellen im Boden des Rohres verklumpen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 ml vorgekühlten 1x PBS (+ 2% FBS) zu Zellen hinzu, die mit dem Biotin-Antikörper-Cocktail gemischt werden.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Rohr für 5 min bei 500 x g und 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 400 l 1x PBS (+ 2% FBS) wieder auf. Aliquot 10 l für streptavidin-single Farbregelung.</li>
		<li>Kurz Wirbel Anti-Biotin Mikroperlen (Tabelle der Materialien) vor der Verwendung. Fügen Sie jeder Zellprobe 80 L Mikroperlen hinzu (von 400 l). Gut mischen und für weitere 20 min bei 4 °C mit Rührung inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 10 ml vorgekühlten 1x PBS (+ 2% FBS) zu den Zellen hinzu. Zentrifugieren Sie das Rohr für 5 min bei 500 x g und 4 °C.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS) wieder auf. Bei 4 °C lagern, während Sie eine magnetische Trenneinheit einrichten.</li>
		<li>Platzieren Sie eine Säule (Materialtabelle) im Magnetfeld des magnetischen zellsortierbaren Trennzeichens (MACS) bei 4 °C. Bereiten Sie die Säule für die magnetische Trennung vor, indem Sie sie mit 3 ml 1x 1x PBS (+ 2% FBS) unter dem Schwerkraftstrom bei 4 °C spülen.</li>
		<li>Fügen Sie die Zellsuspension ab Schritt 2.4.7 bei 4 °C in die vornasse Säule ein. Lassen Sie die Zellen die Säule bei 4 °C passieren und sammeln Sie Abwässer in einem 15 ml konischen Rohr. HINWEIS: Der Anteil mit nicht beschrifteten Zellen in solchen Abwässern stellt die angereicherten Liniennegativen Zellen dar.</li>
		<li>Waschsäule mit 3 ml 1x PBS (+ 2% FBS) bei 4 °C. Wiederholen Sie 3x. Sammeln Sie den Durchfluss und halten Sie ihn bei 4 °C. Zählen Sie die eluierten lebensfähigen Zellen durch Trypan-Blau-Ausschluss mit einem Hämozytometer.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das 15 ml konische Rohr, das den Durchfluss für 5 min bei 500 x g und 4 °C enthält. Entsorgen Sie den Überstand. Zellen in 0,5 ml 1x PBS (+ 2% FBS) wieder aussetzen und den Inhalt in ein FACS-Rohr übertragen.</li>
		<li>Fügen Sie je 107 Zellen 24 L des LSK-Antikörpercocktails hinzu. Der Antikörper-Cocktail enthält eine gleiche Konzentration von 450-Streptavidin-Antikörpern, PE-CY7-Sca1-Antikörpern und APC-c-Kit-Antikörpern.</li>
		<li>1 h bei 4 °C mit Erregung unter Dunkel (mit Zinnfolie überzogen) inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 3 ml 1x PBS (+ 2% FBS) in das FACS-Rohr. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g und 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>A-Antikörper-markierte Zellen in 1 ml 1x PBS (+ 2% FBS) wieder aufsetzen. Fügen Sie kurz vor der Sortierung 1 l von 1 mg/ml Propidiumjodid in die Zellsuspension ein.</li>
		<li>Filtern Sie den Inhalt des FACS-Rohrs mit einem 40-mm-Sieb direkt vor dem Sortieren von LSK-Zellen.</li>
		<li>Sammeln Sie LSK-Zellen über FACS-Sortierung in 1,5 ml-Rohr mit 0,5 ml komplettem Medium, ergänzt durch 2 mM Glutamin, 3 mg/ml Glukose, 1 mM Pyruvat, 1x Thrombopoietin (TPO), 1x Stammzellfaktor (SCF), 0,5x Penicillin/Streptomycin (P/S), pH 7,4 (Tabelle 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Mitochondriale Atmung und Glykolyse Assays von LSK HSPCs
<ol><li>
LSK-Saat in der Assayplatte
	<ol>
<li>Zentrifuge LSK-Zellen ab Schritt 2.4.17 für 5 min bei 500 x g und RT. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Resuspend Zellen in vollständigen Medien auf eine Endkonzentration von mindestens 70.000 Zellen/40 l.</li>
		<li>Saatgutgehalt von 40 L-Medien (mit 70.000 Zellen) in der PLL-beschichteten 8-Well-Platte ab Schritt 1.2.4. Lassen Sie alle Eckbrunnen leer.</li>
		<li>Zentrifuge für 1 min bei 450 x g und RT. Tragen Sie die Bremse nicht an. Stellen Sie sicher, dass Zellen mit dem invertierten Mikroskop am Brunnenboden befestigt sind.</li>
		<li>Fügen Sie den Zellen in jedem Brunnen 135 L komplette Medien für ein Endvolumen von 175 l hinzu. Fügen Sie den 2 Ecken der Platte als Rohlinge 175 L kompletter Medien hinzu.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen im Nicht-CO2-Inkubator für 2 h bei 37 °C.</li>
		<li>Richten Sie ein Programm ein, um jedem Brunnen der Brunnenplatte im Analysator Medikamente hinzuzufügen, wobei eine Metrik verwendet wird, die in Tabelle 2 (mitochondrialer Stresstest) und Tabelle 3 (Glykolyse-Stresstest) beschrieben ist. HINWEIS: Während Zellen inkubieren, schalten Sie das Gerät ein und stellen Sie sicher, dass es bei 37 °C ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mitochondrialer Stresstest
	<ol>
<li>Bereiten Sie 45 M Bestandslösungen von Oligomycin, 50 M Carbonylcyanid 4-(Trifluromethoxy)phenylhydraon (FCCP) und 25 M Bestandslösungen von Roton/Antimycin A vor. Um die 45-M-Oligomycin-Stammlösung vorzubereiten, lösen Sie den Inhalt des handelsüblichen Beutels in 280 l des gesamten Mediums auf. Um die 50-M-FCCP-Lagerlösung vorzubereiten, lösen Sie den Inhalt des handelsüblichen Beutels in 288 l des gesamten Mediums auf. Um 25 'M Roton/Antimycin A Stofflösung vorzubereiten, lösen Sie den Inhalt des handelsüblichen Beutels in 216 l des gesamten Mediums auf.</li>
		<li>Nehmen Sie die Sensorpatrone in der Versorgungsplatte aus dem Inkubator und laden Sie ihre Anschlüsse (A, B und C) so, dass jeder Brunnen eine Endkonzentration von 2 M Oligomycin, 1,5 M FCCP und 0,5 M Roton/Antimycin A nach Bedarf gemäß den in Tabelle 4 beschriebenen Verdünnungsmetriken (für die Sauerstoffverbrauchsrate) haben würde.</li>
		<li>Entfernen Sie den Deckel von der sensorischen Patrone, die in der Gebrauchsplatte montiert ist, und legen Sie ihn auf das Instrumentenfach. Starten Sie die Kalibrierung, die 20 min dauert.</li>
		<li>Entfernen Sie nach der Kalibrierung die Versorgungsplatte und ersetzen Sie sie durch eine Assayplatte, die LSK-Zellen enthält, die nun an der Unterseite des Brunnens haften.</li>
		<li>Drücken Sie Weiter, um das in Tabelle 2beschriebene Programm zu starten. Rufen Sie nach Abschluss des Programms die Daten ab und analysieren Sie sie mit der Wave Desktop-Software. HINWEIS: Die aus den extrazellulären Flussversuchen generierten Daten können mit dem Punktdiagramm aus der Wave Desktop-Software geplottet oder in ein webbasiertes Statistikprogramm exportiert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Glycolyse-Stresstest
