Name: Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Öğrenin Pseudomonas aeruginosa gen silme mutantları üretme ve fare enfeksiyon modelinde virülans zayıflama test etme yöntemini. Bu protokol genetik mühendisliği ve mikrobiyoloji araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir R44GM113545 ve P20GM103434 hibe.

<ol><li>Gellatly, S. L., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa%3A+new+insights+into+pathogenesis+and+host+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses.</a> Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).</li>
<li>Valentine, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+highly+attenuated+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+commercial+production+of+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate.</a> Microbial Biotechnology. , (2019).</li>
<li>Schweizer, H. P., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+system+for+gene+replacement+and+xylE+fusion+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Gene. 158 (1), 15-22 (1995).</li>
<li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).</li>
<li>Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa+lacking+the+extreme-stress+sigma+factor+AlgU+%28sigmaE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE).</a> Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).</li>
<li>Baeshen, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Biopharmaceuticals+in+E.+coli%3A+Current+Scenario+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).</li>
<li>Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+three+industrial+Escherichia+coli+strains+in+fed-batch+cultivations+during+high-level+SOD+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production.</a> Microbial Cell Factories. 12, 58(2013).</li>
<li>Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+factories+for+recombinant+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Microbial factories for recombinant pharmaceuticals.</a> Microbial Cell Factories. 8, 17(2009).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li>
<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77 (1), 61-68 (1989).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).</li>
<li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).</li>
<li>Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+10-min+method+for+preparation+of+highly+electrocompetent+Pseudomonas+aeruginosa+cells%3A+application+for+DNA+fragment+transfer+between+chromosomes+and+plasmid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation.</a> Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).</li>
<li>Liang, R., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scarless+and+sequential+gene+modification+in+Pseudomonas+using+PCR+product+flanked+by+short+homology+regions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions.</a> BMC Microbiology. 10, 209(2010).</li>
<li>Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+multiple+genomic+deletions+in+Gram-negative+bacteria%3A+analysis+of+the+multi-resistant+antibiotic+profile+of+Pseudomonas+putida+KT2440%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).</li>
<li>Song, C. W., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+inactivation+of+single+or+multiple+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli.</a> Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).</li>
<li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a-Assisted+Recombineering+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).</li>
<li>Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+and+prospects+of+microbial+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Practice and prospects of microbial preservation.</a> FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).</li>
</ol>

Yazar Hongwei D. Yu Baş Bilim Görevlisi ve Progenesis Technologies, LLC kurucularından biridir.

pEX100T-Not1 plazmid, marker içermeyen ve çerçeve içi ardışık genomik silmelerin etkili bir aracısi. Bakteri suşları zayıflatılmış virülans için mühendislik zaman, nokta mutasyonları üreten yerine tüm gen dizilerinin silinmesi öldürücü bir fenotip reversiyon olasılığını azaltır. Ayrıca, her patojengen delemesi patojeni daha da zayıflatarak zayıflama nın stabilitesini güçlendirir.
Bu yöntem aynı zamanda sadece plazmid kesici uç tasarımıdeğiştirerek, nokta mutasyonları ve eklemeler gibi deletion...

