Stereotaxic Chirurgie für die Implantation von Mikroelektroden-Arrays im Gemeinsamen Marmoset (Callithrix jacchus)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die chirurgischen Schritte zu skizzieren, die bei der Implantation von Mikroelektroden-Arrays für die chronische elektrophysiologische Aufzeichnung in frei verhaltenden Marmosets involviert sind. Marmosets sind kleine Primaten, die zunehmend in der neurowissenschaftlichen Forschung eingesetzt werden. Diese Tiere teilen viele der praktischen und logistischen Vorteile von Nagetieren.

Ihre Neigung zu Städtepartnerschaften und hoher Fruchtbarkeit in jungen Jahren bedeutet einen bereiten Zugang zu großen und genetisch ähnlichen Kohorten. Darüber hinaus macht ihre kleine Körpergröße sie einfach und relativ günstig zu pflegen. Als Primaten hat das Marmoset ein zentrales Nervensystem, das einem Menschen viel ähnlicher ist als das eines Nagetiers.

Dazu gehören ein hochentwickelter präfrontaler Kortex und ein visuelles System. Ein Vorteil, den Marmosets gegenüber vielen anderen Primatenarten haben, sind jedoch die Fortschritte bei der genetischen Veränderung. Mit einem tief sequenzierten Genom und Erfolg, das Gründer-Knock-in- und Knock-out-Tiere erzeugt, ist es klar, dass das Marmoset bereit ist, ein mächtiges Modell für die Untersuchung der Gehirnfunktion in Gesundheit und Krankheit zu werden.

Eine gängige Methode zur Untersuchung der Gehirnfunktion beinhaltet die Implantation von Elektroden an anatomisch spezifischen Stellen. Dies ermöglicht es, die neuronale Aktivität in verschiedenen Zielbereichen in wachen und frei benehmentierenden Tieren chronisch aufzuzeichnen. Bestimmen Sie vor der Operation die intraorale Nullkoordinate für alle Implantate und Führungen.

Befestigen Sie dazu jedes Elektrodenarray, das an einen Elektrodenhalter implantiert wird, und stellen Sie einen Mikrodraht auf die intraorale Null. Hier treffen sich die Ohrbügel. Wiederholen Sie dies ggf. für die zusätzlichen Elektroden-Arrays und Halter.

Wiederholen Sie dies außerdem mit einer 24-Spur-Nadel, die ähnlich an einem stereotaxic-Sondenhalter befestigt ist. Für elektrophysiologische Arrays sollte ein Erdungsdraht an jede andere Schraube gelötet werden, die verwendet wird. Schließlich organisieren und sterilisieren Sie alle Instrumente, Geräte und Einwegartikel in Vorbereitung auf den chirurgischen Eingriff.

Am Tag der Operation versichern, dass das Tier sechs Stunden vor Beginn der Anästhesie nicht gegessen hat. Atropin und Ketamin werden verwendet, um Anästhesie durch sequenzielle, intramuskuläre Injektionen zu induzieren. Als nächstes rasieren Sie die Tiere Kopf mit Barbier Clippers.

Es ist wichtig, das Tier während der Operation zu intubieren. Unsere bevorzugte Methode besteht darin, ein elastisches Band am Operationstisch zu befestigen, den wir hinter den Canines der Tiere einsetzen, während es sich in einer Supine-Position befindet. Als nächstes verwenden wir eine wattest gekippte Sonde, um die Zunge des Marmosets zu trocknen und in einer Hand zu greifen.

Dadurch kann ein Techniker Mund und Atemwege mit nur einer Hand öffnen. Nach dem Einsetzen des Endotrachealrohrs, befestigen Sie es an der Anästhesie-Baugruppe mit dem künstlichen Beatmungsgerät auf 40 Atemzüge pro Minute eingestellt. Sichern Sie das Rohr und die Montage bei Bedarf mit Klebeband.

Mit dem Marmoset jetzt in anfälliger Position fixieren Sie den Kopf des Tieres in den stereotaxic Rahmen. Dazu legen Sie zunächst die Spitze der rechten Ohrstange in den rechten Gehörgang des Tieres ein. Gefolgt von der linken Ohrstange in den linken Gehörgang.

