Name: Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Lernen Sie drei in vitro Assays zur Untersuchung der Migration und Interaktion zwischen humanen periventrikulären Endothelzellen und GABAergen Interneuronen. Diese einfachen, kostengünstigen Methoden ermöglichen Messungen über Zentimeter.

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Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen des National Institute of Mental Health (R01MH110438) und des National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01NS100808) an AV unterstützt.

1. Kultur und Lagerung menschlicher periventrikulärer Endothelzellen
<ol><li>Bewahren Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen auf Kellermembranmatrix-beschichtet (siehe Materialtabelle) 6-Well-Platten in periventrikulärem Endothelzellmedium (E6-Medium mit 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 und 5 'M GABA) bei 37 °C und 5%CO2. Wechseln Sie das Medium jeden alternativen Tag.</li>
	<li>Kellermembranmatrix in 4 °C auftauen und eine 1:100-Lösung herstellen, indem man sie in kaltem DMEM/F12-Medium verdünnt. Beschichten Sie jeden Brunnen einer 6-Well-Platte mit 1 ml Matrixlösung. Platten bei 37 °C für mindestens 1 h vor Gebrauch inkubieren.</li>
	<li>Lassen Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen eine Konfluenz von 80%-90% erreichen. Aspirieren Medium aus dem Brunnen. Waschen Sie die Brunnen einmal mit 1 ml sterilen 1x PBS pro Brunnen.</li>
	<li>Trennen Sie Zellen, indem Sie 1 ml Zelldissoziationslösung (siehe Materialtabelle)pro Brunnen hinzufügen. Bei 37 °C für 5 min inkubieren. Nach 5 min 1 ml periventrikuläres Endothelzellmedium hinzufügen. Übertragen Sie die Zelllösung in ein 15 ml konisches Rohr. HINWEIS: Wir verwenden Hier Accutase zur Zelldissoziation, im Gegensatz zu TrypLE in den Abschnitten 3 und 4.</li>
	<li>Zentrifugenzellen bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur, aspirieren sie den Überstand und setzen das Zellpellet in 1 ml periventrikulärem Endothelzellmedium wieder auf.</li>
	<li>Zählen Sie lebende Zellen mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode. Samenzellen in frischen Matrixplatten mit einer Dichte von 1,2 x 105 Zellen/cm2. Bei 37 °C und 5%CO2inkubieren.</li>
	<li>Speichern Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen durch Kryokonservierung im Gefriermedium (90% periventrikuläres Endothelzellmedium und 10% DMSO).<ol>
<li>Dissoziieren und sammeln Sie Zellen nach den Schritten 1.3 und 1.4 oben. Zählen Sie Zellen in der Lösung nach der Trypan-Blau-Ausschlussmethode.</li>
		<li>Zentrifugenzellen bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Den Überstand ansaugen und das Zellpellet bei 5 x 106 Zellen/ml Gefriermedium wieder aufsetzen.</li>
		<li>1 ml Gefriermedium plus Zellen pro Kryovial abgeben. Die Fläschchen in isopropanolgefüllte Kammer legen und über Nacht bei -80 °C bei 1 °C/min abkühlen lassen. Fläschchen am nächsten Tag zur Langzeitlagerung in einen flüssigen Stickstofftank geben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Herstellung von humanen periventrikulären Endothelzellen für Assay
<ol><li>Lassen Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen 70%-80% Konfluenz erreichen.</li>
	<li>Dissoziate Zellen nach den Schritten 1.3 bis 1.5 wie oben beschrieben. Zählen Sie Zellen mit der Trypan Blue-Ausschlussmethode.</li>
</ol>3. Vorbereitung von Human GABAergic Interneurons für Assay
HINWEIS: Humaninduzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete GABAerge Interneurons und das neuronale Medium wurden kommerziell erworben (siehe Tabelle der Materialien). Die Neuronen werden durch Differenzierung einer menschlichen fibroblasten abgeleiteten iPSC-Linie nach einem vom Hersteller entwickelten Protokoll erzeugt. Die Zellen wurden nach dem Herstellerprotokoll aufgetaut und kultiviert.
