Name: Experimenteller Ansatz zur Untersuchung der Leptin-Signalisierung in den Carotis-Körpern und ihrer Auswirkungen auf die Kontrolle der Atmung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Erfahren Sie, wie Leptin-Signalwege in den Carotis-Körpern die hypoxische Ventilationsantwort bei Mäusen regulieren. Diese Methode nutzt Plethysmographie und Denervierungstechniken zur Analyse der Atemkontrolle.

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Alle experimentellen Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (MO18M211) genehmigt.
1. Leptin-Infusion
HINWEIS: Um die Wirkung von Leptin auf die Atmung zu untersuchen, infundierten wir Leptin subkutan in mageren C57BL/6J-Mäusen durch eine osmotische Pumpe, um die zirkulierenden Leptinspiegel auf jene zu erhöhen, die bei übergewichtigen Mäusen beobachtet wurden.
<ol><li>
Osmotische Pumpenvorbereitung
	<ol>
<li>Wiegen Sie die leere Pumpe, um das Nettogewicht der geladenen Lösung zu überprüfen.</li>
		<li>Leptin (5 mg/ml) der osmotischen Pumpe (1 L/h für 3 Tage) hinzufügen. Füllen Sie die Pumpe mit einer kleinen Spritze (1 ml). Schließen Sie nach dem Befüllen die Pumpe mit dem mitgelieferten stumpf gekippten 27-Spur-Füllrohr. HINWEIS: Die Spritze und das angeschlossene Rohr sollten frei von Luftblasen sein.</li>
		<li>Nach dem Befüllen die Pumpe erneut wiegen, um das Nettogewicht der Lösung zu überprüfen.</li>
		<li>
Setzen Sie die Leptinpumpe subkutan in den interskapularen Bereich ein. HINWEIS: Wenn Sie die Infusion sofort starten möchten, inkubieren Sie die Fertigpumpe bei 37 °C bei 37 °C für mindestens 4 bis 6 h (vorzugsweise über Nacht).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Hypoxische Ventilatory Response (HVR)
HINWEIS: Thermoneutrale Bedingungen eliminieren Stressfaktoren, die durch kühle Umgebungstemperatur verursacht werden, und verändern den Stoffwechsel bei Mäusen erheblich. Daher sollten alle Atemmessungen unter den thermoneutralen Bedingungen (t = 30 °C) mit einem neonatalen Inkubator12 durchgeführt werden (Abbildung 1A). Die Ganzkörper-Plethysmographiekammer (WBP) wurde für alle Messungen verwendet. Alle Tiere sollten an die barometrische Plethysmographiekammer und an einen Scheinhalshalsband für die anschließende Pulsoximetrieaufzeichnung für 3-5 Tage vor den HVR-Messungen akklimatisiert werden. HVR wird zwischen 10 und 17 Uhr aufgezeichnet. HVR wird während des Schlafes unterdrückt, daher kann es separat während des Schlafes und der leisen Wachheit13gemessen werden. Um das spezifische Schlaf-Wach-Stadium des Tieres während der HVR-Messung zu gewährleisten, sollten EEG/EMG-Elektroden als EEG/EMG-Kopfhalter wie zuvor beschrieben14implantiert werden. Tiere sollten sich nach dem Kopfaufstand mindestens 72 h erholen dürfen. Schlaf-Inszenierung sollte in 5 s Epochen durchgeführt werden. NREM-Schlaf wird durch die langsame EEG-Aktivität erkannt, die mehr als 50% der Epoche einnimmt. Ruhige Wachheit manifestiert sich durch die Alpha-EEG-Aktivität in Abwesenheit von Bewegungen. REM-Schlaf wird durch die vorherrschende Alpha- und Theta-EEG-Aktivität in Gegenwart eines reduzierten Muskeltonus auf EMG identifiziert. In der Regel wird DER REM-Schlaf während der HVR-Gasherausforderungen nicht beobachtet.