Pseudomonas aeruginosa insanlarda hayatı tehdit eden hastalıklara neden olabilir fırsatçı bir bakteriyel patojen, özellikle immunocompromised. P. aeruginosa patojenite proteazlar ve lipopolisakkarit de dahil olmak üzere birçok virülans faktörlerin ifade kaynaklanmaktadır, yanı sıra koruyucu bir biyofilm oluşturmak için yeteneği1. Virülans faktörleri üretme ve insanlarda hastalığa neden olma becerisi nedeniyle, P. aeruginosa'yı ticari ürünler yapmak için kullanmak güvenlik kaygılarını da ortaya çıkarmaktadır. E. coli nonpatojenik suşları geleneksel olarak insan kullanımı için tıbbi ve ticari ürünlerin biyomühendisliğinde kullanılmaktadır. Ancak, bazı ürünler E. coli yapmak zordur, ve birçok ekleme organları paketlenmiş, çıkarma zahmetli hale. Salgıverim büyük olasılıkla verimi artırmak ve arıtma süreçlerini kolaylaştırmak gibi, belirli ürünler yapmak ve salgılamak yeteneği ile tasarlanmış bakteriyel suşları, son derece arzu edilir. Böylece, diğer bakteri türlerinin patojenik olmayan suşları (örneğin, daha fazla salgı yolları kullanan türler) E. coli'yeyararlı alternatifler sağlayabilir. Biz son zamanlarda P. aeruginosabir suşu gelişimi rapor , PGN5, hangi organizmanın patojenitesi ve toksisitesi yüksek zayıflatılmış2. Daha da önemlisi, bu tür hala polisakkarit aljinat büyük miktarlarda üretir, P. aeruginosa biyofilm ticari olarak ilginç bir bileşeni.
PGN5 suşu, organizmanın patojenitesine katkıda bulunduğu bilinen beş geni(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA)sırayla silmek için pEX100T-NotI plazmid ile iki aşamalı bir allelik değişim prosedürü kullanılarak oluşturuldu. pEX100T-NotI Plazmid pEX100T, Herbert Schweizer's labgeliştirilenbirden fazla klonlama sitesi içinde bir NotI restriksiyon enzim tanıma sitesi SmaI değiştirerek oluşturuldu3 ,4. Restriksiyon enzimi NotI için tanıma sitesi SmaI ile karşılaştırıldığında daha nadir bir DNA dizisidir ve klonlanan dizilerde bulunma olasılığı daha düşüktür, bu nedenle klonlama amacıyla daha uygundur. Plazmid, ß-laktamaz kodlayan ve karbenisin direncini ortaya koyan bla geni ve sakaroza duyarlılık sağlayan B. subtilissacB geni de dahil olmak üzere seçime olanak sağlayan genleri taşır (Şekil 1A). Plazmid aynı zamanda E. coliile uyumlu çoğaltma(ori)ve konjugasyon yoluyla E. coli'den Pseudomonas türlerine plazmid transferine izin veren transferin(oriT)kökenini de taşır. Ancak, plazmid Pseudomonasile uyumlu çoğaltma bir kökeni yoksun , ve böylece Pseudomonas türleri içinde çoğaltmak olamaz (yani, bir Pseudomonas intihar vektörü). Bu özellikler pEX100T-NotI'yi Pseudomonas kromozomundaki genetik silmeleri hedeflemek için ideal kılmıştır. Plazmid klonlama adımları E. coli kullanılarak gerçekleştirilir ve ortaya çıkan plazmid dönüşüm veya konjugasyon ile Pseudomonas aktarılır. Daha sonra, homolog rekombinasyon olayları ve seçici adımlar sayesinde, hedeflenen çerçeve içi silme, işaretleyicisiz oluşturulur. P. aeruginosa kromozomundan genomik bölgeleri sırayla silebilmek için bu yöntem PGN5 gibi yüksek oranda zayıflatılmış Pseudomonas suşları oluşturmak veya diğer özel kullanımlar için suşları tasarlamak için kullanılabilir (örn. plazmid yayılımı için enforükleazlarda eksik suşlar veya ilgi proteinlerinin üretimi için protelazlarda eksik suşlar).
Bakteri suşlarının genel virülansı büyüme koşulları ve evrelerinden etkilenir ve bu süre zarfında mutasyonlar sık görülür. Bu nedenle, genetiği değiştirilmiş suşların güvenliğini ölçmek zor olabilir. Sistemik virülans için bakteriyel izole değerlendirmek için, C57BL/6 fareler5intraperitoneal enjeksiyon u tarafından daha önce yayınlanmış bir enfeksiyon protokolü uyarlanmış. Bu prosedürü, kullanılan suşların hassas dosupve kolay doğrulanmasına olanak sağlayan enjeksiyon için dondurulmuş bakteri stokları kullanmak üzere modifiye ettik. Bu modelde, Biyofarmasötik üretimi için FDA onaylı olan E. coli suşu BL21, suş göreceli patogenezi belirlemek için bir kontrol güvenlik standardı olarak kullanılmıştır6,7,8. Bu yöntemi kullanmanın en büyük avantajı, enfeksiyon öncesi ve sonrası bakteri hücre numarası, fenotip ve genetik belirteçler için doğrulanmış olan bulaşma suşları, tekrarlanabilir olması ve varyasyon kaynaklarını en aza indirmesidir. Bu kontrollü adımlarla gerekli hayvan sayısı azalır. Bu modelde, enjekte edilen intraperitoneally e. coli BL21'e eşit veya daha az C57BL/6 murine mortalite oranlarına neden olan P. aeruginosa suşları zayıflatılmış kabul edilebilir. Bu basit fare enfeksiyonu modeli, referans olarak FDA onaylı E. coli suşunu kullanarak diğer türlerden genetik olarak tasarlanmış suşların zayıflatılmış patojenliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. 1-7. adımlar P. aeruginosa (Şekil 1)ve 8-12 adımlarında sıralı genomik silmelerin oluşumunu ayrıntılı olarak inceleyin.