<ol><li>Tauen Sie menschliche GABAerge interneurons und Kultur sie in 12-Well-Platte für zwei Wochen zu einer Konfluenz von 70%-80%.</li>
	<li>Am Tag des Assays, warme Zelldissoziationslösung (siehe Materialtabelle) und ein Aliquot des neuronalen Mediums bei 37 °C für 10 min vor Gebrauch.</li>
	<li>Aspirieren Sie Medium aus jedem Brunnen, der die Zellen enthält. Waschen Sie Zellen mit 1 ml sterilem 1x PBS pro Brunnen.</li>
	<li>Lösen Sie die Zellen durch Zugabe von 0,5 ml vorgewärmter Dissoziationslösung pro Brunnen und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 min. Fügen Sie 1 ml neuronales Medium pro Brunnen hinzu. Übertragen Sie die Zelllösung in ein 15 ml konisches Rohr. Sanft trituieren, um Zellklumpen zu dissoziieren.</li>
	<li>Zentrifugenzellen bei 380 x g für 5 min bei Raumtemperatur, aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml neuronalen Mediums wieder auf. Zählen Sie lebende Zellen mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Kontrolle humaner Endothelzellen für Assay
HINWEIS: Kontrolle der menschlichen iPSC-abgeleiteten Endothelzellen und des Endothelzellmediums wurden kommerziell erworben (Tabelle der Materialien). Diese Endothelzellen werden durch Differenzierung einer menschlichen fibroblastenabgeleiteten iPSC-Linie zum endotheliaalen Schicksal nach einem vom Hersteller entwickelten Protokoll erzeugt. Die Zellen wurden aufdemoniert und kultiviert auf Fibronectin Substrat nach Herstellerprotokoll. Fibronectin-beschichtete Platten wurden nach dem Herstellerprotokoll hergestellt.
<ol><li>Tauen Kontrolle menschlichen Endothelzellen und Kultur sie in 6-Well-Platte zu einer Konfluenz von 80%-90%.</li>
	<li>Am Tag des Assays, warme Zelldissoziationslösung (siehe Materialtabelle) und ein Aliquot von endothelialem Medium bei 37 °C für 10 min vor Gebrauch.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Medium aus jedem Brunnen, der die Zellen enthält. Waschen Sie Zellen mit 1 ml sterilem 1x PBS pro Brunnen.</li>
	<li>Lösen Sie Zellen, indem Sie 0,5 ml vorgewärmte Dissoziationslösung pro Brunnen hinzufügen. Inkubieren Bei Raumtemperatur für 5 min. Fügen Sie 1 ml Endothelzellmedium pro Brunnen hinzu, um die Dissoziationslösung zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zelllösung in ein 15 ml konisches Rohr.</li>
	<li>Zentrifugenzellen bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml Endothelzellmedium wieder auf. Zählen Sie lebende Zellen mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode.</li>
</ol>5. Vorbereitung von Ein-Gut-Kultur-Einlagen
<ol><li>1 mg/ml Lamininlösung bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C auftauen.</li>
	<li>Beschichten Sie eine entsprechende Anzahl von 35 mm Geschirr mit 0,01% Poly-L-Ornithin-Lösung (1 ml pro Schale). Inkubieren Sie die Gerichte bei Raumtemperatur für mindestens 1 h.</li>
	<li>1 mg/ml Lamininlösung 1:300 in sterilem Wasser auf eine Endkonzentration von 3,3 g/ml unmittelbar vor Gebrauch verdünnen.</li>
	<li>Vollständig ansaugen Poly-L-Ornithin e.V. aus jeder Schale. Spülen Sie jede Schale gründlich 3x mit sterilem Wasser und aspirieren Sie vollständig, um Poly-L-Ornithin-induzierte Zelltoxizität zu vermeiden.</li>
	<li>Fügen Sie jeder Schale 1 ml 3,3 g/ml Lamininlösung hinzu und brüten bei 37 °C über Nacht oder mindestens 1 h. Lamininlösung unmittelbar vor Gebrauch aus der Schale entfernen. HINWEIS: Alternativ können Sie die laminhaltigen Gerichte in 4 °C aufbewahren. Die Gerichte vor gebrauchen in einem 37 °C Zellkultur-Inkubator ausstatten.</li>
	<li>Schneiden Sie drei Seiten eines Brunnens eines Zwei-Well-Silikonkultureinsatzes (Abbildung 1A) mit einer sterilen Klinge, um einen Ein-Gut-Einsatz zu erzeugen (Abbildung 1B). HINWEIS: Halten Sie den Zwei-Well-Einsatz fest an der Oberfläche der Originalverpackung befestigt, während Sie schneiden, um einen glatten Schnitt zu gewährleisten und die Klebekraft des Einsatzes zu schützen.</li>
	<li>Aspirieren Laminin Lösung aus den Gerichten. HINWEIS: Waschen Sie das Geschirr nicht mit sterilem PBS oder Wasser nach der Laminininkubation. Nasse Oberflächen verhindern eine enge Haftung des Kultureinsatzes.</li>
	<li>Entfernen Sie den Ein-Gut-Einsatz mit steriler Pinzette und legen Sie ihn in die Mitte der Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten Schale. Drücken Sie entlang der Ränder des Einsatzes, um ihn an der Oberfläche der Schale zu befestigen.</li>
