Abbiategrasso Brain Bank Protocol zum Sammeln, Verarbeiten und Charakterisieren alternder Gehirne

Da die Prävalenz einer neurokognitiven Störung kontinuierlich zunimmt, ist es unser Ziel, hochwertige Hirngewebeproben zu erhalten, zu charakterisieren und zu speichern, um eine genaue Diagnose zu erhalten und Licht auf die neurodegenerativen Mechanismen zu werfen. Unter Berücksichtigung der Hirnassymetrie ermöglicht unsere Sampling-Methodik, dass alle Metastudien an histologisch genau definierten Geweben aus beiden Hemisphären durchgeführt werden können und die vielen Daten durch Deep Learning gesammelt und korreliert werden können. Additive Effekte auf Hirnschäden durch mehrere Pathologien werden häufig beobachtet.

Die definitive Diagnose erfordert die Kombination des klinischen Syndroms mit den neuropathologischen Befunden, um Krankheitspathogenese und mögliche Therapien zu entdecken. Frische Schneidverfahren sowie das Makroschnittmanagement sind schwierig, aber auch unerlässlich, um gute Ergebnisse zu erzielen. Ein geschultes und engmaschiges Team ist entscheidend, um diese Schwierigkeiten zu überwinden.

Unser Protokoll enthält eine Reihe von Schritten, die Säugetier Geschicklichkeit erforderlich sind, daher visuelle Demonstration kann nützlicher als beschreibende Texte für Forscher, die diese Techniken beherrschen wollen. Nach der Bestätigung der Thanatographie verwenden Sie ein scharfes Skalpell, um einen Kopfhautschnitt durch die Haarhaut und das subkutane Gewebe auf der Koronaplatte von der Spitze des Mastoid-Prozesses auf einer Seite zur anderen zu machen, über den Scheitelpunkt. Trennen Sie die beiden Falten der Kopfhaut vorsichtig vom Schädel und setzen Sie den Schnitt fort, bis das gelbe Super-Orbitalfett sichtbar wird.

Reflektieren Sie die Kopfhaut anterior und ziehen Sie den anderen Abschnitt des Gewebes nachtränk. Mit einem Skalpell und Zangen, ernten Sie eine kleine Probe des zeitlichen Muskels auf jeder Seite des Schädels, platzierung eine Probe in 4%Formaldehyd und die andere Probe bei vier Grad Celsius. Mit einer elektrischen Säge schnitt der Schädel in einem V-Schnitt auf der Vorderseite und entfernen Sie die Schädelkappe.

Nach dem Schneiden der Meningen, ernten Sie ein Stück Dura für die Fixierung und ein anderes zum Einfrieren. Legen Sie eine 20 Gauge 3,5-Zoll-Nadel, die an einer 10 Milliliter Spritze befestigt ist, durch das Corpus Callosum ein, um den dritten Ventrikel zu erreichen und den Kolben zurückzuziehen, um etwa 10 Milliliter zerebrale Rückenmarksflüssigkeit zu erhalten. Bewerten Sie die Aussehensfarbe und Trübung der Flüssigkeit und messen Sie den pH-Wert.

Ziehen Sie vorsichtig an beiden Frontallappen, um das Gehirn zu heben und schneiden Sie sowohl die Sehnerven infundibulum, die inneren Karotisarterien und die dritte, vierte, fünfte und sechste Hirnnerven. Schneiden Sie das Tentorium, um die hintere Fossa zu erreichen und schneiden Sie die Wirbelarterien und die unteren Hirnnerven. Dann legen Sie das Skalpell so tief wie möglich durch das Foramen Magnum, um den kaudalsten Teil der Medula zu schneiden und sorgfältig das gesamte Gehirn zu entfernen.

Verwenden Sie das Skalpell, um den Knochen über Meckels Höhle zu erscheinen und sammeln Sie das Gasserian Ganglion von jeder Seite für fixieren und einfrieren. Verwenden Sie einen chirurgischen Schlägel und Meißel, um die knöcherne Sella turcica zu brechen und entfernen Sie die Hypophyse zur Fixierung in 4%Formaldehyd. Inspizieren Sie den Schädel und das gesamte Gehirn vor makroskopischen Veränderungen und Gefäßveränderungen.