<table><tbody><tr><td>Düz kapaklı 0,2 mL tüpler</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0620</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>1 mL Şırınga</td><td>BD</td><td>22-253-260</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>1,5 mL tek kullanımlık polistiren küvet</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>2,0 mL Kriyojenik</td><td>Şişeler Corning</td><td>430659</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>27G iğne</td><td>BD</td><td>14-821-13B</td><td>ile Fisher Scientific</td></tr><tr><td>50 mL tüpler</td> aracılığıyla <td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td>Fisher Scientific Accublock aracılığıyla</td></tr><tr><td>Dijital Kuru Banyo</td><td>Labnet</td><td>NC0205808</td><td>Fisher Scientific Tezgah</td></tr><tr><td>Üstü Santrifüj 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>04-987-372</td><td>aracılığıyla</td></tr><tr><td>Tezgah Üstü Mikrosantrifüj</td><td>Sorvall</td><td>75-003-287</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Kabin İnkübatörü</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin disodyum tuzu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648250</td><td></td></tr><tr><td>Kültürü Test Tüpü, Polistiren</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-6D</td><td>Fisher Scientific aracılığıyla Tek</td></tr><tr><td>Kullanımlık Aşılama Döngüleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy UltraClean Mikrobiyal Kiti (50)</td><td>Qiagen</td><td>12224-50</td><td>veya tercih edilen yöntem/satıcı</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50)</td><td>Omega bio-tek</td><td>D6493-01</td><td>veya tercih edilen yöntem/satıcı</td></tr><tr><td>EcoRI-HF, kısıtlama endonükleaz</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101L</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon Küvetleri</td><td>Bulldog Bio</td><td>NC0492929</td><td>Fisher aracılığıyla Scientific</td></tr><tr><td>FastLink II DNA Ligasyon Kiti</td><td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Gentamisin Sülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Renksiz Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7833</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Isothesia Isofluran</td><td>Henry Schein aracılığıyla Hayvan Sağlığı</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina XRMS Serisi III In Vivo Görüntüleme Sistemi</td><td>Perkins ve Elmer</td><td>CLS136340</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin monosülfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LE agaroz</td><td>Genemate</td><td>3120-500</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Luria Et Suyu</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>MicroPulser aracılığıyla Elektroporatör</td><td>BioRad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Noble agar, Fisher</td><td>Scientific NotI-HF aracılığıyla ultra saf Affymetris/USB</td><td>AAJ10907A1</td><td></td></tr><tr><td>, kısıtlama endonükleaz</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189</td><td></td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su tozu</td> <td>aracılığıyla C404052Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Prizma 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td><a href="https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank">https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a</td></tr><tr><td>>Pseudomonas izolasyon agar</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas izolasyonu aracılığıyla et suyu</td><td>Alpha Biosciences</td><td>P16-115</td><td>Özel yapım toplu</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti (250)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>veya tercih edilen yöntem/satıcı</td></tr><tr><td>Çalkalama İnkübatörü</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4080</td><td>200 rpm'de sallama</td></tr><tr><td>SimpliAmp Termal Döngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız Süt</td><td>Difco</td><td>DF0032-17-3</td><td>aracılığıyla Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Küçük Plakalar (100 OD x 10 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spektrofotometre</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>veya tercih edilen yöntem/satıcı</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>Scientific S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Kürdan, yuvarlak</td><td>Elmas</td><td></td><td>Her marka kürdan, otoklavlanmış</td></tr><tr><td>TOPO TA Klonlama Kiti, sıralama için</td><td>Invitrogen</td><td>45-0030</td><td></td></tr><tr><td>XAF-8 Anestezi Sistemi Filtreleri</td><td>Perkins ve Elmer</td><td>118999</td><td></td></tr><tr><td>XGI 8 Gaz Anestezi Sistemi</td><td>Kaliper Yaşam Bilimleri/Xenogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa in-frame gen silme mutantlar Üretimi ve enfeksiyon basit bir fare modelinde virülans zayıflama sıiçin test

