Name: Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Lernen Sie ein verbessertes Protokoll zur Tumordetektion mit GFP-Tagging und Biolumineszenz-Bildgebung im orthotopen Brustkrebsmodell. Diese Methode ermöglicht präzise Quantifizierung von Mikrometastasen und Evaluierung therapeutischer Wirksamkeit.

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Die Autoren möchten die Unterstützung durch das Intramural Research Program der National Institutes of Health, national Cancer Institute, Bethesda MD, Cancer and Inflammation Program und das Frederick National Laboratory - Small Animal Imaging Program, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, USA.

Die Analyse des Tumorwachstums wurde mit Protokollen durchgeführt, die vom Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen des National Cancer Institute genehmigt wurden und sich an die Empfehlungen des "Guide for the Care and Use of Labortiere", der "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" des United States Public Health Service und die "Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals".
1. Vorbereitung von Zellen zur Implantation
HINWEIS: MDA-MB-231 humane Brustadenokarzinomzellen (kommerziell erworben) wurden stabil mit dem Luziferase-Gen III und dem verbesserten grünen Fluoreszenzprotein-Marker (GFP) durch Lentivirus transfiziert und in Gegenwart des Selektionsantibiotikums (Puromycin) angebaut. .
<ol><li>Beginnen Sie die Zellkultur mit 1 x 106 MDA-MB-231-Luc/GFP-Zellen und fügen Sie 15 ml vorgewärmtes (37 °C) RPMI 1640 Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) in einem T75-Kulturkolben hinzu. Halten Sie die Zellen in einem temperaturgesteuerten Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2wachsen. Ersetzen Sie das gesamte Medium mindestens 2x pro Woche. HINWEIS: Stören Sie das Zellwachstum nicht und überprüfen Sie täglich die Zellwachstumsbedingungen. Die Zellen müssen subkultiviert werden, wenn sie 85 % bis 90 % Konfluenz erreichen, um die Proliferationsphase aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Eine Woche vor dem Zellimplantationsschritt das Puromycin aus dem Zellkulturkolben entfernen, indem Sie zuerst das gesamte Medium im Kulturkolben entfernen, dann 2x mit 10 ml 1x 1x Phosphatgepufferter Salin (PBS) ausspülen und schließlich das Medium durch ein komplettes Medium ersetzen. ohne Puromycin. Stören Sie die Zellen während der mittleren Zugabe- und Spülschritte nicht. Denken Sie daran, das komplette Medium mit der Auswahl Antibiotika von nun an für alle mittleren Auffüllungsschritte nicht zu verwenden.</li>
	<li>Am Tag der Vorbereitung der Zellen für die Implantation, entfernen Sie alle vollständigen Medium vor Trypsinisierung, um zu vermeiden, die Deaktivierung des Trypsin. Fügen Sie dem Kolben 5 ml Trypsin hinzu, um die Zellen zu trypsinisieren. Überwachen Sie die Zellen, und überprüfen Sie, ob sie sich vom Kulturkolben lösen.</li>
	<li>Sobald sich die meisten Zellen lösen, fügen Sie 10 ml vollständiges Medium hinzu, um die Trypsin-Aktivität zu neutralisieren. Als nächstes übertragen Sie die Zellsuspension in ein 50 ml Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 150 x g, um die Zellen zu pellet. Entfernen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und fügen Sie dann 10 ml 1x PBS hinzu, um die Zellen wieder aufzuhängen und sich auf die Zellzählung vorzubereiten.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler und passen Sie die Zellkonzentration auf 20 x 106 Zellen/ml in kalten 1x PBS mit 25% Kellermembranmatrix an. Injizieren Sie 2 x 106 Zellen in 0,1 ml 1x PBS mit 25% Kellermembranmatrix in das vierte Brustfettpad jeder Maus. Bringen Sie zusätzliche Nadeln und Spritzen für die Zellimplantation mit und halten Sie den Zell-Keller-Membran-Matrix-Mix vor der Implantation auf Eis. HINWEIS: In der Spritze und Nadel befindet sich Totraum. Je nach Wahl von Nadel und Spritzenlänge, Typ und Größe kann eine Tuberkulinspritze mit einer 0,5 in 26 G Nadel bis zu 70 l Totraum10haben. Bereiten Sie 40 % bis 50 % mehr Zellimplantationsmischung vor, um den Totraum und jeden anderen versehentlichen Verlust zu kompensieren.</li>
</ol>2. Orthotopisches Brustkrebsmodell und Tumorgrößenmessung
<ol><li>Lassen Sie 6 Wochen alte athymische Nacktmäuse mindestens 1 Woche vor der Zellimplantation in die Wohnanlage akklimatisieren. HINWEIS: Die Verwendung gleichaltriger Mäuse reduziert die Datenvariation.</li>
	<li>Anästhesisieren Sie für jede Runde fünf Mäuse mit Isofluran bei 4% mit gefilterter (0,2 m) Luft bei einer Durchflussrate von 1 l/min für 3 x 4 min. Achten Sie auf die Atemfrequenz und Musteränderung der Maus und verwenden Sie eine Zehenprise, um sicherzustellen, dass die Mäuse unter richtiger Anästhesie sind. Sobald sie sich nicht mehr bewegen, entfernen Sie eine Maus und legen Sie einen Nasenkegel über Nase und Mund mit der gleichen Anästhesie.</li>
	<li>Die linke4. Brustdrüse mit Alkohol abwischen. Heben Sie mit feinen Rattenzahnzangen die4. Brustdrüse leicht an, um die 25 G Nadel einzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel abschrägt ist und ziehen Sie dann leicht den Kolben, um sicherzustellen, dass die Nadel keine Blutgefäße trifft. Wenn kein Blut in die Spritze gelangt, spritzen Sie langsam 100 l des Zell-Keller-Membran-Matrix-Mixes in das Brustfettpad. HINWEIS: Unter der Haut erscheint ein runder, erhöhter Bereich.</li>
	<li>Warten Sie 10 bis 15 s, bis die Kellermembranmatrix aushärtet, und entfernen Sie dann die Nadel. Wiederholen Sie den Vorgang mit den verbleibenden Mäusen in der Induktionskammer. Legen Sie alle verwendeten Nadeln und Spritzen in eine scharfe Box.</li>
	<li>Verwenden Sie die gleiche Brustdrüsen-Injektionsstelle für alle Mäuse. Halten Sie ein wachsames Auge auf die Injektionsstelle und beachten Sie, dass jede Zellimplantationsmischung aus der Injektionsstelle austritt. HINWEIS: Innerhalb weniger Minuten wird die Maus beginnen, das Bewusstsein wiederzuerlangen.</li>
	<li>Lassen Sie das Xenograft frei und ohne Unterbrechung für 7 bis 10 Tage vor jeder Tumorgrößenmessung wachsen.</li>
	<li>Untersuchen Sie alle Mäuse auf die Xenograft-Größe. Messen Sie die Tumorgröße mit einem Bremssattel. Bestimmen Sie das Tumorvolumen (mm3) mit der folgenden Gleichung: <img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq1.jpg"> wobei L die längste Dimension und W die kürzeste Dimension senkrecht zu L ist.</li>
	<li>Identifizieren und entfernen Sie Ausreißer, die eine Standardabweichung des Mittelwerts überschreiten. Verwenden Sie nur Mäuse mit vergleichbaren Tumorgrößen für Experimente. Teilen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in verschiedene Behandlungsgruppen auf und beginnen Sie mit der Behandlung.</li>
	<li>Messen Sie die Tumorgröße mit einem Bremssattel 2x pro Woche. Beachten Sie alle körperlichen Veränderungen der Xenografts (d.h. Nekrose, Lazeration).</li>
</ol>3. In vivo Biolumineszenz und Ex-vivo-Fluoreszenz-Bildgebung
HINWEIS: In dieser Studie werden sowohl zweidimensionale Biolumineszenz- als auch Fluoreszenz-Bildgebung am Endpunkt des Experiments durchgeführt. Die Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) wurde mit einem kommerziellen präklinischen optischen Scanner durchgeführt, der mit einer 16-Bit-gekühlten CCD-Kamera und einer beheizten Bildgebungsstufe ausgestattet ist.
<ol><li>Vor der Bildgebung bis zu fünf tumortragende Mäuse in der Induktionskammer ansieben, indem man Isofluran bei 3% mit gefilterter (0,2 m) Luft bei einer Durchflussrate von 1 L/min für 3 x 4 min setzt. Stellen Sie sicher, dass die Induktionskammer in einer entlüfteten Haube aufbewahrt wird, um die Exposition des Personals gegenüber Isofluran zu minimieren.</li>
	<li>Mit einer 27 G-Nadel D-Luciferin (150 mg/kg) an die anästhesierten Mäuse mit einer 27 G-Nadel verabreichen und eine anästhesierte Maus in die Bildkammer übertragen. Halten Sie in der Scanner-Bildgebungskammer das Isofluran bei 2%-2,5% mitO2 als Träger mit einer Durchflussrate von 1 L/min. ANMERKUNG: Halten Sie die Körpertemperatur der Maus während des Verfahrens bei 37 °C, indem Sie ein beheiztes Pad unter der Anästhesie-Induktionskammer, den Bildgebungstisch (wenn das Stadium nicht erhitzt ist) und den Nachverfahrens-Rückgewinnungskäfig aufbewahren.</li>