Als Nächstes muss der Kopf so nivelliert werden, dass die horizontale Ebene parallel zum Rahmen ist, während die vordere/hintere Ebene zentriert ist. Dies wird erreicht, indem zuerst der Kopf des Tieres mit den Ohrstangenmessungen zentriert wird, die in gleichen Entfernungen gesichert sind. Anschließend wird das Mundstück in den Mund des Tieres eingeführt und so lange angepasst, bis es die Palette des Tieres berührt, während die Orbitalstäbe nur den unteren Rand des Orbitalknochens berühren.

Da die horizontale Ebene als die Ebene definiert ist, die durch den unteren Rand des Orbitalknochens und das Zentrum des externen auditiven Medius verläuft, sollte man sicherstellen, dass die untere Oberfläche des Orbitalknochens nun horizontal mit dem Mittelpunkt der Ohrbalken ausgerichtet ist, bevor Sie fortfahren. Während des Verfahrens ist es wichtig, alle Vitalzeichen beizubehalten. Daher sollte man ein tragbares Pulsoximeter an die Hand des Marmosets anschließen, um sicherzustellen, dass Herzfrequenz und Sauerstoffsättigung innerhalb der akzeptablen Bereiche liegen.

Darüber hinaus wird ein rektaler Temperaturfühler, der mit einem homeothermischen Heizpad verbunden ist, das auf 37 Grad Celsius eingestellt und an den Schwanz geklebt ist, dafür sorgen, dass die Körpertemperatur des Murmelts nicht durch Anästhesie beeinträchtigt wird. Der letzte präoperative Schritt besteht darin, den rasierten Kopf des Tieres mit Chlorhexidin und Jod zu reinigen und zu desinfizieren, bevor das Tier mit einem sterilisierten Operationsfeld bedeckt wird. Führen Sie einen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut nach der Anwendung eines lokalen Schmerzmittels an dieser Stelle.

Um die Oberfläche des Schädels vorzubereiten, lösen Sie zunächst vorsichtig den zeitlichen Muskel vom Schädel. Dies geschieht, indem die Fossa bei ihrer Einfügung in den Schädel mit einem Skalpell geschnitten wird. Danach sollte der zeitliche Muskel sanft vom Schädel getrennt werden, mit einem periostealen Raspatory.

Weiter mit dem periostealen Raspatorium entfernen Sie das Periost aus allen exponierten Schädel durch Kratzen. Als nächstes markieren Sie die Position der Kraniotomie, indem Sie flache Gratlöcher in die Knochenoberfläche schaffen und den Umfang der Kraniotomie ausbohren. Sechs bis acht Schraublöcher nach Bedarf in den Schädel bohren und die Schrauben implantieren.

Zu diesem Zeitpunkt winden Sie die Erddrähte an eine bestimmte Schraube um die angrenzende ungelötete Schraube gelötet. Entfernen Sie den Knochen in der Mitte der Kraniotomie mit McPherson Zange. Während das Gehirn und Dura mater aufgedeckt werden, halten Sie sie hydratisiert mit steriler Saline.

Um die Dura mater zu entfernen, sollte eine 25 oder 26 Gauge Nadel bei etwa 90 Grad gebogen werden, um das Punktieren und Heben der Oberfläche des Dura maters von der Gehirnoberfläche zu erleichtern. An dieser Stelle werden Mikroscheren verwendet, um die Dura mater zu verbrauchen. Befestigen Sie die Elektroden am stereotaxien Mikromanipulator und positionieren Sie ihn so, dass sich die Elektrode an den gewünschten vorderen/hinteren und medialen/lateralen Koordinaten befindet.

Senken Sie nun die Spitze der Elektrode, bis sie die Oberfläche des Gehirns berührt. Fügen Sie das Array langsam in das Gehirn ein, bis es die gewünschten dorsalen/ventralen Koordinaten erreicht. Fügen Sie einen Tropfen Silberfarbe zwischen dem Erddraht und jeder Schraube hinzu, um eine elektrische Verbindung zu gewährleisten.

Sichern Sie die Elektrode am Schädel, indem Sie Zahnacryl auf den freiliegenden Schädel, eine Schraube und das Elektrodenarray auftragen. Wiederholen Sie diese Implantation mit allen zusätzlichen Arrays. Schließlich, mit Zahn-Acryl, machen eine stabile Kopfkappe um die seitliche Ausdehnung der Anordnungen und vollständig für den Fall, dass die Erddrähte und alle freiliegenden Schädel oder Schrauben.

