Name: Licht-Spot-basierter Assay zur Analyse von Drosophila Larval Phototaxis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Lernen Sie den Licht-Spot-Assay zur Analyse der Phototaxis von Drosophila-Larven. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Untersuchung des Lichtvermeidungsverhaltens und neuronaler Grundlagen.

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Diese Arbeit wird von der naturwissenschaftlichen Stiftung China (31671074) und fundamental Research Funds for the Zhejiang Provincial Universities (2019XZZX003-12) unterstützt.

1. Herstellung von Drosophila Larven
<ol><li>Bereiten Sie Standardmedium bestehend aus gekochtem Maismehl (73 g), Agar (5,6 g), Sojamehl (10 g), Hefe (17,3 g), Sirup (76 ml) und Wasser (1000 ml) zu.</li>
	<li>Heben Sie alle Fliegen bei 25 °C auf Standardmedium in einem Raum mit einem 12 h/12 h Licht/Dunkel-Zyklus an.</li>
</ol>2. Herstellung von Agarplatten
<ol><li>Bereiten Sie 1,0% Agar-Lösung vor. Wiegen Sie 3 g Agar in einem 500 ml Becher mit einem Gleichgewicht, dann fügen Sie 300 ml destilliertes Wasser. Legen Sie ein Folienpapier über den Brecher, um zu verhindern, dass das Wasser verdunstet. Den Becher in einer Mikrowelle zum Kochen erhitzen.</li>
	<li>Nehmen Sie den Becher heraus und rühren Sie gut mit einer Glasstange, dann erhitzen in einer Mikrowelle zum Kochen. Wiederholen Sie dies, bis die Flüssigkeit vollständig transparent und flüssig ist. HINWEIS: Die endgültige Heiße Agar-Lösung sollte frei von Luftblasen sein; Andernfalls führt das Gießen des Agars in die Platte zu einer ungleichmäßigen und verbeulten Oberfläche der Agarplatte, was sich auf die nachfolgenden Larvenverhaltenstests auswirkt. Die Konzentration der Agarlösung sollte nicht zu hoch oder zu niedrig sein. Wenn die Konzentration zu hoch ist, ist die Lichtdiffusion auf der Agarplatte stark und schmiert die hell-dunkle Grenze ab. Wenn die Konzentration zu niedrig ist, hinterlassen die Larven Spuren auf der Platte. Beide Fehler behindern die Videoverarbeitung später im Protcol.</li>
	<li>Gießen Sie die heiße Agar-Lösung langsam in eine Petrischale (Durchmesser 15 cm), bis der Boden gleichmäßig mit einer Agarschicht bedeckt ist (4 mm Dicke), und kühlen Sie sie bei Raumtemperatur (RT), bis die Agarlösung erstarrt ist.</li>
	<li>Agar-Platte sollte verwendet werden, wenn es frisch zubereitet wird. Ist dies nicht der Fall, gießen Sie eine Wasserschicht auf die Oberfläche und lagern Sie sie bei 4 °C für die spätere Verwendung im Kühlschrank.</li>
</ol>3. Aufbau eines visuellen Stimulationssystems
<ol><li>Wählen Sie die LED-Lichtquelle: kollimiertes LED-Blaulicht bei 470 nm oder warmweißes Licht. HINWEIS: Die Lichtquelle kann durch LED-Licht jeder anderen Wellenlänge ersetzt werden. In diesem Experiment wird blaulichtled als Beispiel verwendet.</li>
	<li>Rollen Sie ein dickes Stück Aluminiumfolie oder schwarzen Karton (sicherstellen Deckkraft) zu einem offenen Zylinder von 12 cm Länge mit einem Durchmesser ähnlich dem der Blaulicht-LED mit einem Durchmesser von 3 cm. Lassen Sie das obere Ende des Zylinders das vordere Ende der Blaulicht-LED abdecken. Bedecken Sie das untere Ende mit einem schwarzen Karton mit einem kleinen runden Loch (0,5 cm Durchmesser) in der Mitte. Dies stellt den Aufbau des Lichtquellensystems dar.</li>
	<li>Fixieren Sie die vorbereitete Lichtquelle mit einem Clip auf den Eisenrahmen und stellen Sie sicher, dass das LED-Licht auf den Desktop hinabgeht. Neigen Sie den Zylinder leicht. Der Winkel zwischen der Zylinderebene und der vertikalen Ebene beträgt etwa 10° (siehe Abbildung 1). Schließen Sie das 470 nm blaue LED-Licht an den "LED1"-Stecker des Hochleistungs-LED-Treibers an. Schalten Sie den Treiber ein, drehen Sie den Knopf in der oberen rechten Ecke des Treibers, um Kanal 470 nmauszuwählen, und klicken Sie dann auf LED. Wenn dann der Bildschirm mit dem Bildschirm "- " angezeigt wird", wird ein blauer Lichtfleck auf dem Desktop angezeigt. HINWEIS: Wenn der Zylinder neben dem kleinen runden Loch Licht austritt, wird empfohlen, schwarzes Klebeband an den undichten Teilen zu verwenden, um sicherzustellen, dass nur das Loch Licht durchgehen kann.</li>
