Name: Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung von Candida albicans im Magen-Darm-Trakt mittels fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Pilz-Mikrobiota-Interaktionen in vivo.

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Die Autoren danken Carolina Tropini, Katharine Ng, Justin Sonnenburg und KC Huang für die Anleitung bei der Entwicklung der FISH-Technik. Teresa O'Meara gab hilfreiche Kommentare zum Manuskript, und Miriam Levy half bei der Fotografie. Diese Arbeit wurde durch Die NIH-Stipendien R01AI108992, R01DK113788 und einen Burroughs Welcome Award in der Pathogenese der Infektionskrankheit unterstützt.

<ol><li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Bacher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Anti-fungal+Th17+Immunity+and+Pathology+Rely+on+Cross-Reactivity+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans.</a> Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).</li>
<li>Shao, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Candida+albicans+Positively+Calibrates+Systemic+Th17+Immunological+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).</li>
<li>Jiang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+Fungi+Recapitulate+the+Protective+Benefits+of+Intestinal+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria.</a> Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).</li>
<li>Iliev, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+Between+Commensal+Fungi+and+the+C-Type+Lectin+Receptor+Dectin-1+Influence+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis.</a> Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).</li>
<li>Fan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIF-1+alpha+and+LL-37+by+Commensal+Bacteria+Inhibits+Candida+Albicans+Colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization.</a> Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).</li>
<li>Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+Damage+and+Neutropenia+Are+Required+for+Candida+Albicans+Dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination.</a> PLoS Pathogens. 4 (2), e35(2008).</li>
<li>Yamaguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+Colonization+of+Candida+Albicans+Differs+in+Mice+Fed+Commercial+and+Purified+Diets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets.</a> Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).</li>
<li>Kadosh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Antifungal+Treatment+in+a+Diet-Based+Murine+Model+of+Disseminated+Candidiasis+Acquired+via+the+Gastrointestinal+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).</li>
<li>Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Fungal+Infections%3A+Epidemiology%2C+Diagnosis%2C+and+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment.</a> Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).</li>
<li>Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+Through+the+Mammalian+Gut+Triggers+a+Phenotypic+Switch+That+Promotes+Candida+Albicans+Commensalism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism.</a> Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).</li>
<li>Witchley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Morphogenesis+Programs+Control+the+Balance+between+Gut+Commensalism+and+Invasive+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection.</a> Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).</li>
<li>Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+Albicans+Cell-Type+Switching+and+Functional+Plasticity+in+the+Mammalian+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host.</a> Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).</li>
<li>Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+Cell-Mediated+Immunity+in+Candida+Albicans-Colonized+Gnotobiotic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice.</a> Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).</li>
<li>Guarner, J., Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+Diagnosis+of+Fungal+Infections+in+the+21st+Century%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).</li>
<li>Johansson, M. E., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+Mucus+in+Histological+Sections%2C+Immunostaining+of+Mucins+in+Fixed+Tissue%2C+and+Localization+of+Bacteria+with+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH.</a> Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).</li>
<li>Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+and+Composition+of+the+Mucosal+Flora+in+Patients+with+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).</li>
<li>Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Amino+Acid+Liquid+Synthetic+Medium+for+the+Development+of+Mycelial+and+Yeast+Forms+of+Candida+Albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Sabouraudia%22%5BJournal%5D)">An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans.</a> Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).</li>
<li>Banerjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UME6%2C+a+Novel+Filament-Specific+Regulator+of+Candida+Albicans+Hyphal+Extension+and+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).</li>
<li>Earle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Gut+Microbiota+Spatial+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization.</a> Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).</li>
<li>Sokol, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+Microbiota+Dysbiosis+in+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD.</a> Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Visualisierung von C. Albicans Hefen und Hyphen in den GI-Trakten von commensally kolonisierten Mäusen jeden Geschlechts oder Stammes. Die FISH-Sonde hybridisiert zu 23S rRNA, die über das Pilzzytoplasma verteilt ist. Unsere Methode wurde von einem zuvor berichteten Protokoll zur Visualisierung von Darmbakterien20angepasst. Da C. albicans seine Morphologie innerhalb des Hosts ändert, ist die Methode nützlich, um die Pilzzellform sowie die Lokalisierung zu überwachen. Zum Beispiel haben wir diese Methode verwendet, um die Hypothese zu widerlegen, dass Hefen im gesamten Verdauungstrakt vorherrschen, und Um Diskrepanzen zwischen den In-vivo- und In-vitro-Phänotypen bestimmter "filamentationsdefekter" Mutantenaufzudecken 12.
Für die C. albicans commensal Colonization gibt es mehrere Mausmodelle. Die Mikrobiota von Labormäusen und Menschen sind unterschiedlich und bei Mäusen ist der Einsatz von Antibiotika oder einer spezialisierten Ernährung erforderlich, um eine stabile Besiedlung zu etablieren. Die Behandlung mit Antibiotika verbessert auch die Besiedlung von C. albicans beim Menschen und ist ein wichtiger Risikofaktor für die disseminierte Krankheit10. Die in dieser Studie verwendeten Antibiotika sind relativ kostengünstig und führen zu zuverlässigen Abnahmen der bakteriellen Mikrobiota. Beachten Sie, dass Antibiotika verwendet werden, um die Belastung von antagonistischen Bakterienarten zu verringern, nicht um alle Bakterien von den Tieren zu beseitigen. Wenn Forscher C. albicans-Wirt-Wechselwirkungenin Abwesenheit von Bakterien untersuchen oder den Einsatz von Antibiotika oder einer speziellen Ernährung vermeiden wollen, können keimfreie Tiere durch konventionell aufgezogene Tiere ersetzt werden; gnotobiotische Mäuse weisen jedoch bestimmte immun- und anatomische Anomalien auf und sind daher möglicherweise nicht für alle Zwecke geeignet.
Mehrere Schritte sind wichtig für eine erfolgreiche FISH-Färbung: Die empfohlene Fixierungsmethode ist entscheidend, um die strukturelle Integrität von GI-Geweben zu erhalten, insbesondere den zerbrechlichen Inhalt des Darmlumens, wie z. B. die Schleimschicht und die dreidimensionale Organisation von Pilzen und Bakterien16. Bitte beachten Sie, dass viele häufig verwendete Fixierungslösungen, die Wasser enthalten, die Luminalarchitektur stark schädigen. Die in diesem Protokoll empfohlenen Fixierungs- und Lösungslösungen für Nachfixierungswashen enthalten kein Wasser, und es ist wichtig, eine Kontamination mit Wasser zu vermeiden. Ein weiterer kritischer Schritt ist der Hybridisierungsschritt, bei dem es wichtig ist, die Verdunstung der Hybridisierungslösung während der Inkubation von Dias im Hybridisierungsofen zu vermeiden. Wir empfehlen, die Dias in einen wasserdichten Behälter zu legen, um dieses Problem zu vermeiden. Alternativ kann man wasserdichte Hybridisierungskammern verwenden, wie sie ursprünglich für die Hybridisierung von Mikroarrays verwendet wurden.
Eine C. albicans-spezifische FISH-Sonde wird in diesem Protokollbeschrieben. Da jedoch viele im Labor gezüchtete Mäuse keine C. Albicans oder andere Pilze als Teil ihrer natürlichen Darmmikrobiota enthalten, kann eine Panfungalsonde c. albicans bei experimentell besiedelten Tieren spezifisch färben. Die Substitution einer Panfungalsonde kann aufgrund ihrer überlegenen Hybridisierungseigenschaften und eines höheren Signal-Rausch-Verhältnisses wünschenswert sein. Wenn die Panmykogalsonde als pseudospezifische Sonde für C. albicansverwendet wird, ist es wichtig, einen Mangel an Färbung bei nicht infizierten Tieren zu dokumentieren (d.h. mit Antibiotika behandelt, aber nicht Mit C. albicans). Die Färbung eines nicht kolonisierten Kontrolltiers ist auch nützlich, um Hintergrundfärbungen zu bewerten, die sich aus der Einhaltung von FISH-Sonden an Lebensmittelpartikeln ergeben können. Insgesamt bietet die Verwendung von FISH-Sonden eine verbesserte Spezifität gegenüber den meisten anderen Methoden der Färbung von Pilzen, wie Calcofluor weiß (die Chitin färbt, eine Zellwandkomponente, die zwischen Zelltypen variieren kann), GMS oder kommerziell erhältliche antimykotische Antikörper. Darüber hinaus ermöglicht die FISCHfärbung die Costainierung mehrerer Organismen mit differenziell gekennzeichneten FISH-Sonden zu artspezifischen rRNAs.
Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass bestimmte C. albicans Hefezellentypen durch FISH sehr ähnlich erscheinen (z. B. die opaken und GUT-Zelltypen). Um zwischen diesen Zelltypen zu unterscheiden, wäre es sinnvoll, Hybridisierungssonden zu zelltypspezifischen Pilz-mRNAs zu entwickeln. Dennoch hat die FISH-Technik in ihrer aktuellen Form bereits überraschende Diskrepanzen zwischen dem In-vivo- und in-vitro-Verhalten von C. Albicans-Mutanten, die unter beiden Bedingungen12bewertet wurden, aufgedeckt, was auf komplexe Wechselwirkungen in der natürliche komonsale Umgebung, die durch bestehende In-vitro-Assays nicht ausreichend nachgeahmt werden. Weitere Studien mit verschiedenen C. Albicans Flecken in zusätzlichen wildEn Typ und mutierten Wirten werden wahrscheinlich zusätzliche Einblicke in Pilz-Wirt-Wechselwirkungen liefern. Insbesondere wird es lehrreich sein, C. albicans in Modellen von entzündlichen Darmerkrankungen zu profilieren, die mit hohen Titern von C. albicans beim Menschen verbunden sind21, und andere Modelle von C. albicans Überwucherung und Krankheit. Die FISH-Technik kann auch mit Immunhistochemie kombiniert werden, um bestimmte Wirtszellen zu färben. Insgesamt bietet die hier vorgestellte Methode ein relativ schnelles und zuverlässiges Mittel, um die Lokalisation und Morphologie von C. albicans innerhalb des Gi-Trakts der Säugetiere zu bestimmen.

