Überwachung des extrazellulären pH-Werts in cross-kingdom Biofilmen mit Konfokalmikroskopie

Das Protokoll stellt eine einfach durchzuführende Methode für den Anbau von reichsübergreifenden Biofilmen dar, die aus StreptococcuS bestehen. Mutans und Candida albicans. Die anschließende konfokale Mikroskopie-basierte pH-Ratiometrie ermöglicht eine genaue Überwachung der pH-Entwicklungen innerhalb der extrazellulären Matrix dieser Biofilme.

Die sorgfältige Wahl der Bildaufnahmeparameter ist von größter Bedeutung, um Bilddaten mit ausreichendem Kontrast für die nachfolgende Analyse zu erhalten. pH-Ratiometrie ist eine schnelle, präzise und kostengünstige Methode, um sowohl horizontale als auch vertikale pH-Gradienten in kingdomübergreifenden Biofilmen in Echtzeit zu untersuchen. pH-Ratiometrie kann auch in rein pilzlichen und bakteriellen Biofilmen durchgeführt werden.

Die Methode trägt dazu bei, unser Verständnis des mikrobiellen Stoffwechsels in Biofilmen zu erhöhen. Demonstriert das Verfahren für das Biofilmwachstum wird Anette Aakjaer Thomsen, eine Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren. Wachsen Sie S.mutans und C.albicans auf Blut-Agar-Platten bei 37 Grad Celsius unter aeroben Bedingungen.

Dann übertragen Sie einzelne Kolonien jedes Organismus auf Reagenzgläser gefüllt mit fünf Milliliter Hirninfusion und wachsen sie für weitere 18 Stunden. Zentrifugieren Sie am nächsten Tag die Kulturen fünf Minuten lang bei 1,200 mal g und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in physiologischer Salzlinie wieder aus und passen Sie die OD 550 auf 0,5 für C.albicans und S.mutans an.

Verdünnen Sie dann die S.mutans Suspension eins bis zehn, um gleichwertige Konzentrationen zu erreichen. Pipette 50 Mikroliter sterile Speicheldrüsenlösung in die Brunnen einer optischen 96-Well-Platte für die Mikroskopie. Inkubieren Sie die Platte für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, dann waschen Sie die Platte dreimal mit 100 Mikroliter steriler physiologischer Kochsalzung und leeren Sie die Brunnen.

Fügen Sie 100 Mikroliter C.albicans Suspension zu jedem Brunnen, inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten, dann waschen Sie den Brunnen dreimal mit Kochchen. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum zu jedem Brunnen hinzu. Den Teller zwei Stunden lang bebrüten und dann dreimal mit Kochchen waschen.

Leeren Sie die Brunnen, aber lassen Sie ein 20-Mikroliter-Reservoir, um übermäßige Scherkräfte zu vermeiden. Fügen Sie 100 Mikroliter S.mutans Suspension und 150 Mikroliter BHI mit 5%Saccharose zu jedem Brunnen hinzu. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden oder länger.

Wenn Sie ältere Biofilme kultivieren, ersetzen Sie das Medium täglich. Am Ende der völkerübergreifenden Wachstumsphase den Teller fünfmal mit steriler physiologischer Kochsalzung waschen. Verwenden Sie für die ratiometrische pH-Bildgebung ein invertiertes konfokales Laserscanning-Mikroskop mit einer 63-fachen Öl- oder Wasser-Tauchlinse, einer 543-Nanometer-Laserlinie und einem spektralen Bildgebungssystem.

Verwenden Sie einen Inkubator, um die Mikroskopstufe auf 35 Grad Celsius zu erwärmen. Stellen Sie den Detektor für die gleichzeitige Detektion von grüner Fluoreszenz von 576 bis 608 Nanometern und roter Fluoreszenz von 629 bis 661 Nanometern ein. Wählen Sie dann eine geeignete Laserleistung und Verstärkung, um Über- und Unterbelichtung zu vermeiden.

Stellen Sie die Lochgröße auf eine Lufteinheit oder eine optische Scheibe von etwa 0,8 Mikrometern ein. Legen Sie dann die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel und die Scangeschwindigkeit auf zwei fest. Wählen Sie mit der Option Mittelwert einen Liniendurchschnitt von zwei aus.

Bereiten Sie 100 Mikroliter steriler physiologischer Salzin mit 0,4% Glucose, die auf pH-Wert sieben titriert sind, vor. Dann machen Sie eine Lagerlösung von C-SNARF-4 und fügen Sie den Farbstoff zu einer endletzten Konzentration von 30 Mikromolar hinzu. Leeren Sie einen der Brunnen mit dem reichübergreifenden Biofilm, der ein 20-Mikroliter-Reservoir hinterlässt, und fügen Sie die Saline mit Glukose und ratiometrischem Farbstoff hinzu.