	<li>Klicken Sie auf OK und drehen Sie den Knopf, um die Intensität des Lichts anzupassen. Drehen Sie den Knopf auf eine höhere Lichtintensität von 50 mA. Messen und aufzeichnen Sie das Spektrum des Lichts mit einem Spektrometer.</li>
	<li>Bewegen Sie die Position der Lichtquelle nach oben und unten, um den Durchmesser des Lichtflecks auf 2 cm einzustellen. Der Desktop sollte schwarz sein, um einen besseren Kontrasteffekt zu erzielen.</li>
	<li>Drehen Sie den Knopf, um die Lichtintensität entsprechend den experimentellen Bedürfnissen zu wählen. Verwenden Sie eine kompakte Leistungskonsole mit einem Standard-Photodioden-Leistungssensor, um die maximale und minimale Lichtleistung an der Stelle zu messen, sie aufzuzeichnen, dreimal zu messen und den Durchschnittswert zu nehmen. HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Photodioden-Leistungssensor zu verwenden, um die Lichtintensität für Licht einer bestimmten Wellenlänge zu messen und einen thermischen Leistungssensor zu verwenden, um die Lichtintensität für weißes Licht zu messen.</li>
	<li>Berechnen Sie die Lichtintensität im Lichtfleck, indem Sie die gemessene Lichtleistung durch den Bereich des Sensors dividieren. HINWEIS: Wenn z. B. die gemessene Lichtleistung in Schritt 2,6 20 pW beträgt und die Sensorfläche 0,81 mm2beträgt, beträgt die Lichtintensität 24,69 pW/mm2 (Teilung 20 pW durch 0,81 mm2).</li>
</ol>4. Aufbau des Bildgebungssystems
<ol><li>Klemmen Sie eine hochauflösende Webkamera mit einem Eisenclip, etwa 10 cm über dem Lichtfleck auf dem Desktop (Abbildung 1).</li>
	<li>Passen Sie die Ausrichtung des Kameraobjektivs zum Desktop an. Schließen Sie die Kamera über eine USB-Schnittstelle an einen Computer an.</li>
	<li>Legen Sie eine Agar-Platte auf den Desktop direkt unter der Kamera.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software "Amcap9.22" auf dem Computer mit Windows 7, und der Lichtfleck wird automatisch im Fenster von AMcap angezeigt. Bewegen Sie die Kamera leicht nach links oder rechts, um sicherzustellen, dass sich der Lichtfleck in der Nähe der Mitte des Fensters befindet. Stellen Sie sicher, dass die Kamera den Lichtpfad nicht blockiert. Der Lichtfleck sollte vollständig und rund sein. HINWEIS: Die Software finden Sie unter http://amcap.en.softonic.com/.</li>
	<li>Befestigen Sie einen 850 nm x 3 nm Bandpassfilter mit einem Clip bei 5-7 mm direkt unter der Kamera. HINWEIS: Der Durchmesser des Filters beträgt ca. 2,5 cm, und das Kameraobjektiv hat einen Durchmesser von weniger als 1 cm, sodass der Filter das Gesichtsfeld der Kamera abdecken kann. Mit dem Filter unter der Kamera sollte der Lichtfleck nicht im Fenster von AMcap gesehen werden.</li>
	<li>Platzieren Sie drei infrarot-lichterzeugende LEDs (zentrale Wellenlänge = 850 nm) gleichmäßig um die Agarplatte. Jede LED sollte etwa 5 cm vom Rand der Agarplatte entfernt sein, und die Linsenfläche der LED sollte in einem 70° Abwärtswinkel zur Agarplatte liegen. Schließen Sie die LEDs über den AC-zu-DC-Wandler an die Stromversorgung an. HINWEIS: Es ist besser, die Positionen und Winkel der Infrarotlicht-LEDs zu fixieren, um die Konsistenz der Helligkeit des Feldes in verschiedenen experimentellen Versuchen zu gewährleisten und eine spätere Videoverarbeitung zu erleichtern.</li>
	<li>Setzen Sie eine schwarze Platine zwischen den Computer und das Gerät. Legen Sie die Helligkeit des Computerbildschirms fest, um zu verhindern, dass das Bildschirmlicht des Computers das Experiment beeinflusst. HINWEIS: Halten Sie die Umgebung dunkel, wenn Sie Wellenlänge oder Intensität des Lichts messen.</li>
</ol>5. Einstellen von Parametern der Bildgebung
<ol><li>Wählen Sie im Menü der AMcap-Software Optionen | Videogerät | Erfassen Sie das Format, und legen Sie die Pixelgröße des aufgenommenen Videos auf 800 x 600 und die Bildrate auf 60 fps fest.</li>