Verwenden Sie ein Maßband, um die Quer- und vorderen Körperhaltungsdurchmesser des Gehirns zu messen und das Gehirn auf einer Skala zu wiegen. Rufen Sie vorsichtig den Kreis von Willis für die makroskopische Bewertung für das Vorhandensein von anatomischen Varianten, Läsionen oder Gefäßstenose. Trennen und inspizieren Sie das Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm, bevor Sie das Gewebe einzeln wiegen.

Ein bis zwei, zwei bis vier Zentimeter quadratische Leptomeninge aus der Konvexität entfernen und die Proben in einem vollständig glukosehohen DMEM-Kulturmedium bei vier Grad Celsius aufbewahren. Ernten Sie die Zirbeldrüse zur Fixierung in 4%Formaldehyd und entfernen Sie die Olfaktor-Lampen und Sehnerven für die Fixierung und das Einfrieren eines jeden Paares. Das Großhirn, das Kleinhirn und den Hirnstamm bei vier Grad Celsius auf Eis legen.

Wenn alle Gewebe von Interesse geerntet wurden, verwenden Sie einen Super-Klebstoff, um den Knochen wieder zu befestigen und eine chirurgische Nadel zu verwenden, und nicht resorbierbare Nähte, um die Kopfhaut zurückzunähen. Für Gehirnbank-Sektion verwenden Sie ein Trennmesser, um den Hirnstamm axial zu schneiden und machen Sie den ersten Schnitt auf der Ebene des rostralen Mittelhirns durch den überlegenen Colliculus, um zwei Scheiben zu erhalten, um die Substantia nigra freizulegen. Schneiden Sie das Hirnstamm in 10, acht Millimeter Scheiben mit Vorsicht, um Schnitte einzuschließen, die durch die rostralen Pons in der Nähe der oberen Ränder des vierten Ventrikels gehen, um den Locus caeruleus zu beobachten, und durch die Medulla oblongata, die den akustischen Strian unterlegen ist, knapp über dem unteren Scheitelpunkt des vierten Ventrikels, um Scheiben einschließlich des dorsalen Motorkerns des Vagus zu erhalten.

Beschriften Sie alle Scheiben in einer rostralen kaudalen Weise als BS für Hirnstamm gefolgt von arabischen Ziffern. Verwenden Sie nach dem letzten Hirnstammabschnitt die Bezeichnung SC für Rückenmark gefolgt von arabischen Ziffern. Schneiden Sie das Kleinhirn auf der sagittalen Ebene, um die beiden Kleinhirnhalbkugeln auf der Ebene der Vermis zu trennen und sagittale Schnitte durchzuführen, um fünf Scheiben aus jeder Hemisphäre zu erhalten.

Benennen Sie alle Slices aus der Vermis als CBR oder CBL für das rechte bzw. linke Kleinhirn, und verwenden Sie arabische Ziffern, um jeden Abschnitt zu identifizieren. Als nächstes trennen Sie die beiden Hemisphären des Großhirns durch den Corpus callosum auf der sagittalen Ebene, bevor Sie die Hemisphäre als singulär entlang der koronalen Ebene schneiden, die zwischen dem optischen Chiasmus und den Brustkörpern durch den frontalen Lappen-Temporalpol, den vorderen cingulate, den vorderen Kommissure, den Kern von Minored und basalen Ganglien führt. Machen Sie einen zweiten Schnitt etwa einen Zentimeter hinterder Weise durch die Brustkörper und entlarven die Basalganglien, vorderen Thalamus sub thalamus, und Amygdala.

Weiter schneiden, um die vorderen und hinteren Bereiche zu sezieren, bis 15 bis 21 Zentimeter Scheiben für jede Hemisphäre erhalten wurden. Platzieren Sie die Scheibe auf einer ebenen Oberfläche, wie sie nach ihrer ursprünglichen Position in der vorderen hinteren Richtung von der Frontal- bis zum Okzipitalpol erreicht werden, mit dem Abschnitt kontinuierlich mit den vorherigen Dias nach oben. Wenn alle Slices platziert wurden, wählen Sie die Hauptabschnitte aus, die für die Histopathologie fixiert werden sollen, einschließlich der zuvor erworbenen Abschnitte und der hippocampalen, parietalen und okzipitalen Abschnitte, und beschriften Sie die Slices als L oder R, gefolgt von arabischen Ziffern, einschließlich einer Beschriftung, die angibt, ob die Scheibe fixiert oder eingefroren werden soll.