<ol><li>Das HVR-Aufzeichnungsprotokoll
	<ol>
<li>Verwenden Sie die WBP-Kammer der folgenden Größe: Innendurchmesser von 80 mm, Höhe 50,5 mm und Volumen von 0,4 l. Die WBP-Kammer besteht aus zwei Kammern, versiegelten und Referenzkammern, und eine kreisförmige Plattform, um die Maus zu platzieren14 (Abbildung 1B). Zu- und Abfluss innerhalb der Kammer werden durch positive und negative Druckquellen gesteuert, die den atmosphärischen Druck aufrecht erhalten. Diese Steuerung erzeugt einen stetigen Bias-Flow in der Kammer und verhindert eineCO2-Retention. Weitere Informationen über die Einrichtung der WBP finden Sie unter Hernandez und Kollegen15.</li>
		<li>Messen Sie die Temperatur innerhalb der Kammer und die relative Luftfeuchtigkeit im Raum, bevor Sie die Maus in den WBP legen.</li>
		<li>Messen Sie das Körpergewicht und die rektale Temperatur.</li>
		<li>Legen Sie den Oximeterkragen um den Hals der Maus (der Bereich sollte zuvor rasiert werden).</li>
		<li>Legen Sie die Maus in den WBP und stellen Sie sicher, dass die Kammer vollständig versiegelt ist, um Luftlecks zu vermeiden.</li>
		<li>Warten Sie ca. 30 min, bis die Maus leise ist und die Kammer ein konstantes Volumen hat.</li>
		<li>Normoxia: nach 30 min, wenn die Maus leise ist, beginnen Sie die Aufzeichnung der Atemsignale und der peripheren Sauerstoffsättigung (SpO2) in der Normoxia-Phase (21% FiO2 bei 1 atm Druck) für 20 min, mit LabChart 7 Pro (Version 7.2).</li>
		<li>Hypoxie: nach 20 min ruhiger Normoxia, beginne die Aufzeichnung des ersten Zyklus der akuten Hypoxie und SpO2. Für hypoxia Phase, setzen Sie die Tiere einem konstanten Gemischten Gasstrom aus 10%O2 und 3%CO2 für 5 min.<ol>
<li>Während der ersten 30 Sek. Hypoxie fließt das Mischgas durch die Kammer über 2 kleine Seitenanschlüsse an der Basis, so dass der FiO2 von 21% (bei 1 atm Druck) auf 10% fallen kann.</li>
			<li>Schließen Sie nach den anfänglichen 30 s einen der kleinen Seitenanschlüsse der WBP-Kammer und halten Sie die Aufzeichnung bei der konstanten Hypoxie bei 10% FiO2 für 5 min. HINWEIS: Die Mischung aus 10%O2 und 3%CO2 bei Hypoxie wird verwendet, um eucapnea11zu erhalten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nach den 5 min Hypoxie, setzen Sie die Maus wieder Raumluft (21% FiO2 bei 1 atm Druck) durch Schalten der Zuflussquelle.</li>
		<li>Warten Sie mindestens 30 min bis zur nächsten Normoxia-Aufnahme, um sich von der vorherigen hypoxischen Exposition zu erholen, um das beatmungstreue Roll-off-Phänomen zu vermeiden (d. h. zentrale Unterdrückung der Atmung während der Hypoxie16). HINWEIS: Wiederholen Sie Normoxia/Hypoxie-Zyklen dreimal in jeder Maus, um die Reproduzierbarkeit der Messungen zu gewährleisten. Nach unserer Erfahrung sollten zusätzliche (mehr als 3 Mal an einem bestimmten Tag) hypoxischen Expositionen aufgrund der Beatmungsanpassung (das Roll-off-Phänomen) vermieden werden.</li>