	<li>Entfernen Sie den Filter unter der Kamera, legen Sie ein Lineal unter die Kamera und passen Sie den Kamerafokus an, um die Skalierungslinie klar und parallel zur Breite des Videofelds zu machen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Capture | Einrichten | Videoaufnahme, um den Speicherpfad auszuwählen, klicken Sie auf Aufnahme starten, zeichnen Sie den tatsächlichen Abstand von 600 Pixelaufzeichnen und berechnen Sie das Verhältnis jedes Pixels zur tatsächlichen Entfernung.</li>
</ol>6. Videoaufzeichnung des Lichtvermeidungsverhaltens
<ol><li>Halten Sie eine Temperatur von 25,5 °C durch alle Experimente. Kontrollraumtemperatur bei Bedarf mit einer Klimaanlage. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit mit einem Luftbefeuchter konstant bei 60%.</li>
	<li>Nehmen Sie ein kurzes Video der Lichtfleckposition namens "lightarea1". Bewegen Sie dann den 850 nm x 3 nm Filter zurück, um das Kameraobjektiv zu bedecken. HINWEIS: Bei der Aufnahme des Larvenverhaltens wird das Kameraobjektiv mit dem 850 nm x 3 nm Filter abgedeckt, sodass der Lichtfleck nicht im Video angezeigt wird. Der Lichtfleck kann später mit Matlab in Videos mit Larven rekonstruiert werden. Ändern Sie nicht die Position der Kamera, und vermeiden Sie es, das Verhältnis jedes Pixels zu dem tatsächlichen Abstand zu ändern, der in Schritt 4.3 gemessen wird.</li>
	<li>Schalten Sie ein Licht (d. h. ein Raumlicht) weit weg vom Versuchsgerät ein. Schalten Sie das Licht so niedrig wie möglich, solange die Larven deutlich mit den Augen zu sehen sind. Die Larven mit einem Löffel aus dem Kulturmedium nehmen, vorsichtig eine Third-Instar-Larve pflücken und mit destilliertem Wasser reinigen. Achten Sie darauf, Larven nacheinander zu waschen, um Störungen durch Hunger zu vermeiden. Ein einzelnes Experiment erfordert mindestens 20 Larven.</li>
	<li>Übertragen Sie die Larve in die Mitte der Agarplatte, die während Schritt 3.3 unter der Kamera platziert wird. Entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Wasser aus der Larve mit einer Bürste oder verwenden Sie Blotpapier, um Wasser aus der Larve zu entfernen, um eine Reflexion von Licht unter der Linse zu verhindern. Schalten Sie das Raumlicht aus und lassen Sie die Larve für 2 min in der dunklen Umgebung zu akklimatisieren.</li>
	<li>Schalten Sie das LED-Licht ein, um Infrarotlicht zu erzeugen, und bürsten Sie die Larve vorsichtig in die Mitte der Platte. Wenn die Larve gerade zu kriechen beginnt, drehen Sie die Platte, um die Larve in Richtung des Lichtflecks zu bewegen. Stellen Sie sicher, dass es direkt von Anfang an kriecht, sonst erhält es keinen Zugriff auf den Lichtfleck.</li>
	<li>Klicken Sie auf Capture | Einrichten | Videoaufnahme, um den Speicherpfad auszuwählen, und klicken Sie dann auf Aufnahme starten, um aufzunehmen. Lassen Sie die Larve in Richtung des Lichtflecks kriechen, betreten Sie den Lichtfleck und lassen Sie dann den Lichtfleck, bis er fast aus dem Sichtfeld heraus ist. Klicken Sie auf Aufzeichnung beenden. Wenn sich die Larve vor dem Näherungsvorgang vom Lichtfleck abwendet, klicken Sie direkt auf Aufnahme beenden.</li>
	<li>Bewegen Sie den Filter von der Kamera weg. Nehmen Sie ein kurzes Video von der Position des Lichtflecks namens "lightarea2" und vergleichen Sie ihn mit "lightarea1", um sicherzustellen, dass die Lichtfleckposition nicht geändert wird. Wenn eine offensichtliche Positionsänderung beobachtet wird, verwerfen Sie die Daten.</li>
</ol>7. Datenanalyse
<ol><li>Verwenden Sie SOS17, um tierkörperische Kontur- und Bewegungsparameter aus Videos mit Bildverarbeitungsmethoden zu extrahieren, wie zuvor beschrieben17. HINWEIS: Parameter wie HeadSpeed (Geschwindigkeit des Larvenkopfes), TailSpeed (Geschwindigkeit des Larvenschwanzes), MidSpeed (Geschwindigkeit des Larvenmittelpunkts der Skelettlinie) und cmSpeed (Geschwindigkeit des Larvenzentroids) wurden verwendet, um die Geschwindigkeit der Larvenbewegung zu messen. Parameter wie HeadTheta (der Winkel zwischen den Linien von Kopf-Mittelpunkt und Mittelpunkt-Schwanz) und headOmega (die wechselnde Geschwindigkeit von headTheta) wurden verwendet, um Larvenkörperbiegen und die Winkelgeschwindigkeit des Biegens zu messen.</li>
</ol>