	<ol>
<li>Rekonstituieren Sie Glukose in 300 l (100 mM), Oligomycin in 288 l (50 m), 2-D-Glukose (2-DG) in 300 l (500 mM) Komplettmedium aus dem handelsüblichen Beutel.</li>
		<li>Sanfte Pipette nach oben und unten (ca. 10x), um die Verbindungen zu löslich. Vortex die 2-DG für ca. 1 min, um eine ordnungsgemäße Auflösung in Medien zu gewährleisten.</li>
		<li>Entfernen Sie die Sensorpatrone aus dem Inkubator. Lastanschlüsse A bis C nach in Tabelle 5 beschriebenen Verdünnungsmetriken, um eine Endkonzentration von 10 mM Glukose, 2 M Oligomycin und 50 mM 2-DG zu erhalten.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.2.3 und 3.2.4.</li>
		<li>Drücken Sie Weiter, um das in Tabelle 3beschriebene Programm zu starten. Rufen Sie nach Abschluss des Programms die Daten ab und analysieren Sie sie mit der Wave Desktop-Software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dharampuriya, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+origin%2C+development%2C+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).</li>
<li>Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+diet%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell diet.</a> International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).</li>
<li>Kohli, L., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+change%3A+the+metabolic+journey+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells.</a> Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).</li>
<li>Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+the+leukemic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolism and the leukemic stem cell.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communication. 7, 13125(2016).</li>
<li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+essential+for+haematopoietic+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function.</a> Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).</li>
<li>Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+Mitochondria%2C+Metabolism%2C+and+Stem+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate.</a> Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).</li>
<li>Maryanovich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MTCH2+pathway+repressing+mitochondria+metabolism+regulates+haematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate.</a> Nature Communication. 6, 7901(2015).</li>
<li>Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+hematopoietic+stem+cells+in+the+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).</li>
<li>Zhang, C. C., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+metabolic+properties+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).</li>
<li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Jung, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+regulate+mesenchymal+stromal+cell+induction+into+osteoblasts+thereby+participating+in+the+formation+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche.</a> Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).</li>
<li>Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-less+maintenance+of+HSCs+by+2i%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Niche-less maintenance of HSCs by 2i.</a> Cell Research. 23, 458-459 (2013).</li>
<li>Anderson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+develop+in+the+absence+of+endothelial+cadherin+5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression.</a> Blood. 126, 2811-2820 (2015).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).</li>
<li>Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+basic+metabolic+pathways+in+microbial+sepsis%3A+therapeutic+targets+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last.</a> EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+and+Metabolic+Flexibility%3A+Illuminating+a+Path+Toward+Selective+Cancer+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).</li>
<li>Halestrap, A. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monocarboxylate+transporter+family--role+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The monocarboxylate transporter family--role and regulation.</a> IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).</li>
<li>Kim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+Cancer+Energy+Metabolism%3A+Culprits+or+Bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders.</a> Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).</li>
<li>Fosslien, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+medicine--molecular+pathology+of+defective+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+%26+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation.</a> Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).</li>
<li>Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+primary+metabolic+block+produced+by+2-deoxyglucose%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose.</a> The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).</li>
<li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of the ATP synthetase systems.</a> Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).</li>
<li>Rimmele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+in+hematopoietic+stem+cells+requires+functional+FOXO3%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3.</a> EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).</li>
<li>Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+engineering+at+a+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads.</a> Blood. 119, 1107-1116 (2012).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier zeigen wir die Isolierung einer maximalen Menge an reiner und lebensfähiger muriner LSK HSPCs Population sowie die Messung ihrer Glykolyse und mitochondrialen Atmung mit einem extrazellulären Flussanalysator. Insbesondere überwindet das Protokoll die folgenden technischen Probleme für die Verwendung von LSK HSPCs: i) die niedrige Frequenz von LSK HSPCs im murinen Knochenmark14, ii) niedrige basale metabolische Aktivität von LSK HSPCs26, iii) die Fragilität von LSK HSPC...