Wenn alle Gewebe geschnitten und beschriftet wurden, erhalten Sie ein Bild für jede Reihe von Abschnitten vor ihrer Fixierung oder dem Einfrieren. Um die Proben einzufrieren, legen Sie die reservierten alternativen Gewebeabschnitte auf eine vorgefrorene Aluminiumschale und bedecken die Abschnitte mit einer ineinandergreifenden Aluminiumplatte, um sie flach zu halten. Dann frieren Sie die Scheiben in flüssigem Stickstoff für drei Minuten ein, bevor Sie die gefrorenen Proben in eine Plastiktüte legen, die mit den entsprechenden Identifikationscodes und Scheibennummern für eine Lagerung in der entsprechenden kryogenen Box bei 80 Grad Celsius gekennzeichnet ist.

Um die Proben zu fixieren, legen Sie die reservierten alternativen Gewebeabschnitte in einzelne Gazestücke und legen Sie die Scheiben in 10%phosphat gepufferte Formalinlösung für fünf Tage in einem vier Grad Celsius kalten Raum. 24 von 27 geernteten Gehirnen erhielten die vollständige neuropathologische Charakterisierung mit einer bestimmten klinischen pathologischen Diagnose. Vorläufige quantitative Elektroenzephalogramm-Analyse einer Reihe von 36 Hirnspendern zeigt, dass der Haupt-Alpha-Rhythmus-Prozentsatz bei wichtigen neurokognitiven Störungen signifikant niedriger ist als bei normalen älteren leichten neurokognitiven Störungen.

Hier zeigt sich ein Beispiel für eine asymmetrische Pathologie mit einer rechten Atrophie, die makroskopisch mit den im rechten koronalen Abschnitt im Vergleich zur linken beobachteten schweren ventrikulären Dilatationen sichtbar ist. Ein anderer Fall zeigt einen Infarkt der rechten Hemisphäre, während ein anderes Exemplar eine deutliche Atrophie des rechten Brustkörpers zeigt. Makroabschnitte können gefärbt werden, um Myelinverlust oder die Verteilung der Immunreaktivität innerhalb der Hemisphären zu identifizieren.

Diese Proben stammen von Zwillingen, die aufgrund epigenetischer und ökologischer Faktoren einen klinischen Beginn der Alzheimer-Krankheit in unterschiedlichen Zeitrahmen hatten. Dennoch ergab die mikroskopische Analyse ein sehr ähnliches neuropathologisches Bild, das auf eine hohe Alzheimer-Krankheitspathologie und Amyloid-Angiopathie hindeutet. Bei diesen beiden Patienten entsprach jedoch nicht genau die gleiche klinische Diagnose der Alzheimer-Krankheit den nnpathologischen Merkmalen, die ein Demenz-Duo in mehreren Ätiologien zeigten.

Tatsächlich stellte der erste Fall Lewy-Körper in der Gyrus-Einzellüge und der Substantia nigra dar. Und der zweite Fall zeigte Lewy-Körper, die mit Lewy-Neuriten im Amygdala- und Beiminorus assoziiert waren. Die Fotografie der Scheiben ist sorgfältig für eine genaue Identifizierung der anatomischen Bereiche während der mikroskopischen Analyse.

Die Fixierung und das Einfrieren von Einzelscheiben sind auch wichtig, um die Gewebemikrostruktur Omics die Topographie der Genaktivierung und Proteinverteilung zu erhalten und korrelieren diese Daten mit der Histopathologie. Zellkulturen aus gut charakterisierten Geweben, auch eine Untersuchung der Krankheitspathogenese. Tragen Sie immer eine angemessene persönliche Schutzausrüstung, da ein eigens übertragenes Hirngewebe als potenziell infektiös gilt und weil der Einsatz gefährlicher Werkzeuge wie scharfe Instrumente und flüssiger Stickstoff erforderlich ist.