<ol><li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669(1971).</li>
<li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li>
<li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+behavior%3A+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337(1999).</li>
<li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293(2005).</li>
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<li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+light%3A+photobehavior+in+fruit+fly+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li>
<li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868(2013).</li>
<li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications.+9%22%5BJournal%5D)">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li>
<li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li>
<li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113(2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li>
<li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin.+Feb%22%5BJournal%5D)">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li>
<li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li>
<li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237(2013).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921(2010).</li>
<li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642(2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll stellt den Lichtfleck-Assay vor, um die Fähigkeit von Drosophila-Larven zu testen, dem Licht zu entkommen. Dieser Test ermöglicht die Verfolgung des Verhaltens von Larven vor dem Betreten, während der Begegnung und nach dem Verlassen eines Lichtflecks. Details der Larvenbewegung können erfasst und analysiert werden. Der Lichtfleck-Assay ist sehr einfach und besitzt eine starke Praktikabilität. Die Kosten für das gesamte Gerät sind nicht hoch. Im Experiment wird LED-Licht als Lichtquelle verwende...

Die Larven von Drosophila melanogaster zeigen ein offensichtliches lichtvermeidendes Verhalten während der Futterphase. Drosophila larval phototaxis wurde untersucht, vor allem in den letzten 50 Jahren1,2,3,4,5,6,7 ,8. In den letzten Jahren wurden trotz der Tatsache, dass 1) viele Neuronen, die Larvenlichtvermeidung vermitteln,identifiziert4,5,9,10,11,12 und 2) das komplette Connectome des Larven-Visuellen Systems bei der Auflösung von Synapsen wurde13etabliert, die neuronalen Mechanismen, die Larvenphototaxis zugrunde liegen, bleiben weitgehend unklar.
Eine Reihe von Verhaltens-Assays wurden verwendet, um Larven-Phototaxis zu studieren. Sie lassen sich weitgehend in zwei Klassen unterteilen: eine mit räumlichen Lichtgradienten und die andere mit zeitlichen Lichtgradienten. Bei räumlichen Lichtgradienten-Assays ist die Arena in gleiche Anzahl von Abschnitten in Hell und Dunkel unterteilt. Die Arena kann in helle und dunkle Hälften2,4 oder helle und dunkle Quadranten14,15, oder kann sogar in alternative helle und dunkle Quadrate wie auf einem Schachbrett7getrennt werden. Normalerweise werden Agarplatten für räumliche Lichtgradienten-Assay verwendet, aber Rohre, die in alternative helle und dunkle Abschnitte unterteilt sind, können auch10,14verwendet werden.
In älteren Versionen von Assays stammt die Lichtbeleuchtung in der Regel von unterhalb der Larven. Die Beleuchtung in neueren Versionen stammt jedoch weitgehend von oben, da Larvenaugen (z. B. die Organe des Bolwig, die empfindlich auf niedrige oder mittlere Lichtintensitäten16) im undurchsichtigen Cephalopharyngealskelett mit Öffnungen in Richtung die obere Vorderseite. Dies macht Larven empfindlicher gegenüber Licht aus oberen vorderen Richtungen als von unten hinter Denrichtungen7. Bei zeitlichen Lichtgradienten-Assays ist die Lichtintensität in der Arena räumlich einheitlich, aber die Intensität ändert sich im Laufe der Zeit. Neben zeitlichem Rechtecklicht (d.h. blinkendes ein/aus oder starkes/schwaches Licht3,7) wird zeitlich variierendes Licht, das einer linearen Rampe in der Intensität entspricht, auch8 verwendet, um die Empfindlichkeit von Larven zeitlich wechselnden Lichtreiz.
Eine dritte Art von Phototaxis Assay ist die richtungsweisende Licht-Landschaftsnavigation, die Beleuchtung von oben in einem Winkel von 45°7beinhaltet. Vor der Arbeit von Kane et al.7wurden in Larven-Phototaxis-Assays nur grobe Parameter wie die Anzahl der Larven in hellen und dunklen Regionen, die Drehhäufigkeit und die Spurlänge berechnet. Seit der Arbeit dieser Gruppe, mit der Analyse von hochzeitlichen Auflösung Videoaufzeichnung für Larven-Phototaxis, detaillierte Dynamik der Larvenbewegung während Phototaxis (d.h. sofortige Geschwindigkeiten von verschiedenen Teilen des Larvenkörpers, Richtung, Wendewinkel und die entsprechende Winkelgeschwindigkeit) wurden analysiert7. So konnten weitere Details des Larven-Phototaxis-Verhaltens entdeckt werden. In diesen Tests werden Larven in Gruppen getestet, so dass Gruppeneffekte nicht ausgeschlossen werden.
Dieses Protokoll führt einen Lichtfleck-Assay zur Untersuchung von Larvenverhaltensreaktionen auf die individuelle Lichtstimulation ein. Die Hauptanlage besteht aus einem visuellen Stimulationssystem und einem lichtbasierten Infrarot-Bildgebungssystem. Im visuellen Stimulationssystem erzeugt eine LED-Lichtquelle einen rund 2 cm großen Lichtfleck auf einer Agarplatte, wo die Larve getestet wird. Die Lichtintensität kann mit einem LED-Treiber eingestellt werden. Das Bildgebungssystem umfasst eine Infrarotkamera, die das Verhalten der Larve sowie drei 850 nm Infrarot-LEDs erfasst, die die Beleuchtung der Kamera ermöglichen. Das Objektiv der Kamera wird mit einem 850 nm Bandpassfilter abgedeckt, um das Licht des visuellen Stimulationssystems am Eindringen in die Kamera zu hindern, während das Infrarotlicht in die Kamera eindringen darf. So wird eine Störung der visuellen Stimulation bei der Bildgebung verhindert. In diesem Test werden die Verhaltensdetails der schnellen Reaktionen einzelner Larven innerhalb eines Zeitraums, einschließlich vor, während und nach dem Eindringen ins Licht, aufgezeichnet und analysiert.