		<li>Kalibrieren Sie am Ende des Experiments die WBP-Kammer (mit der Maus ist noch im Inneren) durch Injektion von 1 ml Raumluft 3 mal mit einer Spritze, die in einem der kleinen Seitenanschlüsse an der Basis der Kammer eingesteckt ist.</li>
		<li>Messen Sie die Temperatur in der Kammer wieder mit dem Tier darin.</li>
		<li>Öffnen Sie die Kammer und messen Sie die Rektaltemperatur der Maus, bevor Sie sie wieder in ihren Heimischenkäfig legen.</li>
	</ol></li>
	<li>HVR-Berechnung
	<ol>
<li>Digitalisieren Sie alle Signale für die HVR-Berechnung bei 1.000 Hz (Abtastfrequenz pro Kanal). HINWEIS: Die WBP-Gezeitenvolumenanalyse wird in Lab Chart 7 basierend auf Drorbaugh und Fenn Gleichung17durchgeführt. Erforderliche Variablen sind die Rücksektemperatur der Maus und die Kammertemperatur (vor und nach der HVR-Messung), die relative Luftfeuchtigkeit und die Kammergaskonstante. Diese Konstante resultiert aus der WBP-Druckverformung nach den 1 ml Lufteinspritzungen in der Kalibrierphase. Weitere Informationen finden Sie unter Hernandez und Kollegen15.</li>
		<li>Nach der Berechnung der Drorbaugh- und Fenn-Gleichung multiplizieren Sie den Gezeitenvolumenkanal (Vt) mit der Konstante.</li>
		<li>
Auswahl von Aufzeichnungen für die Analyse
		<ol>
<li>Normoxia: Wählen Sie nur Abschnitte der gleichmäßigen Atmung mit konstantem Gezeitenvolumen. Vermeiden Sie Abschnitte in unmittelbarer Nähe zu Mausbewegungen.</li>
			<li>Hypoxie: Verwerfen Sie die ersten 30 s, wenn dieO2-Werte von 21% auf 10% sinken, wählen Sie Abschnitte von 30 s bis 2 min von 10%O2 Exposition (ein 90 s Intervall). Wählen Sie innerhalb dieses Intervalls nur Abschnitte mit gleichmäßiger Atmung mit konstantem Gezeitenvolumen aus. Vermeiden Sie Abschnitte in unmittelbarer Nähe zu Mausbewegungen. Die Analyse ist zuverlässig, wenn in jedem Zyklus mindestens 10 s Hypoxie ausgewählt werden. HINWEIS: Die periphere Komponente von chemoreflex, die von CB gesteuert wird, überwiegt während der ersten 1-2 min Exposition16,18,19. In der zweiten Phase, zwischen 2 min und 5 min hypoxischer Exposition, spielen sowohl periphere als auch zentrale Komponenten eine Rolle. Schließlich ist die dritte Phase, > 5 min, durch Hypoventilation (das Roll-off-Phänomen) gekennzeichnet, die überwiegend von zentralen Chemorezeptoren gesteuert wird. Unsere Erfahrung zeigt, dass Mäuse während der hypoxischen Exposition oft wach sind, weil die manuellen Schalter in der Luftstromquelle.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berechnen Sie nach der Auswahl die mittlere Minutenbelüftung (VE) bei normoxischen und hypoxischen Bedingungen mit der Formel VE = Atemfrequenz X Gezeitenvolumen.</li>
		<li>Berechnen Sie den mittleren SpO2 bei Normoxia und Hypoxie-Bedingungen.</li>
		<li>Berechnen Sie den HVR manuell mit der Formel HVR = (VE (10% O2) - VE (21%O2)) / (SpO2 (10% O2) – SpO2 (21% O2)). HINWEIS: Bei C57BL/6J-Mäusen kann die osmotische Pumpe zur Leptinin-Infusion die genaue SpO2-Signalerkennung durch den Halskragen beeinträchtigen. In diesem Fall wird HVR auf Basis der FiO2-Werte bei normoxischen und hypoxischen Bedingungen berechnet, da HVR = -VE / FiO211.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Karotis Körper Denervation oder Carotis Sinus Nervendissektion (CSND)