Candida albicans ist ein Pilzkommensal sowie ein opportunistischer menschlicher Erreger. Diese Hefe fehlt eine definierte Umweltnische und stattdessen vermehrt sich innerhalb der Magen-Darm -(GI) Trakt, Haut, und Genitourinary Trakt von Menschen und anderen Säugetieren1. Während sich die frühe Forschung an C. albicans in erster Linie auf sein Virulenzpotenzial konzentrierte, deuten mehrere aktuelle Berichte darauf hin, dass die commensal vermehrende Organismen im Darm eine wichtige Rolle bei der normalen Gesundheit spielen können, einschließlich der Immunentwicklung der Host2,3,4. Um Untersuchungen des C. albicans-Commensalismus innerhalb des Säugetierdarms zu erleichtern, entwickelten wir ein Mausmodell der stabilen GI-Kolonisation und eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)-basierte Methode zur Visualisierung von Pilzhefezellen und Hyphen innerhalb der Darmlumen.
Mit einigen Ausnahmen5zeigen im Labor gezüchtete Mäuse in der Regel Resistenzen gegen Pilzbesiedlung des Verdauungstraktes. Es wird angenommen, dass die Kolonisationsresistenz durch bestimmte Bakterienarten vermittelt wird; dies kann jedoch durch die Behandlung der Tiere mit Antibiotika6,7 oder die Verwendung einer chemisch definierten Ernährung überwunden werden, die vermutlich dieZusammensetzungder Bakterienarten 8,9verändert. In ähnlicher Weise wurde beim Menschen die Verwendung von Breitspektrum-Antibiotika mit C. albicans Überwucherung und Verbreitung10in Verbindung gebracht. Unser murines Kolonisationsmodell verwendet Breitspektrum-Antibiotika, um C. albicans Kolonisierung von immunkompetenten, konventionell aufgezogenen Mäusen zu etablieren. Penicillin und Streptomycin werden im Trinkwasser der Tiere eine Woche vor dem Gavage mit 108 koloniebildenden Einheiten (KBE) von C. albicans zur Verfügung gestellt. Solange das mit Antibiotika infundierteWasser fortgesetzt wird, werden sich C. Albicans durch den GI-Trakt ausbreiten und Fäkalientiter von 106x 108 KBE/g erreichen. Trotz der hohen Pilzbesiedlung bleiben die Tiere gesund und gewinnen mit der gleichen Geschwindigkeit an Gewicht wie nicht infizierte Kontrollen. Dieses Modell wurde erfolgreich verwendet, um mehrere C. albicans Commensalism Faktoren11,12zu überprüfen und zu charakterisieren.
Wie andere Mitglieder des Pilzreichs ist C. albicans in der Lage, enorme morphologische Plastizität13. Unter In-vitro-Bedingungen hat sich gezeigt, dass es zwischen mindestens sechs einzelligen Hefezelltypen sowie multizellulären Hyphen und Pseudohyphae übergeht. Der Hefe-zu-Hyphen-Übergang ist eines seiner am besten charakterisierten Virulenz-Attribute, und Hyphase und Pseudohyphae überwiegen in den meisten Säugetier-Krankheitsmodellen sowie in infizierten menschlichen Geweben. Um die Lokalisation und Zellmorphologie von C. albicans innerhalb des murinen Verdauungstraktes zu bestimmen, haben wir eine FISH-Technik zur Färbung von Hefen und Hyphen in festen histologischen Abschnitten entwickelt. Die Sonden bestehen aus fluoreszierend gekennzeichneten DNA-Oligonukleotiden, die zu pilzgaler 23S-ribosomaler RNA (rRNA) hybridisieren, die über das Pilzzytoplasma verteilt ist. Da Wirtsgewebe so fixiert sind, dass die dreidimensionale Architektur des Darms, einschließlich der Wirtsschleimhaut, des Verdauungsmaterials, der bakteriellen Mikrobiota und des Schleims im Darmlumen, erhalten bleibt, ermöglicht diese Technik die Lokalisierung von Pilzen Zellen in Bezug auf diese Landmarken, wenn sie befleckt werden. Die FISH-Technik vergleicht sich günstig mit traditionellen histologischen Flecken für Pilze, wie Periodische Säureschiff (PAS) oder Gomoris Methenamin-Silber (GMS), sowie kommerziell erhältliche Antimykotika, da diese Reagenzien nicht spezifisch für C. albicans. Darüber hinaus entfernen Standardfixative die Schleimschicht und stören andere Inhalte des Darmlumens14,15.
In diesem Artikel enthalten wir detaillierte Anweisungen für die Etablierung von hochgradigen C. albicans Kolonisation der Maus GI-Trakt, für die Zerlegung des Verdauungstraktes von eingeschläferten Tieren, für Gewebefixierung in einer Weise, die Luminal und zum Nachweis von C. albicans in Wirtgeweben mit FISH. Neben wilden Typen und mutierten Stämmen von C. albicans kann die Gavage-Technik verwendet werden, um andere Mikroorganismen zu liefern. Die Fixierungstechnik wäre nützlich für jede Studie, in der die Erhaltung des Darminhalts gewünscht ist. Das FISH-Verfahren kann innerhalb eines Tages abgeschlossen werden und kann verwendet werden, um mehrere Pilzarten mithilfe mehrerer, differenziell gekennzeichneter Sonden zu lokalisieren.