<table><tbody><tr><td>850 nm &plusmn; 3 nm Infrarotlicht erzeugende LED</td><td>Thorlabs, USA</td><td>PM100A</td><td>Kompatible Sensoren: Fotodioden und Thermal Optischer Leistungsbereicha: 100 pW bis 200 W Verfügbarer Sensorwellenlängenbereicha: 185 nm-25 &mu; m Bildwiederholfrequenz des Displays: 20 Hz Bandbreitea: DC-100 kHz Fotodiodensensor Reichweiteb: 50 nA-5 mA Thermosäulen-Sensorbereichb: 1 mV-1 V</td></tr><tr><td>AC/DC-Wandler</td><td>Thorlabs, USA</td><td>S120VC</td><td>Blendengröße: &Oslash; 9,5 mm Wellenlängenbereich: 200-1100 nm Leistungsbereich: 50 nW-50 mW Detektortyp: Si-Fotodiode (UV-erweitert) Linearität: &plusmn; 0,5% Messunsicherheit: &plusmn; 3% (440-980 nm), &plusmn; 5% (280-439 nm), &plusmn; 7% (200-279 nm, 981-1100 nm)</td></tr><tr><td>Bandpassfilter</td><td>Thorlabs, USA</td><td>DC2100</td><td>LED-Strombereich: 0-2 A LED-Stromauflösung: 1 mA LED-Stromgenauigkeit: &plusmn; 20 mA LED-Durchlassspannung: 24 V Modulationsfrequenzbereich: 0-100 kHz Sinuswelle Modulation: Arbiträr</td></tr><tr><td>kollimiertes LED-Blaulicht</td><td>ELP, China</td><td>USBFHD01M</td><td>Max. Auflösung: 1920X1080 F6,0 mm Sensor: 1/2,7" CMOS OV2710</td></tr><tr><td>Kompakte Powermeter-Konsole</td><td>Ocean Optics, USA</td><td>USB2000+(RAD)</td><td>Abmessungen: 89,1 mm x 63,3 mm x 34,4 mm Gewicht: 190 g Detektor: Sony ILX511B (lineares Silizium-CCD-Array mit 2048 Elementen) Wellenlängenbereich: 200-850 nm Integrationszeit: 1 ms &ndash; 65 Sekunden (20 Sekunden typisch) Dynamikbereich: 8,5 x 10^7 (System); 1300:1 für eine einzelne Erfassung Signal-Rausch-Verhältnis: 250:1 (volles Signal) Dunkles Rauschen: 50 RMS counts Gitter: 2 (250 &ndash; 800 nm) Spalt: SLIT-50 Detektor-Sammellinse: L2 Ordnungssortierung: OFLV-200-850 Optische Auflösung: ~2,0 nm FWHM Streulicht: < 0,05 % bei 600 nm; < 0,10 % bei 435 nm Glasfaseranschluss: SMA 905 auf 0,22 einsträngige Faser mit numerischer Apertur</td></tr><tr><td>Hochleistungs-LED-Treiber</td><td>Minhongshi, China</td><td>MHS-48XY</td><td>Arbeitsspannung: DC12V Zentrale Wellenlänge: 850 nm</td></tr><tr><td>hochauflösende Webcam</td><td>Thorlabs, USA</td><td>MWWHL4</td><td>Farbe: Warmweiß Korrelierte Farbtemperatur: 3000 K Prüfstrom für typische LED-Leistung: 1000 mA Maximaler Strom (CW): 1000 mA Bandbreite (FWHM): N/A Elektrische Leistung: 3000 mW Betrachtungswinkel (Vollwinkel): 120 Emittergröße: 1 mm x 1 mm Typische Lebensdauer: >50 000 h Betriebstemperatur (nicht kondensierend): 0 bis 40 &deg; C Lagertemperatur: -40 bis 70 °C; C Risikogruppe: RG1 &ndash; Low Risk Group</td></tr><tr><td>LED Warmweiß</td><td>Mega-9, China</td><td>BP850/22K</td> <td>& Oslash; 25,4 (+0~-0,1) mm Bandbreite: 22&plusmn; 3 nm Spitzendurchlässigkeit: 80% Zentrale Wellenlänge: 850 nm und plusmn; 3nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Spektrometer&nbsp;</td><td>Noel Danjou</td><td>Amcap9.22</td><td>AMKap&nbsp; ist eine Foto- und Videoaufnahmeanwendung mit erweiterten Vorschau- und Aufnahmefunktionen. Es handelt sich um eine Desktopanwendung, die für Computer mit Windows 7 SP1 oder höher entwickelt wurde. Die meisten&nbsp; Video für Windows und&nbsp; DirectShow-kompatible Geräte werden unterstützt, unabhängig davon, ob es sich um billige Webcams oder fortschrittliche Videoaufnahmekarten handelt.</td></tr><tr><td>Standard-Leistungssensor für Fotodioden</td><td>Super Dragon, China</td><td>YGY-122000</td><td>Eingang: AC 100-240V ~ 50 / 60Hz 0,8A Ausgang: DC 12V 2A</td></tr><tr><td>Thermischer Leistungssensor &nbsp;</td><td>Thorlabs, USA</td><td>M470L3-C1</td><td>Farbe: Blau Nennwellenlängea: 470 nm Bandbreite (FWHM): 25 nm Maximaler Strom (CW): 1000 mA Durchlassspannung: 3,2 V Elektrische Leistung (max<): 3200 mWbr/> Emittergröße: 1 mm x 1 mm Typische Lebensdauer: 100 000 h Betriebstemperatur (nicht kondensierend): 0 bis 40 &de; C Lagertemperatur: -40 bis 70 °C; C Risikogruppe b: RG2 &ndash; Moderate Risikogruppe</td></tr><tr><td>Thermische Leistungssensoren&nbsp;</td><td>Thorlabs, USA</td><td>S401C</td><td>Wellenlängenbereich: 190 nm-20 &mu; m Optischer Leistungsbereich:10 &mu; W-1 W(3 Wb) Größe der Eingangsblende: &Oslash; 10 mm Aktive Detektorfläche: 10 mm x 10 mm Maximale optische Leistungsdichte: 500 W/cm2 (Durchschn.) Linearität: &plusmn; 0,5 %</td></tr></tbody></table>