Legen Sie die Platte auf die Mikroskopstufe und beginnen Sie mit der Bildgebung. Bereiten Sie eine Serie von 50 Millimolaren MES-Puffer titrated auf pH vier bis 7,8 in den Schritten von 0,2 pH-Einheiten bei 35 Grad Celsius. Pipette 150 Mikroliter jeder Pufferlösung in die Brunnen einer optischen 96-Well-Platte.

Fügen Sie den Farbstoff in einer Konzentration von 30 Mikromolaren in die puffergefüllten Brunnen und lassen Sie ihn fünf Minuten auslagern. Erwärmen Sie die Mikroskopstufe auf 35 Grad Celsius, und wählen Sie die gleichen Einstellungen wie für die zuvor beschriebene ratiometrische pH-Bildgebung. Stellen Sie die 96-Well-Platte auf die Mikroskopbühne und konzentrieren Sie sich auf den Boden der Brunnen.

Erfassen Sie grüne und rote Kanalbilder für alle Pufferlösungen. Nehmen Sie in regelmäßigen Abständen Bilder auf, bei dem der Laser ausgeschaltet ist, um den Detektorversatz zu korrigieren. Führen Sie das Kalibrierungsexperiment in dreifacher Ausführung durch und exportieren Sie alle Bilder als TIFF-Dateien.

Speichern Sie die grünen und roten Bilder in separaten Ordnern, und benennen Sie beide Dateireihen mit fortlaufenden Nummern um. Importieren Sie die Bilder in dedizierte Bildanalysesoftware wie ImageJ. Klicken Sie in den Bildern, die mit dem Laser aus aufgenommen wurden, auf Analysieren und Histogramm, um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität zu bestimmen.

Subtrahieren Sie diesen Wert von den Biofilmbildern, indem Sie auf Prozess, Mathematik und Subtrahieren klicken. Importieren Sie dann die beiden Bildserien in daime, und führen Sie eine schwellenwertbasierte Segmentierung der Roten Kanalbilder durch Klicken auf Segment, automatische Segmentierung und benutzerdefinierte Schwelle durch. Stellen Sie den niedrigen Schwellenwert über der Fluoreszenzintensität des Pilzzytoplasmas und den hohen Schwellenwert unterhalb der Intensität der Pilzzellwände und der Bakterien ein.

Übertragen Sie dann die Objektebene der segmentierten Bildserie in die grüne Kanalbildreihe, indem Sie auf Segment und Objektebene klicken. Löschen Sie Nicht-Objektpixel in der roten und grünen Kanalserie. Nun werden die Biofilmbilder aus Bakterien- und Pilzzellen gelöscht und können als TIFF-Dateien exportiert werden.

Importieren Sie die Bildserie wieder in ImageJ und teilen Sie die rote Bildserie selbst auf. Multiplizieren Sie dann das Ergebnis mit der ursprünglichen Bildreihe. Die resultierende Bildreihe ist identisch mit dem Original, außer dass alle Null-Intensitätspixel entfernt werden.

Wiederholen Sie den Vorgang mit der grünen Bildserie. Verwenden Sie als Nächstes den mittleren Filter bei beiden Bildserien, um Detektorgeräusche auszugleichen. Dividieren Sie das Grün durch die rote Bildreihe, die dann das Grün-Rot-Verhältnis für alle Objektpixel ergibt.

Robuste, reichübergreifende Biofilme entwickelten sich nach 24 und 48 Stunden in den Brunnenplatten. Einzelne Zellen und Ketten von S.mutans gruppiert um Pilzhyphen und große intrazelluläre Räume zeigten das Vorhandensein einer voluminösen Matrix. Der pH-Wert im extrazellulären Raum wurde mithilfe einer Nachschlagetabelle visualisiert.

Der extrazelluläre pH-Wert in den Biofilmen sank in den ersten fünf Minuten nach der Glukose-Exposition schnell. Danach verlangsamte sich die Versauerung und erreichte in der Regel Werte von 5,5 bis 5,8 nach 15 Minuten. Aufgrund der lokalen pH-Änderungen änderte sich die Fluoreszenzintensität in den Biofilmen im Laufe der Zeit.

Während der Bildsegmentierung wurden hohe und niedrige Schwellenwerte gewählt, um alle Bereiche, die von Bakterien- und Pilzzellen bedeckt sind, angemessen zu eliminieren. Die blauen und grünen Bereiche wurden durch die niedrigen bzw. hohen Schwellen eliminiert. Die sorgfältige Wahl der Bildaufnahmeparameter ist entscheidend, um einen guten Kontrast zwischen Bakterienzellen, Pilzzellen und der Biofilmmatrix zu erhalten.

Wenn reichübergreifende Biofilme in Durchflusszellen angebaut werden, können pH-Entwicklungen unter Strömungsbedingung überwacht werden, die diejenigen in der Mundhöhle imitiert. Die pH-Ratiometrie wurde eingesetzt, um lokale Gebiete in zahnärztlichen Biofilmen mit besonders niedrigem pH-Wert, sogenannten säureogenen Hotspots, zu identifizieren.