Da die Lebensdauer der meisten reifen Blutkörperchen kurz ist, beruht die Homöostase des Blutes auf der Selbsterneuerung und Differenzierung einer langlebigen, aber seltenen Population hämatopoetischer Stammzellen (HSPCs)1. HSPCs sind still, aber sie sind schnell zu vermehren und unterziehen Differenzierung auf Stimulation, um die Anforderungen des Blutsystems zu erhalten. Da jeder HSPC-Zellzustand eine einzigartige bioenergetische Nachfrage erfordert, sind die metabolischen Veränderungen die wichtigsten Treiber von HSPC-Schicksalsentscheidungen. Daher führt der Verlust der metabolischen Plastizität, indem das Gleichgewicht zwischen Ruhe, Selbsterneuerung und Differenzierung von HSPCs verändert wird, oft zu myelo- oder lympho-proliferativen Störungen. Zusammen ist das Verständnis der metabolischen Regulation der HSPC-Entwicklung entscheidend, um Mechanismen aufzudecken, die hämatologischen Malignitäten2,3,4,5zugrunde liegen.
Mitochondriale Atmung und Glykolyse erzeugen ATP, um intrazelluläre Reaktionen anzutreiben und die für die Makromolekülsynthese notwendigen Bausteine zu produzieren. Da HSPCs im Vergleich zu differenzierten Zellen6 eine niedrige mitochondriale Masse haben und in hypoxischen Knochenmarknischen Ruhe halten, setzen HSPCs in erster Linie auf Glykolyse. Die Aktivierung von HSPCs verbessert ihren mitochondrialen Stoffwechsel, der zum Verlust der Ruhe und ihrem anschließenden Eintritt in den Zellzyklus führt. Eine solche metabolische Plastizität von HSPCs ermöglicht die Aufrechterhaltung des HSPC-Pools während des gesamten Erwachsenenlebens6,7,8,9,10,11,12. Daher ist es wichtig, ihre metabolischen Aktivitäten zu untersuchen, wie die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR; Index der oxidativen Phosphorylierung) und die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR; Index der Glykolyse), um die HSPC-Aktivierung und den Gesundheitszustand zu analysieren. Sowohl die OCR als auch die ECAR können gleichzeitig in Echtzeit mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen werden. Die aktuelle Methode erfordert jedoch eine große Anzahl von Zellen und ist für anhimierende Zellen13optimiert. Da HSPCs nicht in großen Mengen von Mäusen isoliert werden können14, eine Sortierung erfordern, um eine reine Population zu erhalten, sind nicht-anhantibe Zellen15, und kann nicht über Nacht kultiviert werden, ohne Differenzierung zu vermeiden16, war es schwierig, die OCR und die ECAR von HSPCs zu messen. Hier bieten wir eine Reihe klarer, Schritt-für-Schritt-Anleitungen, um videobasierte Tutorials zu begleiten, wie man metabolische Atmung und Glykolyse von einigen tausend murinen Knochenmark-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs misst.