licht-spot-basierter assay zur analyse von drosophila larval phototaxis

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Die Larven von Drosophila melanogaster zeigen ein offensichtliches lichtvermeidendes Verhalten während der Futterphase. Drosophila larval phototaxis können als Modell verwendet werden, um das Verhalten von Tieren zu untersuchen. Dieses Protokoll führt einen Lichtfleck-Assay ein, um das phototaktische Verhalten der Larven zu untersuchen. Die experimentelle Einrichtung umfasst zwei Hauptteile: ein visuelles Stimulationssystem, das den Lichtfleck erzeugt, und ein infrarotlichtbasiertes Bildgebungssystem, das den Prozess der Larvenlichtvermeidung aufzeichnet. Dieser Test ermöglicht die Verfolgung des Verhaltens von Larven vor dem Betreten, während der Begegnung und nach dem Verlassen des Lichtflecks. Details der Larvenbewegung, einschließlich Verzögerung, Pause, Kopfgießen und Drehen können mit dieser Methode erfasst und analysiert werden.

Gemäß dem Protokoll wurde der Lichtfleck-Assay verwendet, um das Lichtvermeidungsverhalten von dritten Insternlarven zu untersuchen, die bei 25 °C auf Standardmedium in einem Raum mit einem 12 h/12 h Licht-/Dunkelzyklus angehoben wurden. Eine einzelne w1118 Larve wurde mit dem Lichtfleck-Assay bei 25,5 °C getestet. Die durchschnittliche Lichtintensität des Lichtflecks, der durch eine 460 nm LED erzeugt wurde, betrug 0,59 w/cm2. Der gesamte Prozess des Eindringens und Verlassens des Lichtfl...

Dieses Protokoll führt einen Lichtfleck-Assay ein, um das phototaktische Verhalten von Drosophila larval zu untersuchen. In diesem Test wird ein Lichtfleck als Lichtstimulation erzeugt, und der Prozess der Larvenlichtvermeidung wird durch ein infrarotlichtbasiertes Bildgebungssystem aufgezeichnet.

Licht-Spot-basierter Assay zur Analyse von Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Mit dem Lichtfleck-Assay kann das Verhalten von Larven vor, während und nach dem Betreten des Lichtbereichs verfolgt werden, so dass die Details der Larvenbewegung analysiert werden können. Dieser Test ist einfach und einfach durchzuführen. Die Lichtreaktion wird nur einmal getestet, so dass ein möglicher Effekt der Lichtanpassung ausgeschlossen werden kann.Um die Agarplatten vorzubereiten, bedecken Sie langsam und gleichmäßig den Boden einer 15 Zentimeter langen Petrischale mit einer etwa vier Millimeter dicken Schicht mit heißem 1%Agar. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur abkühlen, bis sich der Agar verfestigt hat. Um das visuelle Stimulationssystem einzurichten, klemmen Sie eine vorbereitete LED-Lichtquelle auf einen Eisenrahmen und achten Sie darauf, dass das Licht auf den Desktop hinabgeht.Neigen Sie den Zylinder leicht, bis der Winkel zwischen der Zylinderebene und der vertikalen Ebene etwa 10 Grad beträgt. Schließen Sie das 470 Nanometer blaue LED-Licht an die LED ein Stecker des Hochleistungs-LED-Treibers an und schalten Sie den Treiber ein. Drehen Sie den Knopf in der oberen rechten Ecke des Treibers, um Kanal 470 Nanometer auszuwählen und auf LED zu klicken.Wenn auf

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Biologie

In diesem Video-Beitrag beschreiben wir eine neue Methode erlaubt den Bau von Geruchsrezeptoren Gradienten mit stabilen und kontrollierbaren Geometrien. Wir haben kurz zeigen, wie diese Gradienten zu Bildschirm kann für olfaktorische Mängel (vollständiger oder teilweiser Anosmie) verwendet werden und auf subtilere Funktionen der Chemotaxis Verhalten zu studieren.