	<li>Drehen Sie die Schale vorsichtig auf den Kopf, um zu überprüfen, ob der Einsatz fest verkrüpliegt ist.</li>
	<li>Halten Sie die Schale auf den Kopf und markieren Sie die Begrenzung des Einsatzfachs mit einem permanenten schwarzen Marker mit einer ultrafeinen Spitze (Abbildung 1C).</li>
</ol>6. Fernmigrations-Assay
<ol><li>Setzen Sie menschliche GABAerge Interneuronen in einer Konzentration von 3 x 104 Zellen/70 l neuronalen Mediums aus. Samen 70 l Zelllösung in jedem Ein-Gut-Kultur-Einsatz. HINWEIS: Die Saatdichte von Interneurons ist gemäß herstellerischer Empfehlung.</li>
	<li>Setzen Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen in einer Konzentration von 3 x 104 Zellen/70 L periventrikuläres endothelialem Zellmedium aus. Samen 70 l Zelllösung in jedem Ein-Gut-Kultur-Einsatz. ANMERKUNG: Die Anzahl der menschlichen periventrikulären Endothelzellen, die im Verhältnis 1:1 mit der Anzahl der gesäten Neuronen gesät werden.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml neuronales Medium in der Neuronenschale hinzu, um den Bereich um den Einsatz zu füllen und das Trocknen der Beschichtung zu verhindern. In ähnlicher Weise fügen Sie 1 ml periventrikuläres endothelialezellisches Medium in periventrikulärer endothelialen Zellschale hinzu. HINWEIS: Fügen Sie Medium langsam entlang der Kante der Schale, so dass der Einsatz nicht gestört wird.</li>
	<li>Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob Zellen nicht aus dem Einsatzfach austreten.</li>
	<li>Inkubationszellen für 24 h bei 37 °C und 5%CO2. Überprüfen Sie nach 24 h Inkubation unter dem Mikroskop, ob die Zellen richtig befestigt sind und es kein Leck über Nacht gibt.</li>
	<li>Nach 48 h Aussaat den Einsatz vorsichtig mit einer sterilen Pinzette entfernen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellschicht ungestört bleibt (Tag 0).</li>
	<li>Entfernen Sie Medium aus der Neuronschale und fügen Sie 1 ml frisches neuronales Medium hinzu. In ähnlicher Weise entfernen Sie das Medium aus der periventrikulären endothelialen Zellschale und fügen Sie 1 ml frisches periventrikuläres Endothelzellmedium hinzu. HINWEIS: Legen Sie eine erforderliche Anzahl von Gerichten beiseite und fixieren Sie mit 4% PFA für Tag 0 Bilder.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen für 5 Tage bei 37 °C und 5%CO2. Nach 5 Tagen, entfernen Sie Medium, fixieren Sie Zellen mit 4% PFA für 10 min, und waschen Sie 3x mit 1x PBS.</li>
	<li>Färben Sie Neuronen mit antihumanem -Tubulin oder antihumanem MAP2-Antikörper und Endothelzellen mit antihumanem CD31-Antikörper. Am Ende der Immunostainierung 1 ml Antifade-Montagemedium zu jeder Schale hinzufügen.</li>
</ol>7. Co-Kultur Migration Assay
<ol><li>Co-suspend 3 x 104 GABAerge Interneurons und 3 x 104 menschliche periventrikuläre Endothelzellen in 70 l Co-Kulturmedium (50% periventrikuläres Erhaltungsmedium ohne GABA und 50% neuronales Medium). Säen Sie diese Zelllösung im Ein-Gut-Einsatzfach. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl von solchen Assay-Gerichte. HINWEIS: GABA wurde nicht in der Co-Kultur-Medium hinzugefügt, um die Wirkung von exogenen GABA auf die Migration auszuschließen.</li>
	<li>Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob Zellen nicht aus dem Einsatzfach austreten.</li>
	<li>Fügen Sie langsam 1 ml Co-Kulturmedium entlang der Seite der Schale hinzu, um das Trocknen der Beschichtung zu verhindern. HINWEIS: Fügen Sie Medium langsam entlang der Kante der Schale, so dass der Einsatz nicht gestört wird.</li>
	<li>Als erste Kontrolle, Samen 3 x 104 menschliche GABAerge interneurons nur in 70 l Co-Kultur-Medium pro Ein-Gut-Einsatz. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl solcher Gerichte zu.</li>
	<li>Als zweite Kontrolle steuern Co-Samen 3 x 104 GABAerge humane Interneuronen mit 3 x 104 menschlichen Endothelzellen in 70 l Co-Kulturmedium pro Ein-Well-Einsatz. Bereiten Sie eine angemessene Anzahl von Gerichten zu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Gerichte für 24 h bei 37 °C und 5%CO2. Überprüfen Sie nach 24 h Inkubation unter dem Mikroskop, ob die Zellen richtig befestigt sind und kein Leck vorliegt.</li>
	<li>Nach 48 h Aussaat den Einsatz vorsichtig mit einer sterilen Pinzette entfernen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellschicht nicht gestört ist (Tag 0).</li>