	<li>Vor der Abbildung der Studienmäuse erhalten Sie Luziferin-Kinetik, indem Sie drei zusätzliche tumortragende Mäuse (Tiere, die keiner Studiengruppe zugeordnet sind) in 2 min Intervallen für insgesamt 40 min unter Verwendung der folgenden Parameter bildgeben: Anregungsfilter blockiert, Emissionsfilter offen, f/stop 1, FOV-D, mittleres Binning (8 x 8) und Auto-Exposition. Verwenden Sie das gemessene Peak-Biolumineszenzsignal, um das optimale Bildaufnahmezeitfenster für alle nachfolgenden Zeitpunkte zu definieren.</li>
	<li>Während der Metastasen-Bildgebung, schützen Sie das hohe BLI-Signal vom primären Tumor, indem Sie es mit einer Hülse aus einem schwarzen Handschuh herausgeschnitten. Erfassen Sie das Bild mit den gleichen Parametern, die in Schritt 3.3 beschrieben sind, wobei die ventrale Seite der Maus zur Darstellung der Lungenmetastasen und die dorsale Seite der Maus zur Darstellung der Hirnmetastasierung zur Kamera zeigt. HINWEIS: Es ist wichtig, ein paar verschiedene Marken von schwarzen Handschuhen zu testen, um die mit minimaler Autolumineszenz zu wählen.</li>
	<li>Zeichnen Sie mit Hilfe eines Scanners und einer Datenanalysesoftware einen Standard-Formbereich von Interesse (ROI) über die Brusthöhle oder das Gehirn, um sicherzustellen, dass das gesamte Interessesorgan abgedeckt wird, um die metastasierende Belastung zu bewerten. Quantifizieren Sie die Biolumineszenz (BL) Leistung als Gesamtfluss (Photonen/Sekunde).</li>
	<li>Unmittelbar nach BLI, euthanisieren2 Sie die Maus über CO 2-Erstickung (gemäß ACUC-Richtlinien und Institution-zugelassene Tierprotokolle) und extrahieren Sie die Lunge und das Gehirn mit sezierender Schere und Zange für ex vivo Bildgebung. HINWEIS: Die für die Ex-vivo-Bildgebung und für die Lungenmetastasierung extrahierte Lunge kann aufgrund inkompatibler Verfahren nicht auf derselben Maus durchgeführt werden.</li>
	<li>Spülen Sie schnell alle Organe mit 1x PBS ab, um oberflächliche Blutflecken zu entfernen und Organe auf eine schwarze Plastikplatte mit geringer Autofluoreszenz zu legen. Transportieren Sie Organe zu einem multispektralen Fluoreszenzscanner, der mit spektraler Unmischung (Festkörper-Flüssigkristallwellenlängenabstimmung) mit einer 12-Bit-CCD-Kamera zur GFP-Erkennung ausgestattet ist.</li>
	<li>Erfassen Sie multispektrale GFP-Bilder (Erregungsfilter = 457 x 23 nm; Emissionsfilter = 490 nm langer Pass) der extrahierten Organe und nicht-tumorhaltigen Lagerkontrollmäuse, indem Sie bei einer Schrittgröße von 10 nm durch 500 x 720 nm scannen. Verwenden Sie ausgeschnittene Organe von nicht-tumorhaltigen Kontrollmäusen, um die Autofluoreszenz zu korrigieren.</li>
	<li>Bestimmen Sie nach der multispektralen GFP-Bildgebung die optimalen Bildgebungseinstellungen. Bildaufnahme aller Zielorgane durchführen und Bildanalyse durchführen (d.h. eine Spektralbibliothek für Autofluoreszenz und GFP für spektrale Unmixing-Verfahren generieren) nach dem Herstellerprotokoll.</li>
</ol>4. Molekularer Nachweis von metastasierenden Brustkrebszellen
<ol><li>Nach der Ex-vivo-Bildgebung das gesamte Gehirn in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C in einem Gefrierschrank aufbewahren, bis es für die DNA-Extraktion bereit ist.</li>
	<li>Für die DNA-Extraktion, setzen Sie das gesamte Gehirn in einem 5 ml Homogenisierungsröhrchen mit 2 ml DNA-Lysepuffer. Verwenden Sie einen Homogenisator mit der Leistungseinstellung 50, um das snap-gefrorene gesamte Hirngewebe zu homogenisieren. Sobald das Hirngewebe vollständig homogenisiert ist, übertragen Sie die 1 ml Suspension (Lysat) in ein DNase-freies und RNase-freies 2 ml Mikrozentrifugenrohr und isolieren die DNA weiterhin gemäß dem Herstellerprotokoll. ANMERKUNG: Um die Übertragung von DNA-Kontaminationen zu minimieren, reinigen Sie den Homogenisator nach jeder Probe gründlich, indem Sie ihn zunächst mit 75 % Ethanol in DNase-freies und RNase-freies Wasser abspülen und anschließend mit 1 M NaOH-Lösung ausspülen, gefolgt von einer Spülung mit 75 % Ethanol in DNase-freier und RNasefreies Wasser zur effektiven Reduzierung und Zerstörung von DNA-Rückständen.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml 100% Ethanol des DNA-Lysepuffers in das Lysat ein. Probe durch Inversion mischen und bei Raumtemperatur 3 min lagern. HINWEIS: Nicht zu oft oder zu kräftig umkehren. Die DNA wird als wollartiges Ausfällen sichtbar sein.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die DNA in ein frisches DNase-freies und RNase-freies 2 ml Mikrozentrifugenrohr zu übertragen. Lassen Sie die Probe Luft für 1 min trocknen. Fügen Sie 1 ml 75% Ethanol hinzu und invertieren Sie das Mikrozentrifugenrohr 3x, um die DNA-Probe zu waschen. Entsorgen Sie das Ethanol nach jeder Wäsche durch Pipettieren. Wiederholen Sie den Waschschritt 2x.</li>
	<li>Die DNA-Probe wird 10 s an der Luft getrocknet. Fügen Sie dann 52 l von 8 mM NaOH hinzu, um die DNA-Probe aufzulösen. Pipetten Sie 2 L der DNA-Probe für die DNA-Quantifizierung, und verwenden Sie die restlichen 50 l für einen Echtzeit-PCR-Assay nach Konzentrationsanpassung. HINWEIS: NaOH hilft, die DNA-Probe vollständig zu slubilisieren.</li>
	<li>Quantitieren Sie 2 l jeder DNA-Probe mit einem Spektralphotometer und verwenden Sie ein Absorptionsverhältnis zwischen A260/280 als Qualitätsprüfungsreferenz. Berechnen Sie die DNA-Konzentration mit dieser Formel: <img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq2.jpg">
</li>
	<li>Stellen Sie die DNA-Konzentration auf 50 ng/L ein. Verwenden Sie für jede DNA-Probe 50 ng DNA als Ausgangsvorlage für einen Echtzeit-PCR-Test. Verwenden Sie 8 mM NaOH-Lösung oder DNase-freies und RNase-freies Wasser, um die DNA-Probe zu verdünnen.</li>
	<li>Entwerfen Sie das Primer-Paar spezifisch für die exogene grüne Fluoreszenzprotein-Sequenz (GFP) intern mit einem Open-Source-Primer-Design-Webportal zur Echtzeit-PCR-Erkennung des GFP-Tags in den metastasierenden Zellen, die in distale Standorte eingedrungen sind und besiedelt sind. HINWEIS: Diese Studie verwendet F: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTGTGTCG-3'.</li>
	<li>Verwenden Sie ein schnelles Echtzeit-PCR-Reagenz und eine Echtzeit-PCR-Maschine, die ein schnelles Echtzeit-PCR-Protokoll unterstützt. Fügen Sie zusätzlich zu den regulären 30-Zyklus-Verstärkungsschritten einen Dissoziationskurvenschritt zum Ende des Laufs hinzu, um eine unspezifische Verstärkung zu erkennen. HINWEIS: Für die molekulare Detektion wurden folgende Bedingungen verwendet: 95 °C 2 min Heißstart, 40 Zyklen mit 95 °C 5 s, 60 °C 15 s und schließlich eine Schmelzkurvenanalyse. Das GFP-Amplikon ist 135 bp groß.</li>
	<li>Verwenden Sie eine naive Maus-Gehirn-DNA (kein MDA-MB-231-Zellimplantat) als Negativkontrolle. Verwenden Sie DNA, die aus den MDA-MB-231-GFP/Luc-Zellen extrahiert wurde, als positiv. Fügen Sie alle PCR-Reagenzien ohne DNA-Vorlage als No Template Control (NTC) hinzu. HINWEIS: Für jeden PCR-Assay wird eine PCR-Steuerung benötigt.</li>
</ol>5. Metastasierender Brustkrebszellnachweis in der Lunge
<ol><li>Für die Für die metastasierende Lungenknötung gewählte Untergruppe der Mäuse anästhesieren Mäuse mit Isofluran (wie in Schritt 2.2) unmittelbar nach der Ex-vivo-Bildgebung, führen Sie eine Herzpunktion für die Blutentnahme durch und einschläfern sie dann durch Zervixdislokation ein.</li>
	<li>Öffnen Sie die Brusthöhle mit einer Sezierenderschere und schneiden Sie an Herz und Thymus vorbei, um die Luftröhre freizulegen.</li>
	<li>Legen Sie eine 10 ml Spritze mit einer 22 G Nadel mit Bouin-Lösung in die Luftröhre ein. Drücken Sie den Spritzenkolben, bis die zusammengebrochene Lunge mit 2 ml der Bouin-Lösung geschwollen ist. Entfernen Sie die Spritze und die Nadel, sobald die Lunge aufgeblasen wurde.</li>
	<li>Legen Sie die gesamte Lunge in ein 15 ml-Rohr mit Bouin-Lösung, umkehren Sie das Rohr ein paar Mal sanft und lassen Sie es 24 stunden bei Raumtemperatur einweichen.</li>
	<li>Nach 24 h die Bouin-Lösung aus dem Rohr entfernen, die Lunge mit Wasser abspülen und dann mit 70% Ethanol wieder in die Röhre geben. Zählen Sie Metastasen (weiße Flecken oder Knötchen) auf den Oberflächen der Lunge mit einem Sezierendes Mikroskop.</li>
</ol>6. Datenerhebung und -analyse
<ol><li>Zeichnen Sie Tumorvolumendaten sowie in vivo- und ex vivo-Bilddaten auf einer elektronischen Kalkulationstabelle auf, um die Dateneingabe, -erfassung und -verwaltung zu vereinfachen.</li>
	<li>Übertragen Sie am Ende des Experiments alle Daten an die elektronische Kalkulationstabelle und die statistische Software für die Datendarstellung und statistische Analysen.</li>
</ol>