<table><tbody><tr><td>0,01 % (w/v) Poly-L-Lysin-Lösung</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td>Verwendet für LSK-Aufsatz</td></tr><tr><td>40 & Mikro; m Zellsieb</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>Wird für die Zellfiltration nach Knochenzerkleinerung</td></tr><tr><td>verwendet Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td>Wird für die Lin-Trennung</td></tr><tr><td>verwendet Biotin Ratte Anti-Maus CD45R/B220 Klon RA3-6B2</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td>Verwendet für die Lin-Trennung</td></tr><tr><td>Biotin Ratte Anti-Maus CD5 Klon 53-7.3</td><td>BD Biosciences</td><td>553019</td><td>Verwendet für Lin- Trennung</td></tr><tr><td>Biotin Ratte Anti-Maus CD8a Klon 53-6.7</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td>Wird für die Lin-Trennung</td></tr><tr><td>verwendet Biotin Ratte Anti-Maus Ly-6G und Ly-6C Klon RB6-8C5</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>wird für die Lin-Trennung</td></tr><tr><td>verwendet Biotin Ratte Anti-Maus TER-119/Erythroide Zellen Klon TER-119</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>wird für die Lin-Trennung</td></tr><tr><td>verwendet CD117 (c-Kit) Monoklonaler Antikörper (2B8), APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>Wird für die LSK-Sortierung verwendet</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Wird in der Zellisolierung verwendet</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Wird in der Zellisolierung verwendet</td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen aus Polypropylen mit rundem Boden</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-11A</td><td>Verwendet für LSK-Sortierung</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Neuromics</td><td>FBS001-HI</td><td>Wird in FACS-Puffer</td></tr><tr><td>verwendet Histopaque-1083</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td>Wird für die Ficoll-Gradiententrennung</td></tr><tr><td>verwendet L-Glutamin 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>Wird für das Assay-Medium</td></tr><tr><td>verwendet LS Säule</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Wird für die Lin-Trennung</td></tr><tr><td>verwendet Ly-6A/E (Sca-1) Monoklonal Antikörper (D7), PE-Cyanin7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-82</td><td>Wird für die LSK-Sortierung</td></tr> des <tr><td>murinen Stammzellfaktors (SCF)</td> <td>verwendetPeproTech</td><td>250-03-100UG</td><td>Wird für das Assay-Medium</td></tr><tr><td>Murine Thrombopoietin (TPO)</td> <td>verwendetPeproTech</td><td>315-14-100UG</td><td>Wird für das Assay-Medium</td></tr><tr><td>PBS verwendet 1%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>Wird für FACS-Puffer</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin ( 10.000 U/ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Wird für das Assay-Medium</td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>verwendet Fisher</td><td>Scientific P1304MP</td><td>Wird für die LSK-Sortierung</td></tr><tr><td>verwendet Seahorse XFp Zellkultur-Miniplate</td><td>Agilent Technologies</td><td>103025-100</td><td>Wird für die LSK-Aussaat</td></tr><tr><td>verwendet Natriumpyruvat (100 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11360070</td><td>Wird für das Assay-Medium</td></tr><tr><td>Streptavidin eFluor 450 verwendet Konjugat</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td>Wird für die LSK-Sortierung</td></tr><tr><td>verwendet XF Calibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>100840-000</td><td>Wird für die Kartuschenäquilibrierung</td></tr><tr><td>verwendet XF-Medien</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>Wird für die Assay-Medien</td></tr><tr><td>XFp Glykolyse-Stresstest-Kit</td><td>verwendet Agilent Technologies</td><td>103017100</td><td>Medikamente für Glykolyse-Stresstest</td></tr><tr><td>XFp Mitochondrial Stresstest-Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>103010100</td><td>Medikamente für den mitochondrialen Stresstest</td></tr><tr><td>XFp-Sensorkartusche</td><td>Agilent Technologies</td><td>103022-100</td><td>Wird für die Glykolyse und den mitochondrialen Stresstest</td></tr></tbody></table> verwendet