<table><tbody><tr><td>1 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td>kann von jedem Hersteller substituiert werden</td></tr><tr><td>BHI-Blutagar</td><td></td><td></td><td>kann von jedem Hersteller ersetzt werden</td></tr><tr><td>C. albicans FISH-Sonde</td><td>IDT DNA Technologies</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Kammer für Hybridisierung, Inkubation</td><td></td><td></td><td>wasserdichte Kammer zur Reduzierung der Verdunstung</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>>=99,5%</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td>Roche 10236276001</td><td>kann von jedem Anbieter substituiert werden</td></tr><tr><td>Empfindliche Aufgabe Wischergewebe</td><td>Kimberley-Clark</td><td>34256CT</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-5KG</td><td>kann von jedem Anbieter ersetzt werden</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Molekularbiologie-Qualität</td></tr><tr><td>Ernährungsnadeln</td><td>Cadence, Inc.</td><td>7910</td><td>Metall; 20 X1-1/2" W/2-1/4; autoklavierbar zur Sterilisation</td></tr><tr><td>FITC-UEA-1</td><td>Sigma</td><td>L9006-1MG</td><td>andere Fluorophore verfügbar</td></tr><tr><td>FITC-WGA</td><td>Sigma</td><td>L4895-2MG</td><td>andere Fluorophore verfügbar</td></tr><tr><td>Schaumstoffpolster</td><td>Fisher</td><td>22038221</td><td>Bestellen Schaumstoffpads, die in Kassetten passen</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>47671</td><td>Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MK881746</td><td>ACS-Reagenz, >=99,5</td></tr>%<tr><td>Glas Coplin-Glas</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td>hält bis zu 10 Objektträger Rücken an Rücken</td></tr><tr><td>Histologie-Kassetten</td><td>Simport</td><td>M512</td><td>Tiefe Kassetten, damit Blinddarm nicht gequetscht wird</td></tr><tr><td>Hybridisierungs-Deckgläser</td><td>Sigma</td><td>GBL712222</td><td>RNasefreier</td></tr><tr><td>Hybridisierungsofen</td><td></td><td></td><td>kann von jedem Hersteller substituiert werden</td></tr><tr><td>LB</td><td></td><td></td><td>kann von jedem Hersteller substituiert werden</td></tr><tr><td>Lee's Medien</td><td></td><td></td><td>hergestellt wie in Lee et al. 1975</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td>ACS Reagenz, >=99,8</td></tr>%<tr><td>Mice</td><td>Charles River Laboratories</td><td>028</td><td>Erwachsene BALB/c; 18-21 Gramm (8-10 Wochen)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher</td><td>50-980-487</td><td>16%ige Lösung</td></tr><tr><td>Parrafinwachs</td><td>Sigma</td><td>P3558-1KG</td><td>Paraplast zur Gewebeeinbettung</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit</td><td>CCFAL003</td><td>Calcium, magnesiumfrei; kann von jedem Hersteller substituiert</td></tr><tr><td>werden Penicillin G</td><td>Sigma</td><td>PENNA-100MU</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Dextrose-Agar</td><td></td><td></td><td>kann sein substituierbar von jedem Hersteller</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>2F7123</td><td>steril, kann von jedem Hersteller substituiert werden</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>kann von jedem Hersteller substituiert werden; beibehalten RNase-freies</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>kann von jedem Hersteller ersetzt werden; erhalten RNase-freies</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>S9137-100G</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td>kann von jedem Hersteller ersetzt werden</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>kann von jedem Hersteller ersetzt werden; erhalten RNase-frei</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>enthält keine DAPI-Xylole</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>214736</td><td>Reagenzqualität</td></tr><tr><td>YEPD</td><td></td><td></td><td>kann verwendet werden Ersetzt durch einen beliebigen Anbieter</td></tr></tbody></table>