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<li>Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+augments+xenograft+transplantation+of+meningioma+cells+into+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice.</a> Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).</li>
<li>Mullen, P., Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+matrigel+in+the+establishment+of+ovarian+carcinoma+cell+lines+as+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts.</a> Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).</li>
<li>Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+matrigel+has+no+influence+on+tumor+development+or+PET+imaging+in+FaDu+human+head+and+neck+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts.</a> BMC Medical Imaging. 16, 5(2016).</li>
<li>Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Matrigel+on+the+tumorigenicity+of+human+breast+and+ovarian+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines.</a> International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Institute+for+Laboratory+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).</li>
<li>Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Comparison+of+the+Sensitivity+of+Detection+of+Fluorescent+and+Bioluminescent+Reproters+in+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models.</a> Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Für die Untersuchung von TNBC an Tieren wurden zwei murine Modelle entwickelt: die MDA-MB-231 humanen Brustadenokarzinomzellen bei immungeschwächten Mäusen (d. h. athymische Nacktmäuse, NSG-Mäuse) und die 4T1 bei immunkompetenten BALB/c-Mäusen. Beide Modelle haben ihre Vorteile. Die Wahl des Tiermodells für eine Studie hängt von den Forschungszielen ab. Beispielsweise ist das MDA-MB-231-Modell eine menschliche TNBC-Zelllinie, die in immungeschwächten Mäusen angebaut wird und immunsuppressive menschliche Brustkrebspatientinnen imitiert. Andererseits imitiert der invasive Phänotyp orthotopischer 4T1-Triple-negativer muriner Brustkrebszellen bei BALB/c-Mäusen den metastasierenden Prozess genau, wie er bei menschlichen Brustkrebspatientinnen im Stadium IV auftritt. Im Gegensatz zum intravenösen Zellinjektionsansatz wurden menschliche MDA-MB-231 Brustkrebszellen in ähnlicher Weise in das Brustfettpad11,12 im orthotopischen Brustkrebsmodell11,13injiziert. Das längere Tumorwachstum und die erworbene metastasierende Fähigkeit ist physiologisch relevanter, daher ist es kein künstliches metastasierendes Krebsmodell4,14. Ein solches spontanes Metastasierungsmodell imitiert die Entwicklung von menschlichem Brustkrebs mit Ausnahme des Initiationsstadiums. Dies ist ein entscheidendes Modell für das In-vivo-Arzneimittelscreening und die therapeutische Wirksamkeitsbewertung bei metastasierendem Brustkrebs.
Die Tumorimplantationsstelle in der Maus spielt eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung einer Mikroumgebung, die das Tumorwachstum und die Auswahl des metastasierenden Phänotyps unterstützt, ähnlich dem, der beim Menschen vorkommt. Der proximale Lymphknoten und das Vorhandensein von Fettgewebe sind die Schlüsselfaktoren, die das Fortschreiten der Erkrankung von Brustkrebs15,16beeinflussen. Bei einem menschlichen Patienten sind Lymphknoten und Fettgewebe beide schlüsselweise faktoren, die die Malignität und Inzidenz von Brustkrebs beeinflussen17,18,19. So kann die Auswahl der richtigen anatomischen Position für die Injektionsstelle die Relevanz des Tumormodells im Vergleich zur menschlichen Krankheit stark beeinflussen. Diese Studie verwendete die vierte Brustdrüse als Implantationsstelle hauptsächlich aufgrund der oben genannten Anforderungen und dass sie anatomisch zugänglicher und leichter zu manipulieren ist.
Es stehen verschiedene Methoden zur Berechnung des Tumorvolumens zur Verfügung, und ein Forscher kann wählen, wo er es für richtig hält. Der für diese Studie gewählte Algorithmus basiert auf den Ergebnissen von Faustino-Rocha et al., der verschiedene Berechnungsformeln für das Tumorvolumen verglichen und zu dem Schluss gekommen ist, dass die folgende Formel die genauesteist 20.
<img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq3.jpg">
Basement Membranmatrix ist eine wichtige extrazelluläre Matrix, die in verschiedenen in vitro21 und in vivo22,23 Assays verwendet wird. Es gibt widersprüchliche Berichte22,24,25 über den Einfluss der Kellermembranmatrix auf Xenograft-Malignität. Es scheint nur die anfängliche Etablierung des Xenograft zu beeinflussen und hat keine weiteren Auswirkungen auf das Xenograft-Wachstum25. Für die beschriebene Xenograft-Implantation wurde die Kellermembranmatrix mit den Krebszellen gemischt, um die Viskosität der Zell-Gel-Mischlösung vor der Implantation zu erhöhen. Das Vorhandensein der Kellermembranmatrix reduziert den Verlust der Mischlösung von der Injektionsstelle und hält die Mischlösung an der Implantationsstelle, wodurch die Gleichmäßigkeit des implantierten Xenograftvolumens erhöht wird.
Die MDA-MB-231-Zelllinie ist eine bösartige verewigte menschliche Brustadenokarzinom-Zelllinie und ist aufgrund ihres dreifach negativen Status ein beliebtes Werkzeug in der Brustkrebsforschung. Der Einsatz von Dual-Reportern (Luciferase und GFP) zelliumieren, ermöglicht mehr Flexibilität bei der Handhabung der In-vivo- und Ex-vivo-Bildgebung. Es ist allgemein bekannt, dass das Biolumineszenzsignal eine höhere Empfindlichkeit, Tiefendetektion und einen überlegenen Kontrast (Signal-Rausch-Verhältnis) aufweist als GFP-Signale. Aus diesem Grund ist es eine weit verbreitete bildgebende Modalität für ganzkörperbildende Bildgebung. Leider ist die Biolumineszenzerkennung durch ein schmales Zeitfenster (15 bis 20 Min. nach der Luziferin-Injektion) begrenzt, in dem die Signalerkennung linear ist. DAS BLI-Signal nimmt schnell ab, wenn die Tiere eingeschläfert werden. Dies wird zu einem experimentellen Designproblem, wenn viele Mäuse eingeschläfert werden müssen und die Ernte mehrerer Gewebe oder Organe erforderlich ist. In diesen Studien wurde Blut durch direkte Herzpunktion geerntet, das Gehirn, primärer Tumor, Lunge und betroffener Lymphknoten wurden an 40 Mäusen untersucht. Als die Organe geerntet wurden und für die Ex-vivo-Bildgebung bereit waren, war das Biolumineszenzsignal nicht nachweisbar. Daher ist die GFP-Erkennung in diesen Situationen besser geeignet. Die Emission des GFP-Signals liegt im sichtbaren Bereich, und bei diesen Wellenlängen ist die Signalabsorption durch Blut (d.h. Hämoglobin) deutlich höher. Auch die Autofluoreszenz im sichtbaren Bereich durch NADH, Lipopigmente und Flavins führt zu einem signifikanten Hintergrund, der es schwierig macht, zwischen einem Low-Level-GFP-Signal und Autofluoreszenzhintergrund zu unterscheiden. Die Verwendung eines multispektralen Fluoreszenz-Bildgebungsansatzes anstelle der herkömmlichen Filterpaar-Bildgebung und der Verwendung von spektralen Unmixing-Algorithmen hilft dabei, echtes GFP-Signal im Interessensorgan zu identifizieren. Durch die Kombination der Stärken der Biolumineszenz-Bildgebung im Ganzkörper-In-vivo-Nachweis und der multispektralen GFP-Bildgebung in den Ex-vivo-Organ-/Gewebebewertungen können daher quantifizierbare Daten in einer großen Mäusekohorte maximiert werden.
Unabhängig davon, welcher Ansatz für eine Tierstudie gewählt wird, wird die Extraktion des gesamten Blutes vor der Organ-/Gewebeentnahme dringend empfohlen, insbesondere für Studien, die auf die metastasierende Belastung abzielen. Dieses Protokoll erkennt GFP-Signale aus den Blutproben, die von den Mäusen (Daten nicht gezeigt) im orthotopischen Brustkrebsmodell durch Echtzeit-PCR-Assays erhalten wurden. Die Minimierung des Blutvolumens in Organen/Geweben reduziert das falsch positive Signal in den Zielorganen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das orthotopische Brustkrebsmodell mit den MDA-MB-231-Luc/GFP-Zellen ein hochrelevantes Tiermodell ist, das den Zustand des menschlichen TNBC-Patienten genau nachahmt. Dieses Modell ist für die Untersuchung, Überwachung und Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit in einer Tumormikroumgebung ähnlich wie beim Menschen unerlässlich. Die Verwendung von dualen Reporterzelllinien verbessert die Praktikabilität dieses orthotopischen Brustkrebsmodells weiter.