analyse des hämatopoetischen stamm-vorläufer-zellstoffwechsels

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) haben eine ausgeprägte metabolische Plastizität, die es ihnen ermöglicht, von ihrem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand überzugehen, um die Anforderungen der Blutbildung aufrechtzuerhalten. Allerdings war es schwierig, den metabolischen Zustand (mitochondriale Atmung und Glykolyse) von HSPCs aufgrund ihrer begrenzten Anzahl und des Fehlens optimierter Protokolle für nicht-haftige, zerbrechliche HSPCs zu analysieren. Hier stellen wir eine Reihe klarer, Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Messung der metabolischen Atmung (Sauerstoffverbrauchsrate; OCR) und Glykolyse (extrazelluläre Versauerungsrate; ECAR) von murinen Knochenmark-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Dieses Protokoll bietet eine höhere Menge an LSK-HSPCs aus murinen Knochenmark, verbessert die Lebensfähigkeit von HSPCs während der Inkubation, erleichtert extrazelluläre Flussanalysen von nicht-haftenden HSPCs und bietet optimierte Injektionsprotokolle (Konzentration und Zeit) für Medikamente, die auf oxidative Phosphorylierung und glykolytische Pfade abzielen. Diese Methode ermöglicht die Vorhersage des Stoffwechselzustands und der Gesundheit von HSPCs während der Blutentwicklung und Krankheiten.

Unsere Extraktionsmethode ermöglichte es uns, bis zu 80.000 LSK HSPCs pro Maus zu ernten. Die Lebensfähigkeit und Anzahl der LSK-Zellen wurde mit unserer Methode verbessert, weil wir: (1) Knochenmark aus oberen und unteren Gliedmaßen, Hüftknochen, Brustbein, Rippenkäfig und Wirbelsäule kombinierten, (2) die Verwendung eines roten Zelllysepuffers vermieden, der den Zelltod und die Verklumpung erhöht hätte, (3) nutzte die Dichtegradienten-Mitteltrennung von mononukleierten Zellen und (4) die Verwendung von vorgekühlten Puf...

Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) übergehen von einem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand aufgrund ihrer metabolischen Plastizität während der Blutbildung. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von HSPCs vor.