visualisierung von candida albicans im murine gastrointestinal tract mit fluoreszierender in-situ-hybridisierung

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans ist ein Pilzbestandteil der Darmmikrobiota beim Menschen und vielen anderen Säugetieren. Obwohl C. albicans keine Symptome bei den meisten kolonisierten Wirten verursacht, dient das Vorkommensbecken für Infektionskrankheiten, und das Vorhandensein von hohen Pilztittern im Darm ist mit entzündlichen Darmerkrankungen verbunden. Hier beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung der Zellmorphologie und Lokalisation von C. albicans in einem Mausmodell der stabilen gastrointestinalen Kolonisation. Die Kolonisation wird mit einer Einzeldosis von C. albicans bei Tieren, die mit oralen Antibiotika behandelt wurden, festgestellt. Segmente des Darmgewebes werden so fixiert, dass die Architektur der luminalen Inhalte (Mikroorganismen und Schleim) sowie der Wirtsschleimhaut erhalten bleibt. Schließlich wird die fluoreszierende In-situ-Hybridisierung mit Sonden gegen Pilz-rRNA durchgeführt, um C. Albicans und Hyphen zu färben. Ein wesentlicher Vorteil dieses Protokolls ist, dass es die gleichzeitige Beobachtung der C. albicans Zellmorphologie und deren räumliche Assoziation mit Wirtsstrukturen während der gastrointestinalen Kolonisation ermöglicht.