	<li>Entfernen Sie Medium und fügen Sie 1 ml frische Co-Kultur-Medium. HINWEIS: Legen Sie eine angemessene Anzahl von Gerichten für den Erwerb von Tag 0 Bilder beiseite.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen für 5 Tage bei 37 °C und 5%CO2.</li>
	<li>Nach 5 Tagen, entfernen Sie Medium, fixieren Sie Zellen mit 4% PFA für 10 min, und waschen Sie 3x mit 1x PBS.</li>
	<li>Stain mit antihumanem -Tubulin oder antihumanem MAP2-Antikörper zur Kennzeichnung der Neuronen. Am Ende der Immunostainierung 1 ml Antifade-Montagemedium zu jeder Schale hinzufügen.</li>
</ol>8. Chemo-Attraktion Assay
<ol><li>Legen Sie einen Drei-Brunnen-Kultureinsatz in die Mitte einer Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten 35-mm-Schale mit steriler Pinzette.</li>
	<li>Drehen Sie die Schale auf den Kopf. Markieren Sie die Begrenzung um das mittlere Fach des Einsatzes mit einem permanenten schwarzen Marker mit ultrafeiner Spitze.</li>
	<li>Samen 3 x 104 menschliche GABAerge Interneurons im mittleren Fach in 70 l neuronalen Mediums(Abbildung 3A).</li>
	<li>Samen 104 menschliche periventrikuläre Endothelzellen in 70 l periventrikuläres Endothelzellmedium und 104 steuern Endothelzellen in 70 l Kontrollendothelzellmedium in den beiden äußeren Kompartimenten(Abbildung 3A).</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Co-Kulturmedium (50% periventrikuläres Pflegemedium ohne GABA und 50% neuronales Medium) an der Seite der Schale hinzu, um das Trocknen der Beschichtung auf der Schale zu verhindern.</li>
	<li>Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob Zellen nicht aus dem Einsatzfach austreten.</li>
	<li>Inkubationszellen für 24 h bei 37 °C und 5%CO2. Überprüfen Sie nach 24 h Inkubation unter dem Mikroskop, ob die Zellen richtig befestigt sind und kein Leck vorliegt.</li>
	<li>Nach 48 h Aussaat den Einsatz vorsichtig mit einer sterilen Pinzette entfernen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellschicht nicht gestört ist (Tag 0).</li>
	<li>Entfernen Sie Medium und fügen Sie 1 ml frische Co-Kultur-Medium. HINWEIS: Legen Sie die erforderliche Anzahl von Gerichten für Tag 0 Bilder beiseite.</li>
	<li>Inkubationszellen für 36 h bei 37 °C und 5%CO2. Nach 36 h, Aspiratmedium, fixieren Zellen mit 4% PFA für 10 min, und waschen 3x mit 1x PBS.</li>
	<li>Stain humane GABAerge Interneuronen mit antihumanem -Tubulin oder antihumanem MAP2-Antikörper. Am Ende des Färbevorgangs 1 ml Antifade-Montagemedium in jede Schale geben.</li>
</ol>9. Imaging und Datenanalyse
<ol><li>Stellen Sie die immunbefleckte Assayschale bei 4X Vergrößerung unter ein Mikroskop.</li>
	<li>Bewahren Sie eine lange Kante der rechteckigen Begrenzung (in Schritt 5.10 oben) im Sichtfeld auf. Erstellen Sie Bilder von Zellen im zellfreien Raum neben dieser Grenze. Erfassen Sie Bilder entlang der rechten langen Kante und der linken langen Kante der rechteckigen Begrenzung (Abbildung 2B). HINWEIS: Zellen, die diagonal in Bezug auf das Rechteck positioniert sind, werden aufgrund von Mehrdeutigkeitbeisangaben bei der Auswahl der kurz- oder langen Kante als Startmarke nicht berücksichtigt. Außerdem ist die Anzahl der Zellen, die über die kurze Kante migrieren, oft deutlich geringer (möglicherweise aufgrund einer geringeren Anzahl von Startzellen entlang der kurzen Kante) und wird nicht berücksichtigt.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bilder in ImageJ. Berechnen Sie den Abstand zwischen jeder Zelle und der Begrenzungsmarke (Abbildung 2D) mit ImageJ.</li>
	<li>Um die Migration anhand von Zellenzahlen zu bewerten, legen Sie einen bestimmten Abstand von der Grenze im erfassten Bild in ImageJ fest. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die in dieser Entfernung vorhanden sind. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl, die Standardabweichung und die statistische Signifikanz mit der entsprechenden Software.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Hier haben wir drei In-vitro-Assays beschrieben, die zusammen eine quantitative Bewertung der periventrikulären endothelialen zellspezifischen Eigenschaften des Menschen ermöglichen. Diese Assays werden wertvoll sein, um mechanistische Einblicke in die Wechselwirkung menschlicher periventrikulärer Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen zu gewinnen. Experimente mit Liganden, Inhibitoren oder Zellen mit genspezifischem Knockdown oder Überexpression werden molekulare Akteure identifizieren oder validieren, die endoth...