Etwa eine von acht Frauen in den Vereinigten Staaten wird im Laufe ihres Lebens an invasivem Brustkrebs erkranken, und 10 % dieser Frauen werden mit dem aggressiven subtyp dreifach negativen Brustkrebs (TNBC) diagnostiziert. Während primäre Läsionen in den meisten Fällen operativ entfernt werden können, machen die subklinische Mikrometastasen und Die Chemoresistenz sie zu einer unlösbaren Krankheit. Wichtig ist, dass die meisten Patienten mit metastasierendem TNBC schließlich einen Rückfall erleiden, auch wenn sie sich im frühen Stadium1einer Behandlung unterzogen haben. Daher sind Krebsheterogenität, Mikrometastasierung und therapeutische Resistenz drei große Herausforderungen, die das erfolgreiche klinische Ergebnis von TNBC-Patienten begrenzen. Daher ist es dringend notwendig, den polymorphen molekularen Hintergrund von TNBC besser zu verstehen und wirksame therapeutische Wirkstoffe zu entwickeln, die metastasierende Erkrankungen begrenzen.
Tumormetastasierung ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem die Tumorzelle ihre Mikroumgebung steuert und an sich zieht, um ihre eigene Verbreitung durch Membranabbau und Tumorzellflucht aus der primären Läsion zu fördern, durch Eintritt in (d. h. Intravasation) und Ausstieg aus (d.h. Extravasation) der Vaskulatur und letztlich Anpassung und Besiedlung in distalen Gewebebetten2. Tiermodelle wurden entwickelt, um Brustkrebsmetastasen zu untersuchen, bei denen zwei Methoden häufig umgesetzt werden: direkte Blutzirkulationsinjektion und orthotopische Implantation. Häufig eingesetzte Methoden für die direkte Blutzirkulation Injektion gehören Schwanz Vene Injektion, während andere Ansätze einschließlich direkte Herz-Injektion3, direkte Gehirninjektion4, und direkte Leberinjektion5 wurden auch verwendet. Die direkte Blutzirkulationsinjektion wird oft als künstliches Metastasenmodell bezeichnet, das schnell und einfach, aber weniger physiologisch genau ist, weil es die Tumorflucht aus der primären Läsion und Intravasation6,7,8umgeht. Im Vergleich zu Direktinjektionsmodellen dauert das orthotopische Brustkrebsmodell länger für das Auftreten nachweisbarer metastasierender Läsionen in entfernten Organen wie der Lunge, ist aber physiologisch relevanter, da es den mehrstufigen metastasierenden Prozess, wie er beim Menschen auftritt, eng imitiert. Wichtig ist, dass eine Studie9 aus dem Jahr 2013 die Injektion der Schwanzvene und orthotopische Modelle verglich und herausfand, dass die Brustkrebszellen, die in die Schwanzvene injiziert wurden, und diejenigen, die nach der Injektion der Schwanzvene von der Lunge isoliert wurden, ähnliche globale Genexpressionsprofile aufwiesen. Im Gegensatz dazu war das globale Genexpressionsprofil orthotopisch injizierter Brustkrebszellen dramatisch anders als das von metastasierenden Lungenläsionen, die aus orthototisch injizierten Zellen9resultierten. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das orthotopische Modell physiologisch relevanter ist, da die metastasierenden Läsionen einem Selektionsprozess unterzogen werden, der dem mehrstufigen Prozess der Metastasierung ähnelt, wie er beim Menschen auftritt.
Diese Arbeit beschreibt ein orthotopisches Brustkrebsmodell (MDA-MB-231-Luc/GFP) bei Nacktmäusen, das in unserem Labor für bildgebende Detektionstechniken sowie die Identifizierung neuartiger Biomarker und die Entwicklung gezielter Chemotherapeutika optimiert wurde.