Nach den Anweisungen wird das Ergebnis dieser Technik eine fluoreszierende Kennzeichnung von Kernen im Wirtsepithel, Schleim und C. Albicans in abschnitten GI-Geweben sein. Wildtyp Candida albicans Zellen sollten entweder als runde, einzellige Hefezellen oder hochlängsige, manchmal verzweigte, multizelluläre Hyphen erscheinen (Zellzellteilungen werden im Hyphen nicht sichtbar sein). Mutanten von C. albicans können zusätzlich als kleinere, leicht längliche "graue" Hefen oder als größere, leicht längliche "GUT" (gastrointestinal-induzierter Übergang) oder "undurchsichtige" Hefen auftreten.
Abbildung 1 zeigt die Fütterungsnadel, die für die Oral-Gavage verwendet wird, sowie Schlüsselpositionen der Nadel während des Gavage-Verfahrens. Abbildung 2 enthält ein typisches Setup für die Organsektion und das Aussehen von GI-Segmenten der Maus.
Abbildung 3 zeigt die FISH-Färbung verschiedener C. albicans-Zelltypen nach der Vermehrung in vitro und innerhalb des Mausmodells. Abbildung 3A zeigt Fluoreszenz- und Phasenbilder von festen, permeabilisierten, in vitro vermehrten Hyphen. Hypha-Bildung wurde mit flüssigem Lees Medium18 mit 2% N-Acetylglucosamin, pH 6,8 bei 37 °C induziert. Abbildung 3B zeigt Fluoreszenz- und Phasenbilder von festen, permeabilisierten, in vitro vermehrten Hefezellen. Abbildung 3C,D zeigt feste, permeabilisierte, in vitro vermehrte GUT-Zellen bzw. undurchsichtige Zellen. GUT- und opake Zelltypen sind morphologisch nicht unterscheidbar, außer wenn sie durch Rasterelektronenmikroskopie visualisiert werden. Bitte beachten Sie, dass die FISCHfärbung von in vitro vermehrten Zellen suboptimal ist, wenn die Zellen nicht gut durchmeabilisiert sind. Ein Beispiel für schwache und diffuse Färbung ist in Abbildung 3Cdargestellt. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten die Bedingungen für die Zellfixierung und Permeabilisierung empirisch für jeden zu untersuchenden Zelltyp und jede zu untersuchende Art bestimmt werden. Glücklicherweise führt das empfohlene Protokoll zur Visualisierung von C. albicans in geschnittenen Geweben zu einer konsistenteren Permeabilisierung.
Abbildung 3E-G zeigt C. Albikane im Maus-Dickdarm, gefärbt mit der C. albicans-spezifischenSonde (Abbildung 3E) oder der Panfungalsonde (Abbildung 3F,G). C. albicans erscheint rot in diesen Bildern, Wirtszellenkerne sind blau, und die Schleimschicht ist grün. Sowohl runde Hefen als auch hochlänglich ierte Hyphen (weiße Pfeilspitzen) kommen im Dickdarm vor. Bitte beachten Sie, dass die Färbung mit der Panfungalsonde heller ist. Abbildung 3G zeigt eine Ume6-Mutation im selben Fach, gefärbt mit der Panfungalsonde. Ume6 kodiert einen Transkriptionsfaktor, der für die Hypha-Bildung unter In-vitro-Bedingungen erforderlich ist19 . Interessanterweise wird der Hefe-gesperrte Phänotyp, der von diesem Mutanten unter In-vitro-Bedingungen angezeigt wird, nicht innerhalb des Darms rekapituliert, was darauf hindeutet, dass ein redundanter Faktor innerhalb des Hosts aktiviert werden muss12. Abbildung 4 zeigt das Auftreten von wilden Typ C. Albicans in verschiedenen Segmenten des murinen GI-Traktes, einschließlich der Regionen, die unmittelbar an die Wirtsschleimhaut angrenzen, und zentraleren Regionen des Darmlumens.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig01.jpg"> Abbildung 1: Wichtige Zuführnadelpositionen während der Gavage. (A) Fütterungsnadel. (B) Nadelkugel an der Seite der Zunge einstecken. (C) Fütterungsnadel in aufrechter Position mit Einsetzen in die Speiseröhre. (D) Fütterungsnadel in den Magen mit ein paar Millimetern sichtbar über der Nase eingesetzt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiel-Sezierlayout. (A) Abschnittspad und Werkzeuge. (B) Verbrauchsteuer-Trakt. Proximale (Ösophagus) zu distalen (Anus) Abschnitten: I. Magen. II. Proximaler Dünndarm. III. Medialer Dünndarm. IV. Distaler Dünndarm. V. Cecum. VI. Dickdarm. Rosa gestrichelte Rahmenkästen zeigen das zu fixierende Gewebe an. (C) Gewebe, die in Kassetten angeordnet sind. Römische Ziffern sind die gleichen wie in Panel B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig03.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Bilder von FISH-befleckten C. albicans. (A) FISH of C. albicans hyphae grown in liquid Lee es media18 with 2% N-acetylglucosamine, pH 6.8. (B) FISH von C. Albicans runden Hefezellen, die auf YEPD angebaut werden + 2% Agarplatten. (C) FISH von C. albicans GUT-Zellen (ySN1045), die auf YEPD angebaut werden + 2% Agarplatten. (D) FISH von C. albicans opaken Zellen, die auf YEPD angebaut werden + 2% Agarplatten. (E) Wilde Typ C. Albikane (ySN250) im Dickdarm, mit der C. albicans-spezifischenSonde gefärbt. (F) Wilde Typ C. Albikane im Dickdarm, mit der Panfungalsonde gefärbt. (G) Ume6 Mutant (ySN1479) im Dickdarm, mit der Panfungalsonde gefärbt: rot ist C. albicans, blau ist Wirt epitheliale Kerne, und grün ist Mucin. Pfeilspitzen zeigen Hyphen an. Pfeile zeigen Hefe an. Maßstabsbalken = 20 m. Die Bilder F und G sind von Witchley et al.12adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig04.jpg"> Abbildung 4: Aussehen von FISH-befleckten C. Albicans in verschiedenen Darmfächern. Wildtyp C. albicans wird in den angegebenen Segmenten des Maus-GI-Trakts angezeigt. In jedem Fach zeigen Bilder den Bereich neben der Wirtsschleimhaut und den zentralen Bereich des Darmlumens. Die Färbung wurde mit der Panfungalsonde durchgeführt. Skala bar = 20 'm. Bilder sind von Witchley et al.12adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Antibiotika-Bestände (200x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penicillin G</td>
			<td>181 mg/ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Streptomycin</td>
			<td>400 mg/L</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Methacarn</td>
		</tr>
<tr>
<td>vorrat</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>Einheiten</td>
		</tr>
<tr>
<td>Methanol</td>
			<td>60%</td>
			<td>300</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>chloroform</td>
			<td>30%</td>
			<td>150</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eissäureessig</td>
			<td>10%</td>
			<td>50</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Hybridisierungslösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>vorrat</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>Einheiten</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl, pH 7,4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>20</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M NaCl</td>
			<td>0,9 M</td>
			<td>180</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% SDS</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% Formamid</td>
			<td>1.00%</td>
			<td>10</td>
			<td>L (in kleinen Aliquots bei -20 °C zwischen den Verwendungen gehalten)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNasefreies Wasser</td>
			<td></td>
			<td>780</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">FISH Waschlösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl, pH 7,4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>1</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M NaCl</td>
			<td>0,9 M</td>
			<td>9</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNasefreies Wasser</td>
			<td></td>
			<td>40</td>
			<td>ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Mucin-nuclei Färbelösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI, 10 g/ml</td>
			<td>20 ng/ml</td>
			<td>2</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lektin, 40 g/ml</td>
			<td>1,6 g/ml</td>
			<td>40</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS, pH 7,4</td>
			<td></td>
			<td>958</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Typische Mengen und Konzentrationen von Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.