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Mikroorganizmalar genetik olarak çok yönlü ve çeşitlidir ve birçok ticari ürün ve biyofarmasötik kaynağı haline gelmiştir. Bu ürünlerin bazıları doğal olarak organizmalar tarafından üretilse de, diğer ürünler üretim verimini artırmak için organizmanın genetik mühendisliğine ihtiyaç duyarlar. Escherichia coli Avirulent suşları geleneksel biyofarmasötik üretmek için tercih edilen bakteri türleri olmuştur; ancak, bazı ürünlerin E. coli için üretmesi zordur. Böylece, diğer bakteri türlerinin avirulent suşları bazı ticari ürünlerin üretimi için yararlı alternatifler sağlayabilir. Pseudomonas aeruginosa, E. coli'yeuygun bir alternatif sunabilecek yaygın ve iyi çalışılmış bir Gram-negatif bakteridir. Ancak, P. aeruginosa fırsatçı bir insan patojenidir. Burada, pEX100T-NotI plazmid kullanarak sıralı genomik deletiyonlar yoluyla P. aeruginosa nonpatojenik suşları oluşturmak için kullanılabilecek bir prosedür ayrıntılı. Bu yöntemin en büyük avantajı işaretsiz bir gerinim üretmektir. Bu yöntem, ticari ürünlerin üretimi için yüksek zayıflatılmış P. aeruginosa suşları oluşturmak veya diğer özel kullanımlar için suşları tasarlamak için kullanılabilir. Biz de E. coliFDA onaylı BL21 suşu ile karşılaştırıldığında genetiği değiştirilmiş suşu zayıflatma test etmek için doğrulanmış test suşlarının intraperitoneal enjeksiyon yoluyla bakteriyel sistemik enfeksiyonun basit ve tekrarlanabilir fare modeli açıklar.

Şekil 2'degösterildiği gibi, hedeflenen genomik silme, ilgi bölgesini güçlendiren özel astarlarla koloni PCR kullanılarak doğrulanabilir. Genomik silme taşıyan koloniler, yabani tip kolonilere kıyasla daha kısa bir PCR bant boyutu sağlayacaktır. 10-12 koloniden oluşan bir PCR ekranı genellikle hedeflenen silme yitirmesini taşıyan en az bir koloniyi tespit etmek için yeterlidir. Birden fazla ekran turundan sonra silme işlemi algılanmazsa, çekimle başlayan yord...

Burada, abd gıda ve ilaç İdaresi (FDA) onaylı Escherichia coli ticari uygulamalar için karşılaştırıldığında Pseudomonas aeruginosa genetik olarak değiştirilmiş suşlarının zayıflamasını değerlendirmek için enfeksiyon fare modelibasit ve tekrarlanabilir bir protokol açıklar.

Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Bu protokol Pseudomonas aeruginosa genomunda zihin-beden istenilen mutasyonların oluşturulması ve belirlenmesi için önemlidir, yanı sıra tekrarlanabilir bir fare modelinde virülans azaltma mutasyonların etkisini test. Bu tekniğin en önemli avantajı krom doğrulama ve fare enfeksiyonu modelinin tekrarlanabilirliğidir. Bakteriler sürekli çalışıyor, sürekli değişiyor.Bu işlemi yavaşlatmak için, dondurulmuş bir durak kullanıyoruz, onları paketliyoruz, fare modelinde test etmeden önce modifikasyonda birden fazla basamak üzerine asıyoruz. Bu yöntemlere aşina olmayan biri büyük olasılıkla geliştirme ve olası crossover rekombinant seçimi ile test etmek için mücadele edecektir. Ayrıca, enfeksiyon için farelerin kullanımı hayvan çalışmaları yabancı biri için zor olacaktır.Bu yöntem diğer patojenlerin ve mutantlarının test edilmesinde ve farelerde virülans bulaşmasıiçin uygulanabilir. Mevcut modeller ile karşılaştırıldığında, tekrarlanabilirlik artı enfeksiyon öncesi ve sonrası klon doğrulama ile prosedürler alanında diğer araştırmacılar yararlanabilir. Bu protokolün görsel gösterimi, tek başına okuma yoluyla anlaşılması veya anlaşılması zor olabilecek kapsamlı prosedürlere içgörü sağlar.Pseudomonas Isolation Broth veya PIB tek crossover, rekombinant koloniler büyüyerek başlayın. Aşılamak ve her kültürün 10 mikrolitre önceden ısıtılmış PIA plakaları üzerine, 10% sakaroz ile takviye. Sonra tabakları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, kuvözden plakaları çıkarın ve büyüme için onları kontrol edin. Sakarozdirençli koloni çift crossover rekombinantlar olmalıdır. Pia önceden ısıtılmış plakalar üzerine en az 20 kolonileri yama steril kürdan kullanın, PIA ile takviye 10%sakaroz, ve PIA carbenicillin ile desteklenmektedir.Bir gecede plakaları kuluçkaya yatırın ve ertesi gün büyüme için inceleyin. Gerçek çift crossover rekombinantlar karbenicillin duyarlı ve sakaroz dirençli olacaktır. Kolonya PCR kullanarak silme için 10 ila 20 koloniyi ekran.Steril bir kürdan ile şüpheli bir çift crossover rekombinant büyüme pick up ve PBS 50 mikrolitre askıya. Süspansiyonu 100 derecede 10 dakika kaynatın. 13,000 kez G'de üç dakika santrifüj edin ve buza yerleştirin.Daha sonra, el yazması talimatlara göre PCR gerçekleştirin. PCR tamamlandıktan sonra, ürünler üzerinde Agarose jel elektroforez gerçekleştirin. Daha küçük amplifikasyon ürünleri, ilgi alanının silindiği kolonileri gösterir.Enjeksiyonsabahı, bakteri hücrelerinin cryovials dört santigrat üç ila dört saat boyunca çözülür. Şişeleri erittikten sonra buzda tutun ve farelere iki saat içinde enjekte edin. Her cryovial içeriğini yeni bir iki mililitrelik tüp ve santrifüj için 4, 500 kez G 10 dakika aktarın.Supernatant atın ve pbs bir mililitre hücre pelet yeniden askıya. Santrifüjü tekrarlayın ve PBS'deki hücreleri mililitrede 9 koloni oluşturan ünitelere 2,5 kat 10'luk son konsantrasyona kadar yeniden askıya alın. Konsantrasyonu, genotipi ve fenotipi doğrulamak için her suş son süspansiyon üç örnek alın.Her zorlanma için, iki mililitrelik bir tüp içine hücre süspansiyon 1.5 mililitre aliquot ve kontrol enjeksiyonları için PBS hazırlamak. Steril bir hayvan cerrahi odasında enjeksiyonlar için gerekli fare ve malzemeleri toplayın ve başlamadan önce dezenfekte mendil ile tüm yüzeyleri silin. Isırılırsa delinme riskini sınırlamak için iki çift lateks eldiven, laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri ve yüz maskesi giyin.Fareyi kafesten çıkarın ve tartının, kuyruk işaretini enjeksiyon sonrası izleme için kalıcı marker ile işaretleyin. 