Endothelzellen bilden die Auskleidung der Blutgefäße und vermitteln wichtige Funktionen, die die Aufrechterhaltung der Durchlässigkeit der Gefäßwand, die Regulierung des Blutflusses, die Thrombozytenaggregation und die Bildung neuer Blutgefäße umfassen. Im Gehirn sind Endothelzellen Teil einer kritischen Blut-Hirn-Schranke, die den Materialaustausch zwischen dem Gehirn und dem Blutkreislauf streng steuert1. Unsere Studien in den letzten zehn Jahren haben neue neurogene Rollen von Gehirn endothel Zellen identifiziert, die signifikante Auswirkungen auf die Entwicklung des Gehirns und Verhaltenhaben 2,3,4,5. Wir haben gezeigt, dass das embryonale Vorderhirn der Maus durch zwei verschiedene Subtypen von Gefäßen, die pialen Gefäße und die periventrikulären Gefäße, die sich in Anatomie, Herkunft und Entwicklungsprofilunterscheiden,vaskularisiert wird 2 . Endothelzellen, die diese beiden Gefäßsubtypen aussäumen, weisen deutliche Unterschiede in ihren Genexpressionsprofilen auf. Während piale Endothelzellen meist Gene exprimieren, die mit Entzündungen und Immunantwort zusammenhängen, sind periventrikuläre Endothelzellen einzigartig angereichert in der Expression von Genen, die häufig mit Neurogenese, neuronaler Migration, Chemotaxis und Axonführung assoziiert sind3. Periventrikuläre Endothelzellen beherbergen auch einen neuartigen GABA-Signalweg, der sich vom traditionellen neuronalen GABA-Signalweg5unterscheidet. Gleichzeitig mit seiner Genexpression, periventrikuläre Endothelzellen wurden gefunden, um Migration und Verteilung von GABAergen Interneuronen in der sich entwickelnden Neocortex zu regulieren. Während der embryonalen Entwicklung durchlaufen periventrikuläre Endothelzellen eine Fernmigration entlang eines ventral-dorsalen Gradienten, um das periventrikuläre Gefäßnetz2,3zu etablieren. Diese Migrationsroute wird einen Tag später von Interneuren gespiegelt. Migrierende Interneuroner interagieren physisch mit dem vorgebildeten periventrikulären Gefäßnetz und nutzen es als Leitlinie, um ihr endgültiges Ziel im Neocortex zu erreichen. Periventrikuläre Endothelzellen dienen nicht nur als physikalisches Substrat, sondern dienen auch als Quelle für Navigationshinweise für die Migration von Neuronen. Periventrikuläre endotheliale Zellsekretierte GABA leitet interneuron Migration und reguliert ihre endgültigen Verteilungsmuster4. Defekte in interneuron Migration und Verteilung sind mit neuropsychiatrischen Störungen wie Autismus, Epilepsie, Schizophrenie und Depression6,7,8,9,10verbunden. Daher wird die Untersuchung der periventrikulären Endothelzellfunktionen und ihres Einflusses auf die interneuronische Migration im menschlichen Kontext entscheidend für die Bekämpfung der Pathogenese dieser Störungen.
Wir haben menschliche periventrikuläre Endothelzellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen in unserem Labor11mit induzierter pluripotenter Stammzelltechnologie (iPSC)12,13erzeugt. Um zu validieren, ob menschliche periventrikuläre Endothelzellen die periventrikulären Endothelzellen der Maus originalgetreu imitieren und ihren Einfluss auf die interneuronische Migration quantitativ bewerten können, entwickelten wir drei In-vitro-Assays: einen Fernmigrationstest, einen Co-Kultur-Migrationstest und einen Chemo-Attraktions-Assay. Hier beschreiben wir Protokolle für diese Assays im Detail. Alle drei Assays basieren auf der Verwendung von Silikonkultureinsätzen, um einen kleinen rechteckigen Zellfleck (mit festen Abmessungen) zu erstellen, der von zellfreiem Raum umgeben ist. Der Migrationsabstand wird ausgewertet, indem der Abstand zwischen den endlaufenden Positionen von Zellen vom Rand des rechteckigen Patches gemessen wird, der am Tag 0 umrissen wurde. Im Fernwanderungstest werden menschliche periventrikuläre Endothelzellen als Pflaster in der Mitte einer 35-mm-Schale ausgesät, und die von den Zellen über einen langen Zeitraum zurückgelegten Entfernungen werden berechnet. Im Co-Kultur-Migrationstest werden menschliche periventrikuläre Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen als ein Pflaster in einer 35-mm-Schale mitgesät. Diese Einrichtung ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen direkter physischer Wechselwirkungen dieser beiden Zelltypen auf die Migrationsrate von Interneuronen. Der Chemo-Attraktionstest misst die Migration von Interneuronen als Reaktion auf chemoattraktive Hinweise, die von menschlichen periventrikulären Endothelzellen sezerniert werden. Interneuronen werden als rechteckiges Pflaster mit menschlichen periventrikulären Endothelzellen gesät und kontrollieren nicht-periventrikuläre Endothelzellen, die als ähnlich große Pflaster auf beiden Seiten gesät werden. Jede der Zellpflaster wird durch einen zellfreien Spalt von 500 m getrennt. Die Reaktion von Interneuronen wird durch Quantifizierung der Anzahl der Zellen, die zu periventrikulären endothelialen Zellen gewandert sind, im Vergleich zur Kontrolle nicht-periventrikulärer endotheliale Zellen bewertet.