Der Zweck dieses Protokolls ist es, Candida albicans Zellform und Lokalisation im Magen-Darm-Trakt des Säugetiers zu visualisieren.

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Dieses Protokoll hat einige der besten Erkenntnisse, die wir bisher haben, darüber, wie Candida albicans den Magen-Darm-Trakt der Säugetiere bewohnt. Zum Beispiel wussten wir bis vor kurzem nicht wirklich, wo Candida im Darm lokalisiert ist oder welche seiner vielen morphologischen Formen es in dieser Nische annimmt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es ermöglicht, Candida in seiner natürlichen Umgebung zu visualisieren, ohne die dreidimensionalen Wechselwirkungen des Pilzes mit Wirtsstrukturen oder mit Bakterien in der Mikrobiota zu stören.Da der Darm eine komplexe Umgebung ist, ist es sehr schwierig, im Labor zu modellieren und daher war es sehr befriedigend, einen Weg zu finden, Candida Biologie direkt in einem Wirtsmodell zu erforschen. Bestimmte Komponenten der Darmmikrobiota einschließlich Candida albicans stehen im Verdacht, rollen bei Krankheiten wie entzündlichen Darmerkrankungen. Diese Technik kann möglicherweise verwendet werden, um das Vorhandensein spezifischer Mikroorganismen in Biopsieproben von Patienten zu diagnostizieren.Die Beherrschung der Gavage-Technik und die Fähigkeit, Magen-Darm-Segmente zu sezieren, ohne die Organe zu zerreißen, ist wichtig, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Zu Beginn, gavage jedes Tier mit dem berechneten Volumen eines bestimmten Inokulum. Befestigen Sie eine autoklavierte Tierfütterungsnadel an einer Ein-Milliliter-Spritze und füllen Sie die Spritze mit einem Gavage-Volumen, um sicherzustellen, dass alle Blasen entfernt werden.Legen Sie die Spritze auf eine sterile Oberfläche. Um das Tier zu sichern, halten Sie es an der Basis des Schwanzes mit der dominanten Hand und schieben Sie die nicht dominante Hand auf den Rücken des Tieres auf die lockere Haut direkt hinter den Ohren. Sammeln Sie den Scruff fest mit Daumen und Zeigefinger zusammen.Nehmen Sie das Tier durch die Scruff, kippen Sie es um und schleifen Sie den kleinen Finger der gleichen Hand um den Schwanz, um das Tier gegen die Handfläche zu immobilisieren. Erweitern Sie den Kopf des Tieres sanft, so dass er in einer geraden Linie mit dem Körper ist. Nehmen Sie dann die Spritze mit der dominanten Hand auf und halten Sie sie senkrecht zum Tier mit der gekrümmten Nadel nach unten.Verwenden Sie die Kugel der Nadel, um sanft eine innere Ecke des Mundes zu haken und die Nadel entlang der Seite des Mundes auf die Rückseite des Rachens zu schieben, dann bewegen Sie die Nadel in die Mitte. Sobald sich die Kugel der Nadel an der Rückseite des Rachens des Tieres befindet, kippen Sie die Nadel nach oben, so dass sie parallel zur Körperlinie des Tieres ist, und lassen Sie sie sanft die Kehle hinuntergleiten. Wenn die Nadel nicht glatt in den Hals gleitet, ist die Nadel möglicherweise nicht richtig positioniert und sollte zurückgezogen werden, um sich neu zu positionieren und es erneut zu versuchen.Bringen Sie die Nadel sanft voran, so dass das Tier die Nadel schlucken kann, bis nur wenige Millimeter sichtbar bleiben. Testen Sie, ob sich die Kugel der Nadel im Magen befindet, indem Sie den Kolben sanft voranbringen, und wenn kein Widerstand vorhanden ist, setzen Sie die Abgabe des Inokulums fort. Ziehen Sie die Nadel nach der Verabreichung des Inokulums langsam ab und legen Sie das Tier in seinen Käfig.Überwachen Sie das Tier fünf bis zehn Minuten lang auf Anzeichen von atemgedauerter Atmung oder Seenot und überprüfen Sie, ob es kurz nach dem Gavage wieder normal aktiv wird. Wenn das gleiche Inoculum für das nächste Tier verwendet wird, reinigen Sie die Nadel mit einem Alkoholtücher. Wenn ein anderes Inokulum verwendet wird, ersetzen Sie die Nadel.Verwenden Sie stumpfe Zange, um einen Abschnitt der Bauchhaut zu kneifen und die Haut und die darunter liegende Faszie in der Nähe der Beckenbasis mit einer Schere zu prägnieren. Verlängern Sie den Schnitt in einer U-Form entlang jeder Seite der Peritonealhöhle bis zum Brustkorb, und heben Sie dann die Haut aus dem Weg. Verwenden Sie stumpfe Zangen, um das Cecum vorsichtig aus der Peritonealhöhle mit einer Schere zu extrahieren, um die Verbindungen zwischen dem Cecum und dem kleinen und großen Darm zu trennen.Legen Sie das gesamte Cecum in eine Histologiekassette, so dass es ungedreht ist und flach liegt. Legen Sie das zweite Schaumstoffpad oben und schließen Sie die Kassette. Dann legen Sie die Kassette in ein Schraubverschlussglas mit Methacarn.Verbrauchen Sie den Abschnitt des Dickdarms, der ein bis zwei Fäkalienpellets enthält und eine Länge hat, die kleiner ist als die der Kassette. Legen Sie das Gewebe in die Kassette, so dass es flach und ungedreht bleibt. Überlagern Sie es mit dem zweiten Schaumstoffpad, schließen Sie die Kassette und legen Sie sie in das Methacarn.Für jeden Abschnitt des Dünndarms, der beprobt werden soll, wird ein ein bis zwei Zentimeter