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Drosophila melanogaster ist eine genetisch und auf der Verhaltensebene praktische Zwecke geeigneten Modells, das verwendet wurde, um die molekularen und zellulären Grundlagen von vielen wichtigen biologischen Prozessen seit über einem Jahrhundert ein zu verstehen. Drosophila wurde auch genutzt, um Einblicke in die genetischen Grundlagen der Fliege Verhalten zu gewinnen.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Drosophila-Larven sind lichtempfindlich und reagieren auf Veränderungen des Umgebungslichts. Dieses Video beschreibt einen Assay, der ihre Fähigkeit testet, Licht zu vermeiden, den sogenannten Lichtfleck-Assay. Das vorgestellte Protokoll zeigt, wie der Assay mit einer Blaulicht-LED eingerichtet wird, und zeigt, wie das Verhalten des Tieres als Reaktion auf die Lichtbegegnung aufgezeichnet wird.

Light Spot Assay: Eine Methode zur Untersuchung des phototaktischen Verhaltens von Drosophila

Hier beschreiben wir eine Hell-Dunkel-Präferenz-Test für Drosophila Larve. Dieser Test liefert Informationen zur angeborenen und zirkadiane Regulierung von Licht Abtasten und Verarbeiten photobehavior.

Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In diesem Video-Artikel beschreiben wir einen automatisierten Test, um die Wirkung von Hunger oder Sättigung auf olfaktorische abhängige Nahrungsmittel Suchverhalten in der Erwachsenen Obst messen Drosophila melanogaster.

Ein Single-fly-Assay für Sammelverhalten in Drosophila

Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Messung der Larvenaktivität von Drosophila mit dem TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Das Gerät nutzt Infrarotstrahlen, um die Bewegungen von bis zu 16 einzelnen Tieren zu erkennen. Die Daten können analysiert werden, um Bewegungsparameter wie Raten und die Positionen der Tiere in den Assay-Kammern darzustellen.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Assay zum Testen der Eiablagepräferenzen von Drosophila melanogaster bei Einzeltierauflösung.  Dieser Assay bietet eine einfache, effiziente und skalierbare Plattform zur Identifizierung von Genen und Schaltkreiskomponenten, die einen einfachen Entscheidungsprozess steuern.

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dieses Protokoll analysiert Navigations Verhalten von Drosophila Larve in Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen. 630 nm Wellenlänge wird verwendet, um einzelne olfaktorischen Neuronen mit dem Ausdruck einer rot-verschoben Kanal Rhodopsin zu aktivieren. Larval Bewegung gleichzeitig verfolgt, digital erfasst und mit individuell geschriebenen Software analysiert.

Tracking von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen

Hier werden nicht-invasive Methoden zur Lokalisation von Photorezeptormembranproteinen und zur Beurteilung der Netzhautdegeneration im Drosophila-Facettenauge mittels eGFP-Fluoreszenz beschrieben.

Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen

In dieser Arbeit werden Methoden zur optogenetischen Manipulation in Drosophila melanogaster vorgestellt, bei denen CsChrimson und GtACR2 verwendet werden, um spezifische Neuronen zu aktivieren und zum Schweigen zu bringen. Es werden vier Experimente beschrieben, die die Optogenetik nutzen, um thermotaktische und gustatorische Verhaltensweisen zu erforschen und Einblicke in die zugrunde liegenden neuronalen Mechanismen zu geben, die diese Prozesse steuern.

Verhaltensassays zur optogenetischen Manipulation neuronaler Schaltkreise in Drosophila melanogaster

Das Protokoll stellt eine kostengünstige Methode mit hohem Durchsatz zur Beurteilung der Neurotoxizität in der Fruchtfliege durch die Quantifizierung der Bewegungsstörung als Alternative zu herkömmlichen Säugetiermodellen dar. Ziel ist es, die neurotoxischen Wirkungen von pharmazeutischen Wirkstoffen, Umwelteinflüssen oder genetischen Veränderungen anhand eines sensitiven, reproduzierbaren und ethisch günstigen Modells zu bewerten.

Verhaltensanalyse der lokomotorischen Dysfunktion bei Drosophila melanogaster als Aussage für Neurotoxizität

Lernen Sie den Licht-Spot-Assay zur Analyse der Phototaxis von Drosophila-Larven. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Untersuchung des Lichtvermeidungsverhaltens und neuronaler Grundlagen.

Licht-Spot-basierter Assay zur Analyse von Drosophila Larval Phototaxis

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