Diese Assays liefern eine robuste Bewertung der funktionen der humanen periventrikulären Endothelzellen und ihres Einflusses auf die interneuronische Migration. Die neuartige Einrichtung des Fernassays und des Co-Kultur-Migrations-Assays bietet zellfreien Raum im Bereich von Zentimetern (1-1,5 cm), um die Erkennung von Fernmigration zu ermöglichen. Eine Zusammenfassung der Merkmale unserer Assays im Vergleich zu anderen populären Assays ist in Tabelle 1dargestellt. Gemeinsam werden die hier beschriebenen Assays als Plattform für die Bewertung "kranker" periventrikulärer Endothelzellen und Interneuronen dienen, die aus iPSCs von Hirnerkrankungen wie Schizophrenie, Autismus oder Epilepsie erzeugt werden. Diese Assays können auch verwendet werden, um zu bestimmen, wie unterschiedliche Bedingungen (z. B. Inhibitoren, Liganden, RNAi) die Zellmigration beeinflussen. Schließlich können diese Assays für andere Zelltypen optimiert werden, um die Migration über die Ferne, die Chemo-Attraktion oder die zellzellvermittelte Migration zu messen.

<table><tbody><tr><td>Accutase-Dissoziationslösung</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCR005</td><td>Zelldissoziationslösung (für periventrikuläre Endothelzellen, Schritt 1.4)</td></tr><tr><td>Anti-Human- &beta;-Tubulin-Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>802001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humaner CD31-Antikörper</td><td>Millipore Sigma</td><td>CBL468</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2-Antikörper</td><td>Neuromics</td><td>CH22103</td><td></td></tr><tr><td>Antiaktiver Caspase-3-Antikörper</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB3623</td><td></td></tr><tr><td>Kontrolle menschlicher Endothelzellen</td><td>Cellular Dynamics</td><td>R1022</td><td></td></tr><tr><td>Kontrolle Endothelzellen Medium Supplement</td><td>Cellular Dynamics</td><td>M1019</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEMF/12 Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>E6 Medium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierbehälter</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Menschliche GABAerge Neuronen</td><td>Zelluläre Dynamik</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>Menschliche GABAerge Neuronen Basismedium</td><td>Zelluläre Dynamik</td><td>M1010</td><td></td></tr><tr><td>Menschliches GABAerges Neuron Neuronale Ergänzung</td><td>Zelluläre Dynamik</td><td>M1032</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Basalmembran-Matrix</td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>Vektorlaboratorien</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin</td><td>Sigma</td><td>p4957</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Thermofisher Wissenschaftliche</td><td>12563011</td><td>Zelldissoziationslösung (für GABAerge Interneurone und Endothelzellen, Abschnitte 3 und 4)</td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td><td>Lifeline Cell Technologies</td><td>LL-0003</td><td>Komponente der Kontrolle humanes Endothelzellmedium</td></tr><tr><td>2-Well-Silikonkultur-Insert</td><td>ibidi</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>3-Well-Silikon Kultur-Einsatz</td><td>ibidi</td><td>80369</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Schale</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>15-ml konisches Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA-Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Phasenkontrastmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Leuchtstoffmikroskop</td><td>Olympus</td><td>FSX-100</td><td></td></tr></tbody></table>

migration, chemo-attraktion und co-culture-assays für menschliche stammzell-abgeleitete endothelzellen und gabaerge neuronen

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Die Rolle der Gehirnvaskulatur bei der Entwicklung des Nervensystems und der Ätiologie von Hirnerkrankungen gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit. Unsere jüngsten Studien haben eine spezielle Population von Gefäßzellen identifiziert, die periventrikulären Endothelzellen, die eine entscheidende Rolle bei der Migration und Verteilung von Vorhirn GABAerge Interneurons während der embryonalen Entwicklung spielen. Dies, gepaart mit ihren zellautonomen Funktionen, spielt auf neue Rollen von periventrikulären Endothelzellen in der Pathologie neuropsychiatrischer Störungen wie Schizophrenie, Epilepsie und Autismus an. Hier haben wir drei verschiedene In-vitro-Assays beschrieben, die gemeinsam die Funktionen periventrikulärer Endothelzellen und deren Wechselwirkung mit GABAergen Interneuronen bewerten. Die Verwendung dieser Assays, insbesondere im menschlichen Kontext, wird es uns ermöglichen, den Zusammenhang zwischen periventrikulären Endothelzellen und Hirnerkrankungen zu identifizieren. Diese Assays sind einfach, kostengünstig und reproduzierbar und können leicht an jeden haftenden Zelltyp angepasst werden.