großes Segment, das etwas Verdauungsmaterial enthält, verbrauchen. Legen Sie das Gewebe in die Kassette, überlagern Sie mit dem zweiten Schaumstoffpad, schließen Sie die Kassette und legen Sie sie in das Methacarn. Beim Ausatmen des Magens, trennen Sie die Verbindungen zur Speiseröhre und dem Dünndarm.Legen Sie das Gewebe in die Kassette und legen Sie die Kassette in das Methacarn. Lassen Sie die Kassetten in der Methacarn-Lösung bei Raumtemperatur für mindestens drei Stunden, aber weniger als zwei Wochen. Entfernen Sie nach der Fixierung die Schaumstoffpads und geben Sie jeden intakten Gewebeabschnitt in die Kassette zurück.Dann waschen Sie das Gewebe zweimal für 35 Minuten in 100%Methanol, zweimal für 25 Minuten in 100%Ethanol und zweimal für 20 Minuten in Xylol. Die Kassetten trocken auf ein Papiertuch klopfen und in einem vorgeschmolzenen Paraffinwachs zwei Stunden bei 70 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen unterbringen. Dann entfernen Sie die Kassetten aus dem Wachs, lassen Sie das überschüssige Wachs abtropfen und lagern Sie es bei Raumtemperatur, bis sie in Wachsblöcke eingebettet sind.De-Wachs das Paraffin eingebettet histologische Abschnitte durch Einsetzen der Dias in ein vorgewärmtes Glas mit Xylol gefüllt. Lassen Sie das Glas bei 60 Grad Celsius für 10 Minuten, dann entsorgen Sie die Xylol-Wäsche. Gießen Sie frische Raumtemperatur Xylol in das Glas und wiederholen Sie die Inkubation.Dann füllen Sie das Glas mit 100%Ethanol und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach der Inkubation die Dias aus dem Glas entfernen und an der Luft trocknen. Um die C.albicans mit einer Fischsonde zu färben, beginnen Sie mit einem Pat Pen einen Kreis um den Gewebeabschnitt zu ziehen.Pipette 50 Mikroliter Sonde mit Hybridisierungslösung auf das festinstallierte Gewebe und sanft mit der Pipettenspitze verteilen. Überlagern Sie die Flüssigkeit mit einem Hybridisierungs-Abdeckungsslip, der dafür sorgt, Dassblasen zu vermeiden sind. Dann versiegeln Sie die Dias in einer wasserdichten Hybridisierungskammer und bebrüten die Abschnitte drei Stunden lang bei 50 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen im Dunkeln.Nach der Inkubation die Waschlösung in ein Coplin-Glas geben. Entfernen Sie den Deckelrutsch vorsichtig mit Zangen von der Rutsche und legen Sie die Rutsche in die Waschlösung. Bedecken Sie das Glas mit Aluminiumfolie und bebrüten Es bei 50 Grad Celsius für 20 Minuten.Als nächstes waschen Sie die Dias, indem Sie die Waschlösung ausgießen und das Glas mit PBS nachfüllen. Sofort abgießen und mit frischem PBS nachfüllen, der den Prozess für insgesamt zwei Wähbe wiederholt. Wick weg die PBS mit einer empfindlichen Aufgabe wischen und kreisen Die Darmgewebe Abschnitt mit einem Pat Pen.Legen Sie die Dias in einen undurchsichtigen Kunststoffbehälter und fügen Sie 50 Mikroliter Mucin-Kernfärbungslösung in den Gewebebereich ein. Bedecken Sie den Behälter mit Aluminiumfolie und bebrüten Ihn 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation die Dias in ein Coplin-Glas geben und zweimal mit PBS waschen.Tippen Sie auf die überschüssige PBS auf einem Papiertuch und leiten Sie dann die letzten Tropfen mit einem Gewebe ab. Legen Sie einen Tropfen Montagemedium auf jedem Abschnitt und überlagern Sie es mit einem Glasdeckel, der dafür sorgt, dass Blasen verhindert werden. Lassen Sie das Montagemedium unter dem gesamten Deckschein verteilen.Verankern Sie den Deckelrutsch mit Nagellack an den Ecken und stellen Sie die Dias mit einem Fluoreszenzmikroskop ab. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um C.albicans in vitro und in Wirtsgewebe fluoreszierend zu kennzeichnen. In-vitro-vermehrte Hyphen, runde Hefezellen, Darmzellen und undurchsichtige Zellen wurden fixiert, permeabilisiert und mit Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie unterschieden.Runde Hefen und hochlängige Hyphen wurden im Maus-Dickdarm abgebildet. Wirtsgewebe wurden mit der C.albicans-spezifischen Sonde oder der Panfungalsonde gefärbt. C.albicans wurde als rot, Wirtszellkerne blau und die Schleimschicht grün beschriftet.C.albicans wurde in verschiedenen Segmenten des murinen GI-Trakts einschließlich der Regionen, die unmittelbar an die Wirtsschleimhaut angrenzen, und zentraleren Regionen des Darmlumens nachgewiesen. Für Wissenschaftler, die die Gavage-Technik noch nicht durchgeführt haben, ist es wichtig, eine spezielle Ausbildung zu erhalten, bevor sie diese Methode versuchen. Nach der Fischfärbung können immunfluoreszierende Techniken verwendet werden, um zusätzliche Merkmale der Wirtsschleimhaut zu färben.Dies kann eine Charakterisierung von Gewebeschäden oder Immunreaktionen des Wirts ermöglichen. Diese Technik hat es uns ermöglicht, die Beziehung zwischen pilzzellmorphologie von Candida albicans Mutanten und Überleben innerhalb des Wirts zu charakterisieren, was unser Verständnis der Candida albicans Biologie fördert, die bei der Entwicklung von Therapien genutzt werden kann.