HINWEIS: Wir führten eine kombinierte chirurgische und chemische Denervation im Abstand von einer Woche durch, da die chirurgische Denervation allein den hypoxischen Chemoreflex nicht abschafft.
<ol><li>
Chirurgische Präparation
	<ol>
<li>Führen Sie alle Verfahren an erwachsenen männlichen C57BL/6J Mäusen durch. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente. Verwenden Sie sterile chirurgische Handschuhe, Spritzen und Wattestäbchen.</li>
		<li>Anästhetisieren Sie männliche C57BL/6J-Mäuse mit 1-2% Isofluran mit einem Nasenkegel und legen Sie eine warme Decke, um Unterkühlung zu verhindern. Isofluran wird sorgfältig titriert, um die Atemfrequenz bei 1 Hz (60 Atemzüge/min) aufrechtzuerhalten. Die Angemessenheit der Anästhesie vor Beginn der Operationen wird durch die Atemfrequenz, das Fehlen von Bewegungen und hörbaren Geräuschen, das Fehlen einer Reaktion auf taktile Reize und den Vorder- oder Hinterbeinpedal-Entzugsreflex beurteilt.</li>
		<li>Buprenorphin (0,05 mg/kg) intraperitoneal verabreichen, um Schmerzbeschwerden zu verhindern. Entfernen Sie das Haar an der ventralen Stelle des Halses und desinfizieren Sie den Bereich mit Betadin und Alkohol.</li>
		<li>Um hornhautaustrocknung zu verhindern, schmieren Sie die Augen der Mäuse während der Anästhesie mit steriler ophthalmologischer Salbe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CSND-Verfahren Stufe 1: Chirurgische Denervation<ol>
<li>Nach dem Mittellinienschnitt, entlarven Sie die Bifurkation der gemeinsamen Karotisarterien durch Entfernen von Bindegewebe und Fettgewebe.</li>
		<li>Identifizieren Sie den hypoglossalen Nerv, der in der Regel sehr prominent ist, und heben Sie ihn dann auf, um den Glossopharyngealnerv direkt darunter freizulegen. Sezieren Sie Karotis-Sinusnerven bilateral mit Mikrofederschere.</li>
		<li>Schließen Sie den Schnitt mit 6-0 Seidennaht.</li>
		<li>1 ml normaler Saline subkutan verabreichen, um Austrocknung zu verhindern.</li>
		<li>Beherbergen Sie die Mäuse in einer Erholungskammer und überwachen Sie ihr Verhalten alle 15 min für die ersten 1 h, bis die Mäuse das Bewusstsein wiedererlangen, um die Brustbeschisse aufrechtzuerhalten. Bringen Sie die Mäuse in ihre heimischen Käfige zurück, nachdem sie vollständig geborgen wurden. Überwachen Sie die Mäuse zweimal täglich für die nächsten 3 Tage. Geben Sie zusätzliches Buprenorphin, wenn Mäuse Anzeichen von Schmerzen zeigen (z. B. verminderter Appetit, Unruhe). Stufe 2: Chemische Denervation</li>
		<li>Eine Woche nach der Operation die Halsschlagader mit einer Lösung von 2% Phenol in Ethanol verdünnt an den Punkten der Verzweigung vom Glossopharyngealnerv zum Schädelpol des CB malen. Die gleiche postoperative Versorgung sollte nach der chemischen Denervation erfolgen, wie oben im Abschnitt der chirurgischen Denervation beschrieben. HINWEIS: Für eine Scheinchirurgie-Gruppe werden die gleichen Verfahren mit Ausnahme der Karotis-Sinus-Nervensektion durchgeführt.</li>