<table><tbody><tr><td>Bouins Solution</td><td>Sigma</td><td>HT10132-1L</td><td>Färbung von metastasierten Lungenknötchen</td></tr><tr><td>D-Luciferin, Kaliumsalz</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-1G</td><td>Luciferase Substrat</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>ThermoFisher</td> 10503027 <td>DNA-Extraktionskit</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Tabellenkalkulation Software</td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>Virtis</td><td>Zyklon Virtishear</td><td>Für die Gewebehomogenisierung</td></tr><tr><td>IVIS SPECTRUM Scanner</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Fluoreszenz- und BLI-Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>Maestro GNIR-FLEX Fluoreszenzscanner</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Fluoreszenz-Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>MatriGel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Bei -20 °C lagern und bei Gebrauch alt (4 °C) aufbewahren.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stabile Zelllinie</td><td>GenTarget</td><td>SC044</td><td>Dual Reporter Mikroskop für menschliche Brustkrebs-Zelllinien</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS</td><td>Histologie-Bilderfassung</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>Spülpuffer</td></tr><tr><td>Primer3</td><td>MIT</td><td></td><td>Primer Design</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Statistische Analysesoftware</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113803</td><td>Antibiotika</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medien</td><td>ThermoFisher</td><td>61870127</td><td>Nährmedien</td></tr><tr><td>SeniFAST SYBR Lo-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-94020</td><td>Fast Real-Time PCR Reagenz</td></tr><tr><td>StepOne Plus Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Real-Time PCR Gerät</td></tr></tbody></table>

studieren von dreifach negativem brustkrebs mit orthotopischem brustkrebsmodell

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Dreifach-negativer Brustkrebs (TNBC) ist ein aggressiver Brustkrebs-Subtyp mit begrenzten therapeutischen Möglichkeiten. Im Vergleich zu Patienten mit weniger aggressiven Brusttumoren liegt die 5-Jahres-Überlebensrate von TNBC-Patienten aufgrund ihres charakteristischen medikamentenresistenten Phänotyps und ihrer metastasierenden Belastung bei 77 %. Zu diesem Zweck wurden murine Modelle etabliert, die darauf abzielen, neue therapeutische Strategien zu identifizieren, die das TNBC-Tumorwachstum und die metastasierende Ausbreitung begrenzen. Diese Arbeit beschreibt einen praktischen Leitfaden für das Orthotop-Modell TNBC, bei dem MDA-MB-231-Brustkrebszellen, die in einer Kellermembranmatrix ausgesetzt sind, in das vierte Brustfettpad implantiert werden, das das Verhalten von Krebszellen beim Menschen genau nachahmt. Die Messung von Tumoren mittels Sättel, die Beurteilung der Lungenmetastasen mittels In-vivo- und Ex-vivo-Bildgebung sowie die molekulare Detektion werden diskutiert. Dieses Modell bietet eine hervorragende Plattform, um die therapeutische Wirksamkeit zu untersuchen und eignet sich besonders für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen dem primären Tumor und distalen metastasierenden Stellen.