visualization-candida-albicans-murine-gastrointestinal-tract-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die rasante Entwicklung, geringe Größe und Transparenz der Zebrafisch sind enorme Vorteile für das Studium der angeborenen Immunabwehr Kontrolle der...

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Quelle: Ng, K. M., Tropini, C. Visualisierung der Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung, Lektinfärbung und Bildgebung. J. Vis. Exp. (2021).Dieses Video demonstriert das Verfahren der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), um die Darmmikrobiota im Darmgewebe der Maus zu färben, indem fluoreszierende Sonden mit bakterieller rRNA (Ribosomal-Ribonukleinsäure) hybridisiert und die Wirtsstrukturen für mikroskopische Analysen gegenfärben werden.

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Darmbakterien in Maus-Darmschnitten

Dieses Video zeigt die Entwicklung eines in vivo Mausmodells zur Untersuchung der Biofilmbildung von Candida albicans im Unterhautgewebe. Bei dem Experiment werden Candida-infizierte Geräte in die Rückenregion des Tieres implantiert, um einen Biofilm zu bilden.

Candida albicans Biofilmbildung in einem in vivo Mausmodell

Wir präsentieren ein experimentelles Verfahren zur Entwicklung von Candida albicans-Biofilmen in einem subkutanen Mausmodell. Die Quantifizierung der Pilzbiofilme erfolgte durch Bestimmung der Anzahl der koloniebildenden Einheiten und durch eine nicht-invasive Biolumineszenzbildgebung, bei der die Menge des erzeugten Lichts der Anzahl der lebensfähigen Zellen entspricht.

Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt

Hier beschreiben wir eine mikroskopbasierte Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der frühen Kaskaden von Ereignissen während der Phagozytose von Krankheitserregern wie den Pilzen Candida albicans und Partikeln, die größer als 0,5 μm sind, einschließlich Zymosan und IgG-beschichteten Kügelchen.

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

Um die internen Merkmale von Candida albicans Biofilmen zu sehen und zu quantifizieren, bereiten wir feste intakte Proben vor, die durch Brechungsindex-Matching geklärt werden. Dann kann die optische Schnittmikroskopie verwendet werden, um dreidimensionale Bilddaten durch die volle Dicke des Biofilms zu erhalten.

Klärende und Bildgebung Candida albicans Biofilme

Der in dieser Studie beschriebene Ex-vivo-Assay mit Darmhomogenat-Extrakten und Immunfluoreszenzfärbung stellt eine neuartige Methode dar, um die Hypahypomorphogenese von Candida albicans im GI-Trakt zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Umweltsignale zu untersuchen, die den morphogenetischen Übergang im Darm regulieren.

Ein Ex-vivo-Assay zur Untersuchung von Candida albicans Hyphal Morphogenese im Magen-Darm-Trakt

Dieses optimierte Protokoll beschreibt einen Workflow zur Erkennung und Abbildung von Bakterien in komplexen Gewebeproben, von der Fixierung des Gewebes bis zur Färbung von Mikroben mit fluoreszierender In-situ-Hybridisierung .

Visualisierung von Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen durch Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung , Lektinfärbung und Bildgebung

Darmmikroben, einschließlich extrazellulärer Bakterien und intrazellulärer Krankheitserreger wie dem Orsay-Virus und Mikrosporidien (Pilze), sind oft mit wilden Caenorhabditis-Nematoden assoziiert. Dieser Artikel stellt ein Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung von Mikroben vor, die C. elegans-Nematoden besiedeln und/oder infizieren, und zur Messung der Erregerlast nach kontrollierten Infektionen im Labor.

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum Screening mittelgroßer Candida albicans-Mutantenbibliotheken auf Morphogenesephänotypen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt mittels nicht-invasiver konfokaler Mikroskopie.

Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt

Wir etablieren ein Mausmodell der C.albicans-assoziierten katheterassoziierten Infektion (CRI), in dem sich Biofilm auf dem Katheter bildet und die Interaktion zwischen C.albicans und Wirt gut mit der klinischen CRI korreliert. Dieses Modell hilft beim Screening von Therapien für C.albicans-Biofilm-assoziierte CRI und legt damit den Grundstein für die klinische Transformation.

Ein katheterbezogenes Candida albicans-Infektionsmodell in der Maus

Erfahren Sie die Visualisierung von Candida albicans im Magen-Darm-Trakt mittels fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Pilz-Mikrobiota-Interaktionen in vivo.

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

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