Analyse des hämatopoetischen Stamm-Vorläufer-Zellstoffwechsels

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Metabolische Veränderungen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen ermöglichen es ihnen, von ihrem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand überzugehen, um die Anforderungen an die Blutbildung zu erhalten. Die Veränderung der metabolischen Plastizität von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen führt zu hämatologischen Störungen. Unser Protokoll wird dazu beitragen, die metabolische Regulation und die Gesundheit von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen während der Blutentwicklung und Krankheiten zu messen.Die Analyse der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen ist schwierig, da sie zerbrechlich und selten sind. Unser optimiertes Protokoll ermöglicht die Isolierung einer höheren Menge hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark, verbessert deren Lebensfähigkeit während der Inkubation, erleichtert die extrazelluläre Flussanalyse nicht-anhaftender HSPCs und bietet optimierte Injektionsparameter für die bekämpfungde oxidative Phosphorylierung sowie glykolytische Wege. Um dieses Verfahren zu beginnen, füllen Sie die Brunnen der Versorgungsplatte und die Kammern um die Brunnen mit sterilem Wasser.Tauchen Sie die Sensorpatrone in die Netzteilplatte ein, um sicherzustellen, dass die Sensoren vollständig mit Wasser bedeckt sind. Dann legen Sie die Patrone in der Versorgungsplatte in einem Nicht-CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius, um über Nacht zu brüten. In einem Biosicherheitsschrank der Klasse II fügen Sie 40 Mikroliter handelsüblichen 0,1%PLL-Lösung zu jedem Brunnen der Assayplatte hinzu.Bedecken Sie die Assayplatte mit dem im Kit enthaltenen Deckel und bebrüten Sie die geschlossene Platte bei Raumtemperatur unter der Haube für eine Stunde. Danach verwenden Sie einen sterilen Vakuum-aspirator, um die überschüssige Lösung zu entfernen und die Platte unter der Haube zu trocknen. Um mononukleierte murinierte Knochenmarkzellen zu ernten, fügen Sie fünf Milliliter Dichtegradienten medium zu einem 15 Milliliter konischen Rohr hinzu.Fügen Sie langsam fünf Milliliter der Knochenmarkzellsuspension hinzu, um sicherzustellen, dass die Zellen als Schicht über dem Dichtegradientenmedium bleiben. Zentrifuge bei 500 mal g und bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um sicherzustellen, dass die Zentrifuge bei der geringstmöglichen Beschleunigung ist. Ernten Sie die mittlere Schnittstelle der mononukleierten Zellen in eine frische 15 Milliliter Tube.Waschen Sie dann die Zellen mit fünf Millilitern 1X PBS, die 2%FBS enthalten. Zentrifuge bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 300 Mikrolitern 1X PBS mit 2%FBS wieder auf.Als nächstes aliquot 10 Mikroliter der Zellsuspension für ungefärbte oder einfarbige Kontrolle in einem FACS-Rohr. Um LSK HSPCs aus mononukleierten murinen Knochenmarkzellen zu ernten, fügen Sie 15 Mikroliter Biotin-Antikörpercocktail zu 300 Mikrolitermononukleated Knochenmarkzellen hinzu. Um LSK HSPCs aus mononukleierten murinen Knochenmarkzellen zu ernten, fügen Sie 15 Mikroliter Biotin-Antikörpercocktail zu 300 Mikrolitermononukleated Knochenmarkzellen hinzu.Legen Sie die Rohre in einen Eiskübel, der auf einem Shaker in einem Kühlschrank positioniert ist, um bei vier Grad Celsius mit Rührung für 30 Minuten zu brüten. Fügen Sie dann 10 Milliliter vorgekühlte 1X PBS mit 2%FBS zu den Zellen hinzu. Zentrifuge bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 400 Mikrolitern 1X PBS mit 2%FBS wieder auf. Kurz wirbeln die Anti-Biotin-Mikroperlen vor der Verwendung. Fügen Sie 80 Mikroliter der Mikroperlen zu jeder Probe hinzu und mischen Sie sie gut.Weitere 20 Minuten bei vier Grad Celsius mit Aufregung inkubieren. Danach fügen Sie 10 Milliliter vorgekühlter PBS, die 2%FBS enthalten, zu den Zellen hinzu. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS mit 2%FBS wieder auf. Bewahren Sie die Zellsuspension bei vier Grad Celsius auf, während Sie die magnetische Trenneinheit einrichten. Platzieren Sie die Säule in einem Magnetfeld für den magnetisch unterstützten Zellsortierabscheider bei vier Grad Celsius.Bereiten Sie die Säule für die magnetische Trennung vor, indem Sie sie mit drei Millilitern 1X PBS mit 2%FBS unter Schwerkraftfluss bei vier Grad Celsius spülen. Fügen Sie die Zellsuspension bei vier Grad Celsius in die vornasse Säule ein. Lassen Sie alle Zellen bei vier Grad Celsius durch die Säule passieren und sammeln Sie das Abwasser in einem 15 Milliliter konischen Rohr.Als nächstes waschen Sie die Säule mit drei Millilitern 1X PBS und 2%FBS bei vier Grad Celsius. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal. Sammeln Sie den Durchfluss und halten Sie ihn bei vier Grad Celsius.Zentrifugieren Sie das konische Rohr, das den Durchfluss bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten enthält. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 0,5 Millilitern 1X PBS mit 2%FBS wieder aus und übertragen Sie die Suspension in ein FACS-Rohr. Dann fügen Sie 24 Mikroliter des LSK-Antikörpercocktails zu je 10 Millionen Zellen hinzu.Das Rohr mit Folie bedecken und im Dunkeln bei vier Grad Celsius eine Stunde lang mit Aufregung bedecken. Danach fügen Sie drei Milliliter 1X PBS mit 2%FBS in das FACS-Rohr. Zentrifuge bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die antikörperbeschrifteten Zellen in einem Milliliter 1X PBS mit 2%FBS wieder aus. Kurz vor der Sortierung einen Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Propidiumjodid in die Zellsuspension geben und mit einem 40-Mikrometer-Sieb den Inhalt der FACS-Röhre filtern. Zunächst zentrifugieren Sie die gesammelten LSK-Zellen bei 500-fachem g und bei Raumtemperatur für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in vollständigen Medien auf eine Endkonzentration von mindestens 70 000 Zellen pro 40 Mikroliter wieder aus. Samen 40 Mikroliter dieser Zellsuspension in die Brunnen einer PLL beschichteten Acht-Well-Platte, die sicherstellen, dass alle Eckbrunnen leer zu lassen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 450 mal g und bei Raumtemperatur für eine Minute.Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen an der Unterseite der Brunnen befestigt sind. Danach fügen Sie 135 Mikroliter komplette Medien in die Zellen in jedem Brunnen hinzu und bringen das Endvolumen jedes Brunnens auf 175 Mikroliter. Fügen Sie 175 Mikroliter komplettemedien als Rohlinge in die beiden Ecken der Platte.Inkubieren Sie die Zellen in einem Nicht-CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Richten Sie dann ein Programm für den Analysator ein, um jedem Brunnen der Platte Medikamente hinzuzufügen, wie in Tabelle 2 und Tabelle drei des Textprotokolls beschrieben. Für den mitochondrialen Stresstest, holen Sie die Sensorpatrone in der Gebrauchsplatte aus dem Inkubator, so dass jeder Brunnen eine endgültige Konzentration von zwei mikromolaren Oligomycin, 1,5 Mikromolar FCCP, und 0,5 Mikromolar von entweder Roton und Anti-Mycin A nach Bedarf hat.Entfernen Sie den Deckel von der Sensorpatrone und legen Sie ihn auf das Gerätefach. Beginnen Sie den Kalibrierungsprozess, der 20 Minuten dauert. Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Versorgungsplatte und ersetzen Sie sie durch die Assayplatte, die die LSK-Zellen enthält.Drücken Sie die Taste continue, um das zuvor eingestellte Programm zu starten. Wenn das Programm abgeschlossen ist, rufen Sie die Daten ab und analysieren Sie sie. In dieser Studie wird eine maximale Menge an lebensfähigen murinen LSK HSPCs isoliert und ihre Glykolyse und ihr mitochondrialer Stoffwechsel mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen.Obwohl die extrazelluläre Flussanalyse traditionell für anhäßende Zellen verwendet wird, macht diese Methode LSK HSPCs an PLL-beschichtete Brunnen haften, was die Messung des extrazellulären Flusses und damit des metabolischen Zustands von LSK HSPCs ermöglicht. Um die mitochondriale Atmung durch die Sauerstoffverbrauchsrate und Glykolyse durch die extrazelluläre Versauerungsrate bei Basal- und Stressbedingungen zu messen, werden Medikamente, die die Glykolyse und die mitochondriale Atmung stören, sequenziell injiziert. Wie erwartet ist der Basalgehalt der extrazellulären Versauerungsrate bei LSK HSPCs, die in Glukose- und Pyruvat-positiven Medien kultiviert sind, höher als bei den in negativen Medien kultivierten.Die Injektion mit Glukose änderte nicht die extrazelluläre Versauerungsrate für die zellenkultiviert in den positiven Medien, aber es steigerte die Glykolyse der Zellen in negativen Medien. Der Basalgehalt dieser Zellen blieb jedoch in der positiven Gruppe niedriger. Die Injektion mit Oligomycin aktivierte die Glykolyse auf ihrem maximalen Niveau in der positiven Gruppe, hatte aber keinen Einfluss auf die negative Gruppe.Die Injektion mit dem Glukose-Analog bei 2-DG brachte die extrazelluläre Versauerungsrate auf nicht-glykolytische Werte zurück. Für den mitochondrialen Stresstest hyperpolarisierte die Injektion von Oligomycin die mitochondriale Membran, die mehr Protonenpumpen durch die ETC-Komplexe verhinderte und somit die Rate der mitochondrialen Atmung reduzierte. Die Injektion von FCCP drückt die Sauerstoffverbrauchsrate auf das Maximum, da Zellen versuchen, das mitochondriale Membranpotenzial zurückzugewinnen.Die Injektion mit zwei weiteren Elektronentransportketteninhibitoren bewirkt, dass die mitochondriale Atmung vollständig zum Stillstand kommt und damit die Sauerstoffverbrauchsrate auf ihr Mindestniveau zurückgesetzt wird. Bitte vermeiden Sie die Verwendung eines Red-Zell-Lysepuffers für die mononukleäre Zellisolation. Wir empfehlen die Ficoll Gradiententrennung, um die Verklumpbildung zu verhindern und den Verlust von LSK zu reduzieren.Mit unserer optimierten Methode können wir die mitochondriale Atmung und Glykolyse seltener und zerbrechlicher hämatosischer Stamm- und Vorläuferzellen messen und die Untersuchung von metabolischen Hinweisen normale und bösartige Hämatopoese regulieren.

