Quantifizierung der Selbsterneuerung in Murine Mammosphärenkulturen

Daher bieten Mammosphärenkulturen ein leicht zugängliches motorisches System, um wichtige Aspekte des normalen Verhaltens von Krebsbruststammzellen zu untersuchen und zu sezieren, einschließlich ihrer Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und zu differenzieren. Unser quantitativer Ansatz zielt darauf ab, die Wachstumsrate von Mammosphärenkulturen objektiv zu bewerten und einen direkten Vergleich verschiedener Zelltypen und -bedingungen zu ermöglichen. Für die erste Studie würde ich raten, eine strenge Kontrolle über die Inkubationszeiten zu halten, um eine Überverdauung zu vermeiden und eine genaue Zellzahl vor jeder Beschichtung zu gewährleisten.

Das Verfahren mit Charolaise Bull demonstriert Errico D'Elia, ein Techniker aus meinem Labor. Nach der Ernte der vier bauchigen und unteren Brustbrustdrüsen von 5 bis 30, 8 bis 10 Wochen alte weibliche Mäuse, legen Sie bis zu 20 Drüsen pro 100 Millimeter Petrischale in einem minimalen Volumen von DPBS. Das Gewebe in kleinere Stücke zerkleinern und 10 Milliliter Verdauungsmedium zu den Fragmenten hinzufügen.

Verwenden Sie eine 25 Milliliter serologische Pipette, um die Gewebeteile in ein 50 Milliliter konisches Rohr zu übertragen und das Rohr mit Paraffinfolie zu versiegeln. Dann inkubieren Sie die Fragmente auf einem Rotator bei 0,03 X G für 2 1/2 Stunden bei 37 Grad und 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit. Wenn am Ende der Inkubation alle Fragmente durch die P1000 Pipettenspitze geleitet werden können, die Gewebeschlämme durch Zentrifugation ablagern und den Überstand vorsichtig dekantieren.

Setzen Sie das Pellet in 3 Milliliter PBS aus und filtern Sie den Rohrinhalt sequenziell durch ein 100, 170, 140 Mikrometer Zellsieb in ein neues konisches Rohr, wobei jedes Sieb nach jedem Filter mit 2 Millilitern frischem DPBS gewaschen wird. Pellet die Zellen durch Zentrifugation und Dekantieren des Überstandes die Zellen in den verbleibenden DPBS wieder aussetzen. Mischen Sie die Zellen mit einem gleichen Volumen von Ammoniumchlorid KaliumlysePuffer und lyse die roten Blutkörperchen auf Eis für bis zu 5 Minuten.

Am Ende der Inkubation die Lyse mit 10 Millilitern DPBS festhalten und die Zellen durch Zentrifugation sammeln. Bestätigen Sie das Vorhandensein eines weißen Pellets und setzen Sie das Pellet in 1 bis 5 Milliliter Mammosphärenmedium zum Zählen wieder auf. Dann die Zellen auf nicht-Gewebe kulturbehandeltultraniedrige Haftung sechs Brunnenplatten bei einer 2 x 10 zu den fünften lebensfähigen Zellen pro Milliliter Mammosphäre mittlere Konzentration für eine 7 bis 10 Tage Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.

Am Ende der 7- bis 10-Tage-Kultur sammeln Sie die primären Mammosphären aus jedem Brunnen der Zellkulturplatte und sedimentieren die Mammosphären durch Zersplitterung. Nach der Dekantierung des Überstandes verwenden Sie eine P200 Pipette mit einer gefilterten Spitze, um die Mammosphären etwa 100 Mal zu pipetten. Die Generierung von Einzelzellen-Patienten ist entscheidend für die genaue Quantifizierung der Mammosphärenzelle für neue Lability.

Überprüfen Sie visuell die Ausdehnung der Segregation und verwenden Sie ggf. das Zellsieb. Setzen Sie die disassoziierten Mammosphären mit 1 bis 5 Millilitern frischem Mammosphärenmedium zum Zählen und Platte 2 X 10 auf die vierte lebensfähige Zelle pro Milliliter auf Polyhema beschichtetultra niedrige Haftung sechs Brunnenplatten für eine 5 bis 7 Tage Kultur. Zählen Sie dann nach 5 bis 7 Tagen die Anzahl der Kugeln pro Brunnen.