Die Tumorvolumenmessung per Bremssattel ist eine etablierte Methode zur Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung (Abbildung 1). Die Anzahl der implantierten Zellen, die Verwendung von Kellermembranmatrix, Mikrobiom, Sauberkeit der Anlage und Injektionsstelle sind die Schlüsselfaktoren, die die Tumorwachstumsrate beeinflussen.
Im Gegensatz zur GFP-Bildgebung benötigte BLI die Verabreichung von Luziferasesubstrat mindestens 15 bis 20 min vor der BLI-Bildgebung. Darüber hinaus beeinflussen die Maus-Stamm, Zelllinie, Behandlungen, und Luziferase-Reporter alle die Biolumineszenz-Signalspiegel. Um vergleichbare Signale zwischen den Studiengruppen zu erhalten, muss daher eine vor-imaging BLI-kinetische Studie durchgeführt werden, um den besten Bildgebungszeitrahmen zu bestimmen (Abbildung 2).
Aufgrund des überlegenen Signal-Hintergrund-Verhältnisses26,27war die Ganzkörper-In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung im Vergleich zum GFP-Ansatz sehr empfindlich beim Nachweis eines Low-Level-Metastasensignals (Abbildung 3). Darüber hinaus sorgte das Biolumineszenzsignal für eine tiefere Durchdringung um wenige Millimeter als GFP. Die Produktion von Biolumineszenzsignalen erfordert jedoch ATP, was ein begrenzender Faktor bei der Bewertung von Ex-vivo-Gewebeproben ist. Wenn die Tiere schnell verarbeitet werden, dann könnte BLI ein praktikabler Ansatz sein, um quantitative Ergebnisse bei der Metastasierung zu erzielen. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen, ist die Verarbeitung eines Tieres nach dem anderen. Dieser Ansatz war für diese Studie jedoch nicht durchführbar, da eine große Mäusekohorte verwendet wurde. BLI-Signal wurde nicht erkannt, wenn die Organe wurden etwa 45 min nach Luziferin Injektion abgebildet. Die Verwendung einer dualen Reporter-Zelllinie ist in dieser Situation nützlich. Aufgrund der stabilen Natur des GFP-Moleküls hätten die Forscher genügend Zeit, um den Kadaver zu verarbeiten, bevor die GFP-Signale von Denseorganen erfasst werden (Abbildung 4).
Abbildung 5 zeigt ein beispielhaftes Beispiel dafür, wie Messung der Größe von Bremskörpertumoren die Dateninterpretation verzerren könnte, da das Xenograft den größten Teil des lebensfähigen Tumorzellgehalts verlor, aber dennoch seine große Masse und Form beibehielt. Die histopathologische Untersuchung dieser Xenografts deutete auf Nekrose innerhalb der Masse hin (Abbildung 5B).
Für Forscher, die die bildgebenden Ergebnisse in Bezug auf die Hirnmetastasierung im orthotopischen Brustkrebsmodell in Frage stellen, kann die molekulare Detektion durch Echtzeit-PCR überzeugende Beweise liefern (Abbildung 6). In diesem Fall war die exogene GFP-DNA-Sequenz der beste Weg, um dieses Problem anzugehen, da die transfizierte GFP-DNA-Sequenz natürlicherweise nicht bei Menschen oder Nagetieren existiert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig1.jpg"> Abbildung 1: Tumorvolumenmessung. Die Tumorvolumen-/Belastungsmessung mit einem Sättel begann am 10. Tag nach der Xenograft-Implantation und wurde dann bis zum Ende des Experiments 2x pro Woche gemessen. Fehlerbalken werden durch den SEM-Wert berechnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig2.jpg"> Abbildung 2: Bestimmung des optimalen Bildaufnahmefensters. Links: Für die optimale luziferin-Kinetik-Bereichsbestimmung wurden eine Maus mit einem großen Xenograft und eine Maus mit einem kleinen Xenograft ausgewählt. Rechts: Luziferin kinetische Kurve erhalten durch Erfassung der Bilder alle 2 min für 40 min. Zwischen 15 und 22 min wurde ein Plateau beobachtet, das als optimale Bildaufnahmezeit für alle nachfolgenden Bildgebungen genutzt wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig3.jpg"> Abbildung 3: Ganzkörper-BLI-Bildgebung. L: Ganzkörper BLI Bildgebung. M: Ventralansicht mit einem Schwarzen Handschuh ärmelt. R: Dorsalansicht mit dem unteren Körper mit einem Ärmel eines schwarzen Handschuhs bedeckt. Eine axilläre Lymphknotenmetastasierung wird in der ventralen Ansicht durch BLI-Bildgebung nachgewiesen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig4.jpg"> Abbildung 4: Ex-vivo-BLI/GFP-Signalerkennung. GFP-Signale wurden im Gehirn und in der Lunge von der gleichen Maus 20 min nach dem Opfern der Maus erkannt. BLI-Signal wurde nicht erkannt 45 min nach Luziferin Injektion. Im naiven Maushirn und in der Lunge wurde kein GFP-Signal nachgewiesen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig5.jpg"> Abbildung 5: Vorteile optischer Bildgebungstechniken gegenüber Sättelmessungen. (A) Repräsentatives Bild, das die in vivo GFP-Signalerkennung bei einem Primärtumor zeigt. Nur ein kleiner Teil des Xenograft zeigte GFP-Signal, was darauf hindeutet, dass ein signifikanter Teil der Masse Stroma war. Dies kann nicht durch herkömmliche Sattelmaße bestimmt werden und kann zu einer ungenauen Schlussfolgerung führen. In diesem Beispiel wird die Bedeutung der optischen Bildgebung für die Tiermodellstudie hervorgehoben. (B) Histopathologieabschnitt derselben Maus, der zeigt, dass auch die nekrotische Region (d. h. der innere Bereich) zur Tumorgrößenberechnung beigetragen hat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig6.jpg"> Abbildung 6: Analyse der Schmelzkurve. Das Schmelzkurvendiagramm, das die Spezifität von GFP-Amplicons anzeigt. DNA aus dem Gehirn, die von den MDA-MB-231-Luc/GFP-implantierten Mäusen gewonnen wurden, und die DNA, die aus den mDA-MB-231-Luc/GFP-Zellen isoliert wurde, die in Kultur (positive Kontrolle) angebaut wurden, wurden als Test. Der Echtzeit-PCR-Assay wurde durchgeführt, um den GFP-Gehalt im Gehirngewebe zu bewerten. (A,B) Die Schmelzkurven der Positivkontrolle und der AUS dem Maushirn extrahierten DNA. (C) Die überlappenden Kurven der Panels A und B, die die Spitzensignale der Maushirn-DNAs anzeigen, sind spezifisch für die exogene GFP-Sequenz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Diese Arbeit setzt ein fortschrittliches Protokoll vor, um die Tumorbelastung durch den Nachweis von grünen Fluoreszenzprotein- und Biolumineszenzsignalen sowie die Integration quantitativer molekularer Detektionstechniken genau zu bewerten.