analysis-of-hematopoietic-stem-progenitor-cell-metabolism

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Kolonie-bildenden Zellen (CFC)-Assay ist ein in vitro Assay, bei dem hämatopoetischen Vorläuferzellen bilden Kolonien in einem halbfesten Medium. Eine Kombination aus Koloniemorphologie, Zellmorphologie und Durchflusszytometrie werden verwendet, um die Fähigkeit der Vorläuferzellen zur Proliferation und Differenzierung entlang der verschiedenen hämatopoetischen Linien zu beurteilen.

Colony Forming Cell (CFC)-Assay für humanen hämatopoetischen Zellen

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Hier beschreiben wir ein in-vivo-Mutagenese-Assay für eine kleine Anzahl von gereinigten hämatopoetischen Zellen unter Verwendung des lacI transgenen Mausmodell. Die LacI Gen isoliert, um die Häufigkeit, Ort und Art der DNA-Mutanten entstanden spontan oder nach der Exposition zu Genotoxinen bestimmen.

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

Dieses Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Einrichtung kompetitiver Knochenmarktransplantationsexperimente an Mäusen, um die Funktion hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen ohne vorherige Reinigung von Stammzellen durch Zellsortierung zu untersuchen.

Competitive Transplantationen Blutstammzell-Fitness zur Bewertung

Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Xenobiotische Efflux-Pumpen sind hochaktiv in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und verursachen die Extrusion von TMRM, einem mitochondrialen Membranpotenzial fluoreszierender Farbstoff. Hier stellen wir ein Protokoll zur genauen Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in HSPCs durch TMRM in Gegenwart von Verapamil, einem Efflux-Pumpeninhibitor, vor.

Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen

Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Messung des mitochondrialen Massen- und Membranpotenzials in ex vivo kultivierten hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

Die hier vorgestellte Methode fasst optimierte Protokolle zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen (HSPCs) der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator zusammen, um die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von HSPCs in Echtzeit zu messen.

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

Hier wird eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik vorgestellt, die es ermöglicht, gleichzeitig die Anzahl der Zellteilungen, den Phänotyp der Oberflächenzellen und die zelluläre Verwandtschaft zu messen. Diese Eigenschaften können statistisch mit einem auf Permutation basierenden Framework getestet werden.

Simultane Beurteilung von Verwandtschaft, Teilungszahl und Phänotyp mittels Durchflusszytometrie für hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Metaboliten in seltenen Zelltypen genau und zuverlässig zu messen. Technische Verbesserungen, darunter eine modifizierte Mantelflüssigkeit zur Zellsortierung und die Generierung relevanter Blindproben, ermöglichen eine umfassende Quantifizierung von Metaboliten mit einem Input von nur 5000 Zellen pro Probe.

Gezielte Metabolomik an seltenen Primärzellen

Erfahren Sie die optimierte Messung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse in hämatopoetischen Stamm-Vorläuferzellen aus murinem Knochenmark. Diese Methode verbessert die Zellviabilität und ermöglicht präzise metabolische Analysen.

Analyse des hämatopoetischen Stamm-Vorläufer-Zellstoffwechsels

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