Die Schritte zum Einrichten eines Ein-Brunnen-Kultureinsatzes in einer 35-mm-Schale sind in Abbildung 1dargestellt. Der Fernmigrationstest und der Co-Kultur-Migrationstest verwendeten einen Ein-Gut-Einsatz, um die gewünschte Anzahl von Zellen in der Mitte einer Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten 35-mm-Schale auszusäen. Am Tag 0 waren Zellen als rechteckiges Pflaster vorhanden (Abbildung 2A,C). In Bildern des T...

Wir präsentieren drei einfache In-vitro-Assays – den Fernmigrations-Assay, den Co-Kultur-Migrations-Assay und den Chemo-Attraktions-Assay,der die Funktionen menschlicher Stammzell abgeleiteter periventrikulärer Endothelzellen und deren Interaktion mit GABAerge Interneurons.

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Dieses Protokoll beschreibt drei In-vitro-Assays, die gemeinsam die Funktionen menschlicher periventrikulärer Endothelzellen und deren Wechselwirkung mit humanen GABAerge Interneuronen bewerten. Die Ergebnisse dieser Assays werden einen kritischen Einblick in den Zusammenhang zwischen periventrikulären Endothelzellen und Hirnerkrankungen geben. Diese Assays sind einfach, kostengünstig und ermöglichen die Messung der Zellmigration im Bereich von Zentimetern, was durch andere bestehende Assays nicht erreicht wird.Defekte in der Migration und Verteilung von GABAerge Interneurons sind mit psychiatrischen Störungen, wie Autismus, Epilepsie, Schizophrenie und Depression verbunden. Daher ist es wichtig, die Wechselwirkung von periventrikulären Endothelzellen mit GABAergen Interneuronen im menschlichen Kontext zu untersuchen, um die Pathogenese dieser Störungen anzugehen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung menschlicher Zellen für den Test.Lassen Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen 70 bis 80 % Konfluenz erreichen, dann dissoziieren Sie sie entsprechend den Anweisungen des Manuskripts und zählen Sie sie mit der Trypan-Blau-Ausschlussmethode. Zur Vorbereitung menschlicher GABAerge Interneurons, warmer Zelldissoziationslösung und einem Aliquot von neuronalen Medien bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Dann das Medium aus jedem Brunnen, der Zellen enthält, ansaugen und mit einem Millimeter PBS pro Brunnen waschen.Lösen Sie die Zellen, indem Sie 0,5 Milliliter vorgewärmte Dissoziationslösung pro Brunnen hinzufügen und sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation einen Milliliter neuronalen Mediums pro Brunnen hinzufügen und die Zelllösung in eine 15-Milliliter-Konustube übertragen, die sanft trituiert, um Zellklumpen zu dissoziieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 380 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter neuronalen Mediums wieder auf.Zählen Sie dann die lebenden Zellen mit Trypan-Blau-Ausschluss. Bereiten Sie die Kontrolle menschlicher Endothelzellen vor, indem Sie die Zelldissoziationslösung und ein Aliquot von endothelialem Medium bei 37 Grad Celsius, 10 Minuten vor der Anwendung, erwärmen. Von jedem Brunnen absaugen und mit einem Milliliter PBS pro Brunnen waschen.Lösen Sie die Zellen, indem Sie 0,5 Milliliter der vorgewärmten Dissoziationslösung zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie dann einen Milliliter Endothelzellmedium pro Brunnen hinzu, um die Dissoziationslösung zu neutralisieren, und übertragen Sie die Zellen in eine 15 Milliliter konische Röhre. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für fünf Minuten, aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Endothelzellmedium.Verwenden Sie dann die Trypan-Ausschlussmethode, um die Zellen zu zählen. Bereiten Sie einen Brunnen Kultureinsatz vor, indem Sie drei Seiten eines Brunnens eines zwei gut Silikonkultureinsatzes mit einer sterilen Klinge schneiden. Entfernen Sie den Einsatz mit einer sterilen Pinzette und legen Sie ihn in die Mitte einer Poly-L-Ornithin- und Laminin-beschichteten Schale, und drücken Sie dann entlang der Kante des Einsatzes, um ihn an der Oberfläche zu befestigen.Drehen Sie die Schale vorsichtig auf den Kopf, um zu überprüfen, ob der Einsatz fest verkrüppft ist, und markieren Sie die Grenze des Einsatzfachs mit einem permanenten Schwarzmarkt mit einer ultrafeinen Spitze. Suspend humane GABAerge Interneuronen in neuronalen medium und humanen periventrikulären Endothelzellen und Endothelzellmedium in einer Konzentration von 30.000 pro 70 Mikroliter, dann Samen 70 Mikroliter der Zelllösung in jedem Brunnen Kultureinsatz. Fügen Sie der Neuronenschale einen Milliliter neuronales Medium hinzu, um den Bereich um den Einsatz zu füllen und das Trocknen der Beschichtung zu verhindern.In ähnlicher Weise fügen Sie der periventrikulären endothelialen Zellschale einen Milliliter Endothelzellmedium hinzu. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sie nicht aus dem Einsatzraum auslaufen, und bebrüten sie dann 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Überprüfen Sie nach der Inkubation die Zellen erneut unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sie richtig befestigt sind.48 Stunden nach der Aussaat den Einsatz vorsichtig mit einer sterilen Pinzette entfernen und die Zellen unter dem Mikroskop überprüfen, um zu überprüfen, ob die Zellschicht ungestört bleibt. Entfernen Sie das Medium aus dem Neuron und den periventrikulären endothelialen Zellschalen, und fügen Sie jedem Gericht einen Milliliter frisches Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für fünf Tage.Entfernen Sie dann das Medium, fixieren Sie die Zellen mit 4%PFA für 10 Minuten und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Um den Co-Kultur-Assay durchzuführen, setzen Sie 30.000 GABAerge Interneurons und 30.000 menschliche periventrikuläre Endothelzellen in 70 Mikroliter Co-Kulturmedium aus, säen Sie dann diese Zelllösung in einem einbrunnen insert-Fach. Entfernen Sie nach 48 Stunden den Einsatz.Inkubieren Sie die Co-Kultur bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für fünf Tage. Nach der Inkubation entfernen Sie das Medium, fixieren Sie die Zellen mit 4%PFA und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Um den Chemo-Attraktions-Assay durchzuführen, legen Sie einen drei Brunnenkultureinsatz in die Mitte einer Poly-L-Ornithin- und Laminin-beschichteten 35-Millimeter-Schale, drehen Sie die Schale auf den Kopf und markieren Sie die Grenze um das mittlere Fach des Einsatzes mit einem permanenten Marker mit einer ultrafeinen Spitze.Samen 30 000 GABAerge Interneurons in 70 Mikroliter neureszenumsimim, dann Samen 10.000 periventrikuläre Endothelzellen und 10.000 Kontroll-Endothelzellen und 70 Mikroliter ihres jeweiligen Mediums in den beiden Äußeren. Fügen Sie einen Milliliter Co-Kulturmedium entlang der Seite der Schale hinzu, um zu verhindern, dass die Beschichtung auf der Schale trocknet. Nach 48 Stunden entfernen Sie den Einsatz und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 36 Stunden.Nach der Inkubation entfernen Sie das Medium, fixieren Sie die Zellen und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Langstrecken- und Co-Kultur-Migrations-Assays wurden verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen periventrikulären Endothelzellen und GABAergen Neuronen zu untersuchen. Im Fernmigrationstest begannen Zellen als rechteckiger Patch am Tag Null, aber um 48 Stunden waren sie in den zellfreien Raum hinausgewandert.Immunzytochemische Färbung mit Anti-Active Caspase-3 Antikörper, ein Marker der Apoptose, zeigte kein apoptotisches Signal in den gesäten Neuronen. Im Co-Kultur-Migrationstest, als Interneuronen mit menschlichen periventrikulären Endothelzellen ko-saatiert wurden, legten Neuronen weiter entfernt ezielflich als bei interneuronen, die allein ausgesät wurden oder wenn sie mit Kontrollendothelzellen ausgesät wurden. Im Chemo-Attraktionstest wanderte eine signifikant höhere Anzahl von Interneuren in periventrikuläre Endothelzellen im Vergleich zu Kontrollen von Endothelzellen, was bestätigt, dass GABAerge Interneuronen selektiv auf chemoattraktive Cues reagieren, die von periventrikulären Endothelzellen sezerniert werden.Diese Assays können mit Liganden, Inhibitoren oder Assay-Arenen modifiziert werden, um mechanistische Einblicke in Wechselwirkungen menschlicher periventrikulärer Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen zu erhalten. Sie können auch verwendet werden, um die Interaktion von menschlichen periventrikulären Endothelzellen mit anderen neuronalen Zellen zu untersuchen, wie von unserer Gruppe und anderen berichtet. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, den Einsatz fest auf der Schale zu fixieren und ihn während des gesamten Testes ungestört zu halten, da es sonst zu Zelllecks, Zellablösung oder Fehlausrichtung des Einsatzes mit der gezogenen Grenze führen kann.Unsere Arbeit hat eine zellautonome Rolle menschlicher periventrikulärer Endothelzellen bei der Pathogenese von psychiatrischen Störungen wie Schizophrenie, Epilepsie und Autismus gezeigt. Diese Assays ermöglichen daher die Beurteilung von erkrankten periventrikulären Endothelzellen, die von Patienten mit diesen Störungen mit der IPSC-Technologie abgeleitet wurden.

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Forschung

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