27 gauge iğne ile yeni bir mililitreşşü açın ve 200 mikrolitre steril PBS çekin. Başparmağı ve işaret parmağını kullanarak fareyi kulaklarının arkasından yakalayın ve ensede bir deri kıvrımı oluşturmak için çimdiklayın.Daha sonra, fare düz ve hareketsiz tutmak için serçe parmağı kullanarak avuç içine kuyruk güvenli. İğneyi 30 derecelik bir açıyla orta hattın solundaki veya sağına periton boşluğuna yerleştirin. Organlara takılmadığından emin olmak için iğneyi hafifçe kaldırın.Sonra, yavaş yavaş PBS enjekte ve iğne çekin. Enjeksiyon yerinde bir bolus tipiktir. İğneyi belirlenen keskinlik leri imha kabına yerleştirin ve fareyi ayrı bir kafese taşıyın.Bir sonraki fare ile prosedürü tekrarlayın ve bir kafesteki tüm fareler enjekte edildikten sonra, onları orijinal kafesine geri taşıyın. Kontrol grubuna enjekte ettikten sonra, aynı prosedürü kullanarak test gruplarına enjekte edin. Tüm enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, fareleri barınma odasına geri getirin ve çalışma alanını dezenfekte mendillerle temizleyin.Hayvanları görüntülemek için, kamera parametrelerini ayarlayarak ve sahneyi ısıtarak görüntüleme sistemini hazırlayın. Oksijen akışını dakikada 1,5 litreye ve izofluranı %3,5'e ayarlayın ve fareyi anesteziden sonra sabitlenen sıcaklık aşamasına, anestezi odasına taşıyın. Fareyi kollarını uzatarak sırtına yerleştirin ve görüntüleme sırasında %2,5 izofluran uygulanması için bir burun konisi sığdırın.Kapıyı kapatın ve farenin biyolüminesans görüntülerini ve röntgenlerini alın. Görüntüleme tamamlandığında fareyi kafesine geri döndürün ve izleyin. 3-5 dakika içinde kendine gelecek.Hedeflenen genomik silmeler, ilgi bölgesini güçlendiren özel astarlarla koloni PCR tarafından doğrulandı. Genomik silme ile koloniler yabani tip kolonilere göre daha kısa bir PCR bandı verim. P aeruginosa zayıflatılmış suşu intraperitoneal enjeksiyon, PGN beş, 0% mortalite ile sonuçlandı, E.coli BL ile gözlenen mortaliteye eşdeğer 21.Ancak ebeveyn türünün enjeksiyonu farelerin %80'ine göre ölümcüldü. Enfeksiyon progresyonu biyolüminesans işaretli ebeveyn ve zayıflatılmış suşlar kullanılarak izlendi. Zayıflatılmış suşu, biyolüminesans solana kadar enjeksiyon yerinde lokalize olarak kaldı, ki bu da büyük olasılıkla enfeksiyonun temizlenmesiyle çakıştı.Sunulan yöntem sadece suş tarafından üretilen mortalite incelenmiştir. Daha derinlemesine immünolojik ve toksikolojik yönleri enfeksiyon dinamikleri ve enfeksiyon ölümle sonuçlanmaz son etkisi belirlemek için kullanılabilir. Prosedürdeki en önemli şey, ilk tanımlamadan hayvan testlerine kadar çeşitli adımlar arasında yapılan kapsamlı doğrulamadır.Test edilen suşlar mutasyon alabildiği veya kontamine olabileceğinden, belirli doğrulama adımlarının eksik olması potansiyel olarak yanlış sonuca yol açabilir. Bu iki tekniğin geliştirilmesi ile, bu enfeksiyon immünoloji alanında araştırmacılarımızın daha etkili nasıl güçlü paket etkileşimaşırı fenotip, sepsis ve mortalite yol açtığını araştırmak için izin olacağını düşünüyorum. Farklı besinlerin varyantlar üzerindeki etkisi bakterilerin boyut dosing ilerleyerek karşılaştırılabilir.