Bei Bedarf kann man eine Stützstange in die Kopfkappe einlegen und mit Zahnacryl versiegeln. Nach der Schaffung der Kopfkappe Naht der Haut, wenn Muskel- oder Knochengewebe ausgesetzt ist. Zu diesem Zeitpunkt sollte auch eine antiseptische Lösung auf die Wunde aufgetragen werden.

Mit der Operation abgeschlossen ist es Zeit, die Genesung zu beginnen. Schalten Sie zunächst die Isofluranversorgung, aber nicht den Sauerstoff aus, und entfernen Sie das Tier aus dem stereotaxic Rahmen. Legen Sie das Tier auf die Heizseite, wobei der Sauerstoff durch das Endotrachealrohr gehalten wird.

Wenn das erste Anzeichen von neurogenen Reflexen wie Kehlkopfkrämpfe beginnen, entfernen Sie die Endotrachealröhre. Sauerstoff sollte nun mit einer Maske versorgt werden, bis das Tier deutliche Anzeichen einer Anästhesieerholung wie Schutzreflexe, Haltungston und Ambulateversuche zeigt. Das Marmoset sollte einzeln untergebracht und in einem sauberen Käfig und Raum für 24 bis 48 Stunden zurückgelassen werden, bevor es in seinen Hauskäfig zurückkehrt.

Implantierte Tiere sollten in getrennten Käfigen untergebracht werden. Es ist wichtig, das Tier mindestens eine Stunde nach der Operation zu beobachten, um auf Anzeichen von Bedrängnis und speziell unkoordinierte Bewegungen zu achten. Antibiotika und Schmerzmittel und entzündungshemmende Medikamente sollten in den Tagen nach der Operation verabreicht werden, um Schmerzen zu kontrollieren und Infektionen zu verhindern.

Bei erfolgreichen Operationen sollte das Tier innerhalb von drei bis fünf Tagen vollständig geborgen werden. Wir empfehlen elektrophysiologischeAufnahmesitzungen, die mindestens eine Woche nach der Operation beginnen. Zu Beginn jeder Aufnahmesitzung befeuchten Sie das Tier mit Isofluran leicht und verbinden Sie den Anschluss der Elektrodenarrays an ein neuronales Aufzeichnungssystem.

Legen Sie das Tier in die Versuchskammer und warten Sie auf eine vollständige Anästhesieerholung, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen. Nach einer erfolgreichen Operation ist es möglich, Spitzen und lokale Feldpotenziale von den implantierten Elektroden über mehrere Wochen zu erfassen. Letztlich sollte eine endgültige Bestätigung, dass die Elektroden-Arrays erfolgreich in die Zielstrukturen implantiert wurden, post-mortem vorgeformt werden.

Nissl gebeizte Abschnitte, die Elektrospuren enthalten, können verwendet werden, um die Position jedes implantierten Mikrodrahtes zu bestimmen. Chronische elektrophysiologische Aufnahmen bei wach verhaltenden Tieren sind mächtige Techniken, die in vielen Linien der neurowissenschaftlichen Forschung verwendet werden. Da das gemeinsame Marmoset viele Vorteile gegenüber historisch beliebten Modellen bietet, ist der Zweck dieses Videos, anderen Neurowissenschaftlern zu helfen, das gemeinsame Marmoset für ihre Forschung anzunehmen.

Zusätzlich zur Implantation chronischer Aufnahmeelektroden, wie in diesem Video beschrieben, kann das gleiche stereotaxic-Chirurgieprotokoll für viele andere experimentelle Enden angepasst werden, einschließlich der Implantation von stimulierenden Elektroden, Führungskanülen und Mikroinjektionen. Bei der Anpassung dieses Protokolls an eine der oben genannten Techniken wird der Chirurg grundsätzlich das Bohrverfahren so ändern, dass es der Größe des gewünschten Implantats entspricht. Darüber hinaus ist das Bodenverfahren für viele dieser Techniken nicht notwendig und kann daher entfallen.

Unabhängig vom experimentellen Ziel sollten Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein Verständnis dafür haben, wie Sie die stereotaxic Neurochirurgie im gemeinsamen Marmoset erfolgreich durchführen können.