		<li>Lassen Sie die Tiere 5-7 Tage vor HVR-Messungen erholen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Expression von LepRb im CB mit einem adenoviralen Vektor (Ad-LepRb) vs Control (Ad-LacZ)
<ol><li>
Ad-LepRb und Ad-LacZ Suspension
	<ol>
<li>Transfetiere die Mäuse mit Adenovirus (Ad-LepRb-GFP, 2-5x1010 pfu/mL für Überexpression, Ad-Lacz, 1 x10 10 pfu/mL zur Kontrolle) in den CB-Bereich.</li>
		<li>Die Matrigel-Matrix auftauen, indem Sie die Durchstechflasche über Nacht in einem 4 °C-Kühlschrank in Eis tauchen.</li>
		<li>Adenovirus in flüssiger Matrigel-Matrix bei 1:5 (1 L Matrigelmatrix und 4 l Adenovirus bilateral aufgetragen) vorsichtig aussetzen.</li>
		<li>Halten Sie die virale Suspension immer auf Eis, bis sie im CB aufgetragen wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chirurgische Präparation
	<ol>
<li>Verwenden Sie dieselben chirurgischen Instrumente wie das CSND-Protokoll.</li>
		<li>Anästhetisieren Sie LepRb-mangelhafte db/db Mäuse mit 2-2,5% Isofluran mit einem Nasenkegel und legen Sie die Tiere auf eine warme Decke, um Unterkühlung zu verhindern. Isofluran wird sorgfältig titriert, um die Atemfrequenz bei 1 Hz (60 Atemzüge/min) aufrechtzuerhalten. Die Angemessenheit der Anästhesie wird anhand der Atemfrequenz, des Fehlens von Bewegungen und hörbaren Geräuschen, des Fehlens einer Reaktion auf taktile Reize und des Vorder- oder Hinterbeinpedal-Entzugsreflexes beurteilt.</li>
		<li>Buprenorphin (0,05 mg/kg) intraperitoneal verabreichen.</li>
		<li>Entfernen Sie das Haar an der ventralen Region des Halses und desinfizieren Sie den Bereich mit Betadin und Alkohol wie im CSND-Protokoll.</li>
		<li>Um hornhautaustrocknung zu verhindern, schmieren Sie die Augen der Mäuse während der Anästhesie mit steriler ophthalmologischer Salbe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adenovirus-Behandlung des CB
	<ol>
<li>Expose CBs, wie im CSND-Protokoll beschrieben, und wenden Sie 5 l der viralen Suspension auf den CB-Bereich bilateral an.</li>
		<li>Warten Sie 2-3 min, bis die flüssige Matrigelmatrix zu einem Gel wird. Nachdem Sie bestätigt haben, dass die virale Suspension konggealed wurde, schließen Sie den Schnitt mit 6,0 Seidennaht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nach der Operation
	<ol>
<li>Beherbergen Sie die Mäuse in einer Erholungskammer und überwachen Sie ihr Verhalten alle 15 min für die ersten 1 h, bis die Mäuse das Bewusstsein wiedererlangen, um die Brustbeschisse aufrechtzuerhalten. Bringen Sie die Mäuse in ihre heimischen Käfige zurück, nachdem sie vollständig geborgen wurden. Überwachen Sie die Mäuse zweimal täglich für die nächsten 3 Tage. Geben Sie zusätzliches Buprenorphin, wenn Mäuse Anzeichen von Schmerzen zeigen (z. B. verminderter Appetit, Unruhe).</li>
		<li>Verabreichen Sie Buprenorphin (0,05 mg/kg) nach Bedarf, um Schmerzbeschwerden während der postoperativen Periode zu verhindern.</li>
		<li>Messen Sie HVR 9 Tage nach der Adenovirus-Transfektion.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine gegensätzliche Interessen oder Enthüllungen.