generation-frame-gene-deletion-mutants-pseudomonas-aeruginosa-testing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Valentine, M. E., ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa'da Çerçeve İçi Gen Silme Mutantlarının Üretilmesi ve Basit Bir Fare Enfeksiyon Modelinde Virülans Zayıflaması Testi. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, farelerde öldürücü ve zayıflatılmış bakteri suşlarının in vivo davranışını görselleştirmek ve karşılaştırmak için biyolüminesans kullanımını göstermektedir. Biyolüminesans bakteri süspansiyonlarının hazırlanmasını ve bunların farelere intraperitoneal enjeksiyonunu özetlemektedir. Öldürücü...

Biyolüminesans Kullanarak Farede Bakteriyel Enfeksiyon Dinamiklerini İzleme

Kaynak: Valentine, M. E., ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa'da Çerçeve İçi Gen Silme Mutantlarının Üretilmesi ve Basit Bir Fare Enfeksiyon Modelinde Virülans Zayıflaması Testi. J. Vis. Uzm. (2020).Bu video, plazmit bazlı bir gen silme stratejisi kullanılarak Pseudomonas aeruginosa'da çift çaprazlamalı rekombinantların üretimini göstermektedir. İşlem, tek bir çaprazlama yoluyla genoma entegre edilmiş replikatif olmayan bir plazmidi barındıran bakterilerin seçilmesini ve ardından plazmidi...

Hedeflenen Gen Silme için Pseudomonas aeruginosa'nın Çift Çaprazlama Rekombinantlarının Üretilmesi

Kaynak: Valentine, M. E. ve diğerleri, Pseudomonas aeruginosa'da Çerçeve İçi Gen Silinme Mutantlarının Üretimi ve Basit Fare Enfeksiyon Modelinde Virulans Zayıflamasının Testi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyonu izlemek için biyolüminesans tabanlı görüntüleme yaklaşımının kullanıldığını göstermektedir. Ardışık biyolüminesans ve X-ışını görüntüleme, konak genelinde yayılan enfeksiyonun gerçek zamanlı görselleştirmesi ve anatomik lokalizasyonu mümkün...

Biyolüminesans kullanarak fare modelinde bakteriyel enfeksiyonun gerçek zamanlı görüntülemesi

Streptococcus pneumoniae ciddi toplum kökenli pnömoni ve dünya çapında 2 milyondan fazla kişinin ölümünden sorumludur neden lider patojen olduğunu. Spor ya da virülans karıştığı bakteriyel faktörlerin etkisi biyolüminesens bakterileri kullanarak akut fare pnömoni veya bakteriyemi modelinde gerçek zamanlı olarak izlenebilir.

Biyoluminesen Bakteriler Kullanılarak Gerçek Zamanda Bir Akut Fare Pnömoni Modelinde Pnömokok virulans faktörlerinin etkisi aşağıdaki

Burada, ekrana yüksek yoğunluklu ekleme mutant kütüphanesi oluşturmak için mini-transpozon himar1 mariner dolayımlı mutagenez kullanılarak bir protokol açıklar izole edilmesi ve prototipik Pseudomonas aeruginosa'nın PAO1 in yeni alginat regülatörleri belirlemek.

Alginat içinde üretimi ile ilişkili yeni genlerin tanımlanması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emKullanma&gt; Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner Transposon dolayımlı mutagenez

Burada, mikrobiyal etkileşim çalışmaya çok yönlü ana model olarak Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar mevcut.

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Burada, C. elegansenfeksiyonunda Aeromonas çalışmaya üç farklı deneyler tanıtmak. Bu uygun yöntemler kullanarak, arasında ve Aeromonas türleri içinde toksisitesi değerlendirmek kolaydır.

Virülans ve Aeromonas enfeksiyon Caenorhabditis elegans modelindeki patogenezinde değerlendirilmesi

Burada tanımlanan floksed kaset allelic değişim mutagenezi, FLAEM kullanarak Chlamydia trachomatis hedefli, markerless gen delemesi için bir yöntemdir.

Klamidya trachomatis Floxed Kaset Allelic Exchange Mutagene tarafından Markerless Gen Deletion

Küçük bir kodlamayan RNA micC'nin delesyon mutantını oluşturmak için λ-Kırmızı aracılı bir rekombinasyon sistemi kullanıldı.

Kodlamayan küçük RNA MicC, salmonella enteritidisteki dış zar proteinlerinde virülansa katkıda bulunur

Burada, Aeromonas'ın boş mutantlarının spesifik glikoziltransferazlarda veya glikoziltransferazlar içeren bölgelerde yapımını, motilitesi testlerini ve flagella saflaştırmasını, kodlanmış enzimlerinin bir glikanın biyosentezindeki katılımını ve işlevini ve bu glikanın bakteriyel patogenezdeki rolünü tanımlamaktayız.

Bakteriyel Glikoziltransferazların Bakteriyel Motilitedeki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretilmesi

Öğrenin Pseudomonas aeruginosa gen silme mutantları üretme ve fare enfeksiyon modelinde virülans zayıflama test etme yöntemini. Bu protokol genetik mühendisliği ve mikrobiyoloji araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test (Video) | JoVE Journal

Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test

Daha fazla video keşfet