Generierung von In-Frame-Gen-Deletion Mutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf VirulenzDämpfung in einem einfachen Mausmodell der Infektion

Dieses Protokoll ist wichtig für die Erstellung und Bestimmung von vom Geist und Körper gewünschten Mutationen im Genom von Pseudomonas aeruginosa, sowie die Prüfung der Wirkung von Mutationen auf die Virulenzreduktion in einem reproduzierbaren Mausmodell. Der Hauptvorteil dieser Technik ist eine Chromvalidierung und eine Reproduzierbarkeit des Mausinfektionsmodells. Bakterien arbeiten ständig und verändern sich ständig.

Um diesen Prozess zu verlangsamen, verwenden wir einen gefrorenen Stopp, packen sie, hängen sie auf mehrere Sprossen bei der Modifikation, bevor wir sie im Mausmodell testen. Jemand, der mit diesen Methoden nicht vertraut ist, wird höchstwahrscheinlich mit der Entwicklung und Auswahl möglicher Crossover-Rekombinante zu testen kämpfen. Darüber hinaus wird der Umgang mit den Mäusen für Infektionen für jemanden schwierig sein, der mit der Tierarbeit nicht vertraut ist.

Diese Methode kann angewendet werden, um andere Krankheitserreger und ihre Mutanten zu testen, sowie Virulenz-Infektion bei Mäusen. Im Vergleich zu aktuellen Modellen können Verfahren mit Reproduzierbarkeit und Klonvalidierung vor und nach einer Infektion anderen Forschern vor Ort zugute kommen. Die visuelle Demonstration dieses Protokolls bietet Einblicke in umfangreiche Verfahren, die durch das Lesen allein schwer zu verstehen oder zu verstehen sind.

Beginnen Sie mit dem Anbau von Single Crossover, rekombinanten Kolonien in Pseudomonas Isolation Broth, oder PIB. Impfen und Streifen 10 Mikroliter jeder Kultur auf vorgewärmten PIA-Platten, ergänzt mit 10%Saccharose. Dann bebrüten die Teller über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie am nächsten Tag die Platten aus dem Inkubator und inspizieren Sie sie auf Wachstum. Die saccharoseresistente Kolonie sollte doppelüberquerende Rekombinanten sein. Verwenden Sie sterile Zahnstocher, um mindestens 20 Kolonien auf vorgewärmte Platten von PIA zu flicken, PIA mit 10% Saccharose und PIA ergänzt mit Carbenicillin.

Die Platten über Nacht bebrüten und am nächsten Tag auf Wachstum untersuchen. Echte Doppel-Crossover-Rekombinanten sind Carbenicillin-empfindlich und saccharosefest. Bildschirm 10 bis 20 Kolonien zum Löschen, mit Kolonie PCR.

Nehmen Sie das Wachstum eines vermuteten Doppel-Crossover-Rekombinanten mit einem sterilen Zahnstocher auf und setzen Sie es in 50 Mikroliter PBS aus. Kochen Sie die Federung bei 100 Grad Celsius für 10 Minuten. Zentrifugieren Sie es für drei Minuten bei 13.000 Mal G und legen Sie es auf Eis.

Führen Sie dann PCR nach Manuskriptanweisungen aus. Sobald PCR fertig ist, führen Sie Agarose Gel Elektrophorese auf den Produkten. Kleinere Amplifikationsprodukte weisen auf Kolonien hin, in denen die Interessenregion gelöscht wurde.

Am Morgen der Injektionen, tauen die Kryovials der Bakterienzellen bei vier Grad Celsius für drei bis vier Stunden. Halten Sie die Fläschchen nach dem Auftauen auf Eis und injizieren Sie die Mäuse innerhalb von zwei Stunden. Übertragen Sie den Inhalt jedes Kryovials auf ein neues Zwei-Milliliter-Rohr und zentrifugieren Sie ihn bei 4, 500 mal G für 10 Minuten.

Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS wieder auf. Wiederholen Sie die Zentrifugation und setzen Sie die Zellen in PBS auf eine Endkonzentration von 2,5 mal 10 auf die neunte Kolonie bildende Einheiten pro Milliliter wieder aus. Nehmen Sie drei Proben von der endgültigen Suspension jedes Stammes, um Konzentration, Genotyp und Phänotyp zu validieren.

Für jeden Stamm 1,5 Milliliter der Zellsuspension in ein Zwei-Milliliter-Rohr zu geben und die PBS für Steuerinjektionen vorzubereiten. Sammeln Sie die Mäuse und Materialien, die für Injektionen benötigt werden, in einem sterilen chirurgischen Raum für Tiere und wischen Sie alle Oberflächen mit Desinfektionstüchern ab, bevor Sie beginnen. Tragen Sie zwei Paar Latexhandschuhe, um das Risiko einer Punktion zu begrenzen, wenn sie gebissen wird, sowie einen Labormantel, eine Schutzbrille und eine Gesichtsmaske.

Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und wiegen Sie sie, indem Sie den Schwanz mit einem permanenten Marker für die Nachverfolgung nach der Injektion markieren. Öffnen Sie eine neue Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27-Spur-Nadel und ziehen Sie 200 Mikroliter steriles PBS. Schnappen Sie sich die Maus hinter den Ohren, mit Daumen und Zeigefinger, und kneifen, um eine Hautfalte am Nacken zu erstellen.

Dann sichern Sie den Schwanz in die Handfläche mit dem Pinky, um die Maus flach und unbeweglich zu halten. Setzen Sie die Nadel in einem 30-Grad-Winkel in die Peritonealhöhle links oder rechts der Mittellinie ein. Heben Sie die Nadel leicht an, um sicherzustellen, dass sie nicht in Organe eingeführt wurde.

Dann injizieren Sie langsam die PBS und ziehen Sie die Nadel. Ein Bolus an der Injektionsstelle ist typisch. Legen Sie die Nadel in den dafür vorgesehenen Scharfen-Entsorgungsbehälter und bewegen Sie die Maus in einen separaten Käfig.

Wiederholen Sie den Vorgang mit der nächsten Maus und nachdem alle Mäuse aus einem Käfig injiziert werden, verschieben Sie sie zurück in ihren ursprünglichen Käfig. Nachdem Sie die Kontrollgruppe injiziert haben, injizieren Sie die Testgruppen mit demselben Verfahren. Sobald alle Injektionen abgeschlossen sind, bringen Sie die Mäuse in den Wohnraum zurück und reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desasietüchern.

Um die Tiere abzubilden, bereiten Sie das Bildgebungssystem vor, indem Sie die Kameraparameter einstellen und die Bühne erwärmen. Stellen Sie den Sauerstoffstrom auf 1,5 Liter pro Minute und Isofluran auf 3,5 % ein und bewegen Sie die Maus in die Anästhesiekammer, dann in das temperaturstabilisierte Stadium, nach anästhesie. Positionieren Sie die Maus auf dem Rücken mit ausgestreckten Armen und passen Sie einen Nasenkegel für die Verabreichung von 2,5% Isofluran während der Bildgebung.

Schließen Sie die Tür und nehmen Sie biolumineszierende Bilder und Röntgenaufnahmen der Maus. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, kehren Sie die Maus in ihren Käfig zurück und überwachen Sie sie. Es sollte das Bewusstsein innerhalb von drei bis fünf Minuten wiedererlangen.

Die gezielten genomischen Deletionen wurden von der Kolonie PCR mit spezifischen Primern bestätigt, die die Interessensregion verstärkten. Kolonien mit der genomischen Deletion ergeben ein kürzeres PCR-Band im Vergleich zu Wildenkolonien. Die intraperitoneale Injektion des abgeschwächten Stammes von P aeruginosa, PGN five, führte zu einer Sterblichkeit von 0 %, was der Mortalität entspricht, die mit E.coli BL 21 beobachtet wurde.

Die Injektion des Elternstamms war jedoch für 80% der Mäuse tödlich. Die Infektionsprogression wurde mit biolumineszenzmarkierten Eltern und abgeschwächten Stämmen verfolgt. Der abgeschwächte Stamm blieb an der Injektionsstelle lokalisiert, bis die Biolumineszenz verblasste, was wahrscheinlich mit der Clearance der Infektion zusammenfiel.

Die vorgestellte Methode untersuchte nur die Sterblichkeit, die durch den Stamm erzeugt wurde. Genauere immunologische und toxikologische Aspekte könnten genutzt werden, um die Dynamik der Infektion zu bestimmen und die Endwirkung der Infektion, die nicht zum Tod führt. Das Wichtigste im Verfahren ist die umfangreiche Validierung zwischen verschiedenen Schritten von der Erstidentifizierung bis hin zu Tierversuchen.

Das Fehlen bestimmter Validierungsschritte kann möglicherweise zu falschen Folgen führen, da die getesteten Stämme Mutationen und Selektionen unterzogen oder kontaminiert werden können. Mit der Entwicklung dieser beiden Techniken, wir denken, dass dies unseren Forschern auf dem Gebiet der Infektionsimmunologie ermöglichen wird, effektiver zu untersuchen, wie leistungsfähige Paketinteraktion zu dem extremen Phänotyp, Sepsis und Mortalität führt. Die Auswirkungen verschiedener Nährstoffe auf Varianten können durch die Größendosierung von Bakterien verglichen werden.