Der Schwerpunkt unserer Studie lag auf der Untersuchung der atmungseren Wirkungen der Leptin-Signalisierung im CB. Mehrere Protokolle wurden entwickelt, um die Rolle von Leptin in einer mechanistischen Weise zu bewerten. Zunächst wurde der spezifische Beitrag von CB zum HVR durch sorgfältige Quantifizierung des HVR während der ersten 2 min hypoxischer Exposition analysiert. Zweitens wurde die Relevanz von CB für die Leptin-vermittelte Up-Regulierung der Kontrolle der Atmung durch zwei sich ergänzende Ansätze untersucht. ...

Ein Adipozyten produziert Hormon Leptin wirkt im Hypothalamus, um die Nahrungsaufnahme zu unterdrücken und die Stoffwechselrate zu erhöhen. Studien in unserem Labor1,2 und von anderen Forschern3,4 zeigten, dass Leptin die hyperkapnische Beatmungsreaktion (HVR) erhöht, die Adipositas-Hypoventilation bei Leptin verhindert Mangelanung von Adipositas. Jedoch, die Mehrheit der übergewichtigen Personen haben hohe Plasma-Leptin-Spiegel und zeigen Resistenz gegen die metabolischen und atmungsischen Wirkungen des Hormons5,6,7,8. Die Resistenz gegen Leptin ist multifaktoriell, aber die begrenzte Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke (BBB) gegen Leptin spielt eine wichtige Rolle. Wir schlagen vor, dass Leptin unterhalb von BBB in einem Schlüsselorgan der peripheren hypoxischen Empfindlichkeit wirkt, die Karotiskörper (CB), um die Atmung bei übergewichtigen Personen zu verteidigen. CBs drücken die lange funktionelle Isoform des Leptinrezeptors, LepRb, aber die Rolle von CB bei den atmungseren Wirkungen von Leptin wurde nicht ausreichend aufgeklärt9,10.
Das Ziel unserer Methode war es, die Wirkung der Leptin-Signalisierung im CB auf HVR zu untersuchen. Unsere Begründung war, (a) Denkausnehmen von Funktionsexperimenten bei Mäusen mit intakten Karotiskörpern und denervierten Karotiskörpern durchzuführen, gefolgt von HVR-Messungen; b) Verstärkung von Funktionsexperimenten an db/db-Mäusen ohne LepRb, bei denen wir den HVR zu Beginn und nach Expression von LepRb ausschließlich in CB gemessen haben. Der Vorteil unserer Techniken war, dass wir alle unsere Experimente an hemmungslosen ungeästheten Mäusen während des Schlafes und der Wachheit durchführten. Frühere Forscher führten ihre Experimente entweder unter Anästhesie9 durch oder maßen die Auswirkungen von Leptin während des Schlafes10nicht. Darüber hinaus ist unsere Studie die erste, die einen einzigartigen Funktionsgewinnansatz mit selektiverLepR-b-Expression in CB verwendet, die oben beschrieben wurde.
Im breiten Kontext kann unser Ansatz auf andere Rezeptoren verallgemeinert werden, die in CB ausgedrückt werden, und ihre Rolle bei der hypoxischen Empfindlichkeit. Die Ermittler können einen Liganden zu einem Rezeptor von Interesse einlüfühlt und den HVR zu Beginn und nach CB-Denervation messen. Als komplementärer Ansatz kann ein Interessenrezeptor in CB-Messungen überexprimiert werden und HVR-Messungen können vor und nach der Überexpression mit unserer in diesem Manuskript beschriebenen Technologie durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>1 mL Insulinspritzen</td><td>BD Biosciences</td><td>309311</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7,4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Ad-Lacz</td><td>Dr. Christopher Rhodes (University of Chicago)</td><td></td><td>1 x 1010 pfu/mL</td></tr><tr><td>Ad-LepRb-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>ADV-263380</td><td>2-5 x 1010 pfu/mL</td></tr><tr><td>Narkosewagen</td><td>Atlantic Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin (Buprenex)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>C57Bl/6J</td><td>Jackson Labor</td><td>000664</td><td>Mäusestamm</td></tr><tr><td>Baumwolle Gaze Schwämme</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>db/db</td><td>Jackson Labor</td><td>000697</td><td>Mäusestamm</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Vetone</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Labor Chart</td><td>Data Science International (DSI)</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spring Scissors</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Maus Ox Plus</td><td>STARR Life Sciences Corp.</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Maus Ox Plus Collar Sensor</td><td>STARR Life Sciences Corp.</td><td>015022-2</td><td>Mittlerer Kragenclip Spezial 7"</td></tr><tr><td>Maus Ganzkörper-Plethysmographie-Kammer</td><td>Data Science International (DSI)</td><td>PLY3211</td><td></td></tr><tr><td>Ohio Care Plus Inkubator</td><td>Ohmeda</td><td>HCHD000173</td><td></td></tr><tr><td>Operationsschere</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>501753-G</td><td>Gerade</td></tr><tr><td>osmotische Pumpe</td><td>Alzet</td><td>1003D</td><td>1 &mu; L/h, 3 Tage</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes Maus-Leptin-Protein</td><td>R& D systems</td><td>498-OB-05M</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>RICCA Chemical</td><td>7210-16</td><td>0,9% Natriumchlorid</td></tr><tr><td>Steriles chirurgisches Nahtmaterial</td><td>DemeTech</td><td>DT-639-1</td><td>Seide, Größe 6-0</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Innovative Calibration Solutions (INNOCAL)</td><td>EW 20250-91</td><td></td></tr></tbody></table>