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Unser Protokoll überwindet das begrenzte Biolumineszenz-Bildgebungsfenster durch die Aufnahme eines GFP-Tags, das auch die Detektion und Quantifizierung von Mikrometastasen durch PCR-Analyse erleichtert. Da das GFP-Tag das begrenzte Biolumineszenzerfassungsfenster umgeht, können mehr Motive ohne Signalverlust abgebildet werden und das Potenzial für falsche negative Ergebnisse ist begrenzt. Diese Studie wird für Forscher für die Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit von Krebsmedikamenten nützlich sein.Diese Methode bietet ein nützliches Modell für Forscher, die an EMT, Medikamentenresistenz und Krebsstammzellmechanismen im Zusammenhang mit dem metastasierenden Prozess sowie für die Entwicklung von Krebsmedikamenten interessiert sind. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf Pedalreflex bestätigt haben, wischen Sie die linke vierte Brustdrüse mit Alkohol ab und verwenden Sie feine Rattenzahnzange, um die vierte Brustdrüse leicht zu heben. Stellen Sie sicher, dass die Spitze abschrägt ist, legen Sie eine 25-Spur-Nadel an einer Ein-Milliliter-Spritze mit 100 Mikroliter Zellkeller-Membran-Matrix-Mix befestigt und leicht zurückziehen den Kolben, um sicherzustellen, dass die Nadel keine Blutgefäße kontaktiert.Für Vergleichsergebnisse muss die Tumorzellinjektionsstelle zwischen allen Empfängertieren konsistent sein. Wenn kein Blut in die Spritze gelangt, injizieren Sie langsam das gesamte Volumen der Lösung in das Brustfettpad. Unter der Haut erscheint eine runde erhöhte Masse.Warten Sie 10 bis 15 Sekunden, bis die Kellermembranmatrix aushärtet, bevor sie die Nadel entfernt, und lassen Sie das Xenograft sieben bis zehn Tage lang ununterbrochen frei wachsen, bevor eine Tumorgrößenmessung durchgeführt wird. Verwenden Sie dann Sättel, um die Größe des Xenografts in allen Mäusen zu messen und das Tumorvolumen mit der angegebenen Gleichung zu bestimmen. Vor der Abbildung der Studientiere, Bild drei zusätzliche Tumor tragende Mäuse für 40 Minuten in Zwei-Minuten-Intervallen mit den Parametern, wie angegeben, um die Luziferin-Kinetik für die Studie zu erhalten.Verwenden Sie das spitzengemessene Biolumineszenzsignal, um das optimale Bildaufnahmezeitfenster für alle nachfolgenden Zeitpunkte zu definieren. Um metastasierende Bildgebung durchzuführen, decken Sie den primären Tumor mit einer Hülse, die aus einem schwarzen Handschuh geschnitten wird, und legen Sie eine anästhesierte Maus in den Scanner, und stellen Sie dann das Luziferinsignal mit den gleichen Parametern ab, wie sie gerade mit der ventralen Seite der Maus zur Darstellung der Lungenmetastasierung und der dorsalen Seite der Maus zur Bildgebung der Gehirnmetastasen gezeigt wurden. Zeichnen Sie mit Hilfe eines Scanners und einer Datenanalysesoftware einen Bereich von Interesse über den abgebildeten Bereich, um sicherzustellen, dass das gesamte Interessenskörper abgedeckt wird, um die Bewertung der metastasierenden Belastung zu ermöglichen und die Biolumineszenzleistung als Gesamtfluss und Photonen pro Sekunde zu quantifizieren.Unmittelbar nach der Biolumineszenz Signal Quantifizierung, ernten Sie das Gehirn und Lungengewebe und schnell spülen die Organe in PBS, um alle oberflächlichen Blutflecken zu entfernen. Legen Sie die Organe auf eine schwarze Kunststoffplatte mit niedriger Autofluoreszenz und transportieren Sie die Proben zu einem multispektralen Fluoreszenzscanner, der mit spektraler Unmischungsfunktion zur GFP-Erkennung ausgestattet ist. Um multispektrale GFP-Bilder der extrahierten Organe zu erfassen, scannen Sie die Organe von 500 bis 720 Nanometern mit einer Schrittgröße von 10 Nanometern.Um ein Autofluoreszenzprofil zu erhalten, scannen Sie ausgeschnittene Organe von nicht injizierten Kontrollmäusen. Zusätzlich, Bild GFP-positive Gewebe wie Primärtumor, um Autofluoreszenz gemischte GFP-Profil zu erwerben. Verarbeiten Sie diese Spektren gemäß dem Herstellerprotokoll, um eine Spektralbibliothek mit reinen GFP- und Autofluoreszenzprofilen einzurichten.Nach der Bestätigung der Genauigkeit der Spektralbibliothek und der Trennung von GFP-Signal von Gewebe auto Fluoreszenz Hintergrund, verwenden Sie die gleiche Bibliothek, um alle Bilder auf Studie zu entmischen. Für die DNA-Extraktion nach dem Einfrieren des Drucks legen Sie das gesamte Gehirn in eine fünf Milliliter homogenisierende Röhre mit zwei MilliliterN DNA-Lysepuffer und verwenden Sie einen Homogenisator auf 50, um das Gewebe zu homogenisieren. Wenn das Gewebe vollständig homogenisiert ist, übertragen Sie einen Milliliter des Lysats in ein DNAse- und RNAse-freies Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und isolieren Sie die DNA gemäß dem Herstellerprotokoll.500 Mikroliter 100% Ethanol in das Isolat geben und die Probe durch Inversion mischen. Nach drei Minuten bei Raumtemperatur verwenden Sie eine Pipette, um den wollartigen DNA-Ausfall auf ein neues Zwei-Milliliter-DNAse- und RNAse-freies Rohr zu übertragen. Lassen Sie die Probe luft für eine Minute trocknen, bevor Sie einen Milliliter 75% Ethanol in das Rohr geben und das Rohr drei- bis sechsmal invertieren, um die Probe zu waschen.Entsorgen Sie das Ethanol nach der letzten Inversion, bevor Sie die DNA noch zwei Mal mit frischem Ethanol pro Waschgang waschen, wie gerade gezeigt. Nach der letzten Wäsche trocknen Sie die Probe 10 Sekunden lang an der Luft, bevor sie die DNA in 52 Mikroliter mit acht Millimolar-Natriumhydroxid auflöst. Übertragen Sie ein zwei Mikroliter-Aliquot von DNA auf eine Spektralphotometer-Durchstechflasche und quantifizieren Sie die Konzentration der DNA in der Probe unter Verwendung eines Absorptionsverhältnisses zwischen A260 und 280 nach der Formel.Stellen Sie die DNA-Konzentration der Probe auf 50 Nanogramm pro Mikroliter mit zusätzlichem acht Millimolaren Natriumhydroxid ein und entwerfen Sie das grundierte Paar spezifisch für die exogene grüne GFP-Sequenz im eigenen Haus mit einem Open-Source-Primer-Design-Webportal für die Echtzeit-PCR-Erkennung des GFP-Tags und der metastasierenden Zellen, die in die distalen Stellen des Tumors eingedrungen sind und sie besiedelt haben. Verwenden Sie dann ein schnelles Echtzeit-PCR-Reagenz und eine Echtzeit-PCR-Maschine, die ein schnelles Echtzeit-PCR-Protokoll für die quantitative PCR-Analyse der Probe in Echtzeit unterstützt. Für den Nachweis von metastasierenden Brustkrebszellen in der Lunge, verwenden Sie sezieren Schere, um die Brusthöhle zu öffnen und schneiden Sie vorbei an Herz und Thymus, um die Luftröhre zu belichten.Legen Sie eine 22-Spur-Nadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze mit Bouin-Lösung befestigt ist, in die Luftröhre ein und drücken Sie den Kolben, bis die zusammengebrochene Lunge mit etwa zwei Millilitern der Lösung angeschwollen ist. Entfernen Sie die Spritze und die Nadel, sobald die Lunge aufgeblasen wurde, und übertragen Sie die gesamte Lunge in ein 15-Milliliter-Rohr mit frischer Bouin-Lösung. Umkehren Sie das Rohr ein paar Mal vorsichtig, bevor Sie das Gewebe 24 Stunden bei Raumtemperatur einweichen lassen.Am nächsten Tag die Lunge mit Wasser abspülen und die Probe in eine Röhre mit 70% Ethanol geben. Verwenden Sie dann ein Sezieren des Mikroskops, um die Anzahl der metastasierenden weißen Flecken und Knötchen auf den Oberflächen der Lunge zu zählen. Die Tumorvolumenmessung per Bremssattel ist eine etablierte Methode zur Beurteilung der Behandlungswirksamkeit.Um vergleichbare Signale zwischen den Studiengruppen zu erhalten, muss eine vor-imaging BLI-Kinetik-Studie durchgeführt werden, um den besten Bildgebungszeitrahmen zu bestimmen. Aufgrund des überlegenen Signal-Hintergrund-Verhältnisses ist der Ganzkörper in vivo BLI im Vergleich zum GFP-Ansatz sehr empfindlich bei der Erkennung von Metastasensignalen mit niedrigem Niveau. Aufgrund der stabilen Natur des GFP-Moleküls haben die Forscher jedoch genügend Zeit, um den Kadaver zu verarbeiten, bevor sie die GFP-Signale von Zielorganen in Dual-Reporter-Studien erfassen.Dieses Beispiel aus dem wirklichen Leben zeigt, wie Messung der Größe von Bremskörpern die Dateninterpretation verzerren kann, da dieses Xenograft den größten Teil des lebensfähigen Tumorzellgehalts verloren hat, während es seine große Masse und Form beibehält. Molekulare Detektion durch Echtzeit-PCR kann auch überzeugende Beweise für Gehirnmetastasen im orthotopischen Brustkrebsmodell mit exogener GFP-DNA-Sequenz liefern, da die transfizierte GFP-DNA-Sequenz natürlicherweise nicht bei Menschen oder Nagetieren existiert. Die Implantationsstelle sollte physiologisch und anatomisch mit Krebsmalignität zusammenhängen.Sowohl Tumorgen als auch Proteinexpression können an primären und distalen Stellen ausgewertet werden und metastasierende Zellen können für eine weitere Charakterisierung isoliert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Das Video demonstriert die orthotope Inokulationstechnik für Brustkrebs in einem Mausmodell. Diese Technik führt zu einer hohen Tumorgeneserate mit geringerer Variabilität in Tumorgröße und -form im Vergleich zur subkutanen oder nicht-chirurgischen Injektion.