Verwenden Sie am Ende jeder Passage eine Digitalkamera, die auf einem Stereoskop montiert ist, um die gesamte Oberfläche aller Brunnen zu scannen, um die Kugeln abzubilden. Importieren Sie nach dem Speichern der Bilder als tif-Dateien die Stereoskopbilder als Bildsequenz in ImageJ und legen Sie den Maßstab und den Bildtyp auf 8-Bit fest. Duplizieren Sie den Stapel von Bildern, und wählen Sie Hintergrund auf der Registerkarte Prozess subtrahieren aus.

Überprüfen Sie die Optionen Lichthintergrund und Paraboloid und Schiebeparaboloid und klicken Sie auf OK, um alle Bilder des Stapels zu verarbeiten. Wählen Sie Auf der Registerkarte Bild die Option Anpassen und Schwellenwert aus, und klicken Sie auf Anwenden. Es wird ein Popup-Fenster angezeigt.

Wählen Sie Standard als Methode und Licht als Hintergrund aus. Aktivieren Sie den Schwellenwert für jedes Bild berechnen, und klicken Sie auf OK. Um alle Bilder im Stapel zu verarbeiten, wählen Sie Wassereinzugsgebiet aus, und klicken Sie auf Ja. Wählen Sie Öffnen und klicken Sie auf Ja, und wählen Sie Erodieren und klicken Sie auf Ja.

Wählen Sie als Nächstes im Menü Analysieren die Option Partikel analysieren aus, und legen Sie den Mindestgrößenschwellenwert auf 10.000 Mikrometer im Quadrat und die Zirkularität zwischen 0,50 und 1,00 fest. Wählen Sie die Option Ellipsen aus dem Dropdown-Menü Anzeigen aus und aktivieren Sie Zusammenfassung, Ausschließen an Kanten und In situ Show. Klicken Sie dann auf OK, um alle Bilder des Stapels zu verarbeiten.

Um die kumulative Wachstumskurve für jede Passage zu berechnen, registrieren Sie die Anzahl der plattierten Zellen und die Anzahl der Zellen in Kugeln, die pro Brunnen gezählt werden, und berechnen Sie die Kugelgröße am Ende jeder Passage. Schließen Sie die Anzahl der vergoldeten Kugeln ab, indem Sie die Anzahl der für jeden Durchgang plattierten Zellen durch die Kugelgröße dividieren, die am Ende des vorherigen Durchgangs berechnet wurde. Berechnen Sie die kumulative Zellennummer für jeden Brunnen pro Durchfahrt und die kumulative Kugelzahl für jeden Brunnen pro Durchfahrt und zeichnen Sie die Datenpunkte auf einer halblogarithmischen Skala.

Dann eine exponentielle Trendlinie zu den Datenpunkten und berechnen den Bestimmungskoeffizienten, um die Güte der Anpassung zu messen. Dann stellen Sie die Gleichung der Trendlinie als eine natürliche exponentielle Funktion dar, um die Wachstumsrate der Kultur abzuleiten. In diesem Experiment wurden die Kugel- und Zellzahlen von fünf aufeinanderfolgenden Passagen für drei unabhängige Experimente bestimmt.

Hier werden die kumulativen Zell- und Kugelzahlen pro Durchfahrt angezeigt. Wie beobachtet Myc-Aktivierung, führt zu erhöhten Kugel- und Zellwachstumsraten. Biologische und relevante Zeitpunkte können für die Zellsammlung oder für die Durchführung von Genexpressionsanalysen oder anderen funktionellen Ressourcen ausgewählt werden, um Zelldifferenzierung, Migration und Invasion zu bewerten.

Dies ist ein einfacher und kostengünstiger Ansatz mit mehreren Anwendungen. Zum Beispiel kann es bei der direkten Entdeckung verwendet werden, um die Auswirkungen auf die Proliferation von Krebsstammzellen und die Selbsterneuerung zu messen.