experimenteller ansatz zur untersuchung der leptin-signalisierung in den carotis-körpern und ihrer auswirkungen auf die kontrolle der atmung

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

Ein mit Adipozyten hergestelltes Hormon Leptin ist ein starkes Atemstimulans, das eine wichtige Rolle bei der Verteidigung der Atemfunktion bei Fettleibigkeit spielen kann. Die Karotiskörper (CB), ein Schlüsselorgan der peripheren hypoxischen Empfindlichkeit, drücken die lange funktionelle Isoform des Leptinrezeptors (LepRb) aus, aber die Rolle der Leptin-Signalisierung bei der Kontrolle der Atmung ist noch nicht vollständig geklärt. Wir untersuchten die hypoxische beatmungstische Reaktion (HVR) (1) bei C57BL/6J-Mäusen vor und nach der Leptin-Infusion an der Basislinie und nach der CB-Denervation; (2) bei LepRb-mangelhaften übergewichtigen db/db-Mäusen zu Beginn und nach LepRb Überexpression in CBs. Bei C57BL/6J-Mäusen wurde Leptin-erhöhter HVR und die Wirkung von Leptin auf HVR durch CB-Denervation abgeschafft. Bei db/db-Mäusen erweiterte lepRb-Expression in CB den HVR. Daher kommen wir zu dem Schluss, dass Leptin in CB wirkt, um die Reaktionen auf Hypoxie zu verstärken.

Kontinuierliche Infusion von Leptin erhöhte HVR bei mageren C57BL/6J-Mäusen signifikant von 0,23 auf 0,31 ml/min/g/FiO2 (P &lt; 0,001, Abbildung 2)11. CSND schaffte die Leptin-induzierte Erhöhung des HVR ab (Abbildung 2), während keine mildernden Wirkungen von CSND auf HVR in der Scheinchirurgie-Gruppe nach Leptin-Infusion beobachtet wurden.
LepRb-Expression im CB von LepR<em...

Unsere Studie konzentriert sich auf die Auswirkungen der Leptin-Signalisierung im Karotiskörper (CB) auf die hypoxische Beatmungsreaktion (HVR). Wir führten "Verlust der Funktion" Experimente zur Messung der Wirkung von Leptin auf HVR nach CB-Denervation und "Gain of Function" Experimente zur Messung von HVR nach Überexpression des Leptinrezeptors in CB.

Experimenteller Ansatz zur Untersuchung der Leptin-Signalisierung in den Carotis-Körpern und ihrer Auswirkungen auf die Kontrolle der Atmung

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

Unser Protokoll kann verwendet werden, um die atmungsseren Wirkung von Leptin auf den Karotiskörper in der peripheren chemoreflex Atemkontrolle und physiologische Reaktionen auf Hypoxie zu untersuchen. Wir können auch die Auswirkungen von Verlust und Gewinn der Karotis-Körperfunktion mit chirurgischer und chemischer Denervation und Adenovirus-Transfektion bewerten. Vor Beginn des Verfahrens, messen Sie die Temperatur in einem maßgeschneiderten Ganzen Körper Plasthemagrophy Kammer, und messen Sie die relative Luftfeuchtigkeit des Labors.Als nächstes messen Sie das Körpergewicht und die Rektaltemperatur der experimentellen Maus. Legen Sie die Maus in die Kammer und legen Sie einen Oximeterkragen um den rasierten Hals des Tieres. Und achten Sie darauf, die Kammer vollständig zu versiegeln, um Luftlecks zu vermeiden.Warten Sie ca. 30 Minuten, bis die Maus leise ist und die Kammer ein konstantes Volumen hat. Vor Beginn der Aufzeichnung der Atemsignale und der peripheren Sauerstoffsättigung bei Normoxia. Nach 20 Minuten Normoxia setzen Sie das Tier einem konstanten Mischgasstrom von 10% Sauerstoff und 3% Kohlendioxid aus.Und beginnen Sie die Aufzeichnung des ersten Zyklus der akuten Hypo

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Breathing-gesteuerte elektrische Stimulation (BreEStim) für die Verwaltung von neuropathischen Schmerzen und Spastik

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Experimenteller Ansatz zur Untersuchung der Leptin-Signalisierung in den Carotis-Körpern und ihrer Auswirkungen auf die Kontrolle der Atmung (Video) | JoVE Journal

Experimenteller Ansatz zur Untersuchung der Leptin-Signalisierung in den Carotis-Körpern und ihrer Auswirkungen auf die Kontrolle der Atmung

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