Orthotope Injektion: Implantation gewebespezifischer Krebszellen in eine erwachsene Maus

Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die durch den den Tumor umgebenden Gewebes sowie lokale pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren beeinflusst wird. Daher kann orthotrope Pritzer, anstatt subkutanen Modellen nützlich sein, um Krebsprogression in einer Weise, dass eine bessere ahmt menschlichen Pathologie studieren.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Eine orthotope Brustkrebs primären Tumormodell und die operative Entfernung des Primärtumors Maus Lebensdauer zu verlängern spontane Metastasierung zu erzeugen, werden beschrieben. Das Tumorwachstum und Progression werden überwacht und durch Luciferase Fluoreszenzbildgebung quantifiziert.

Ein orthotopen Mausmodell des Spontan Metastasierung von Brustkrebs

Wir führen einen murinen orthotopen Brust Krebs Modell und radikale Mastektomie Modell mit Biolumineszenz-Technologie, die Tumorlast um menschliche Muttermilch Tumorprogression imitieren zu quantifizieren.

Generieren eines murinen orthotopen metastasierendem Brustkrebs Krebs Modells und Durchführung von murinen radikale Mastektomie

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Brustkrebs-Zellen in der Mamma Fettpolster in einer einfachen, weniger invasiv und einfach zu handhabende Möglichkeit, einzupflanzen und dieses orthotopen Brust Krebs Mausmodell mit einer richtigen Mamma Fettlappen Umgebung kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte zu untersuchen Krebs.

Orthotopen Injektion von Brustkrebs-Zellen in den Mäusen Mamma Fettlappen

Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) und transplantierbare gentechnisch veränderte Mausmodelle rekapitulieren menschliche Krankheiten originalgetreu und sind bevorzugte Modelle für die grundlegende und translationale Brustkrebsforschung. Hier wird eine Methode beschrieben, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, um die Tumorbiologie zu untersuchen und die Arzneimittelreaktion zu bewerten.

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Hier beschreiben wir eine nichtinvasive Überwachungsmethode, die Luciferase und grün fluoreszierende Proteinexpression in verschiedenen Brustkrebszelllinien beinhaltet. Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Überwachung der Tumorbildung und der metastasierenden Besiedlung in Echtzeit bei Mäusen.

Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Intratibia-Osteosarkom-Zellinjektion zur Generierung von Mausmodellen mit orthotopen Osteosarkom- und Lungenmetastasenläsionen.

Intratibiale Osteosarkom-Zellinjektion zur Erzeugung orthotoper Osteosarkom- und Lungenmetastasen-Mausmodelle

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente, nicht-chirurgische Methode zur orthotopen Implantation von Xenotransplantaten von Brustkrebspatientinnen bei Mäusen. Die Technik beinhaltet eine enzymatische Tumordissoziation, gefolgt von einer direkten Injektion in die Brustfettpolster, was eine Hochdurchsatzimplantation ermöglicht. Die umfassende Validierung gewährleistet die Modelltreue und ermöglicht strenge Studien über verschiedene Brustkrebs-Subtypen hinweg.

Hochdurchsatz-Dissoziation und orthotope Implantation von Xenotransplantaten von Brustkrebspatientinnen

Die Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele, die von präklinischen Tests zu Versuchen am Menschen übergehen, ist eine wissenschaftliche Priorität. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier einen funktionellen genomischen Ansatz, um die Auswirkungen der Genverarmung auf Sphäroide von Krebszelllinien zu untersuchen, die menschliche Krebserkrankungen in vivo besser modellieren.

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

Lernen Sie ein verbessertes Protokoll zur Tumordetektion mit GFP-Tagging und Biolumineszenz-Bildgebung im orthotopen Brustkrebsmodell. Diese Methode ermöglicht präzise Quantifizierung von Mikrometastasen und Evaluierung therapeutischer Wirksamkeit.

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

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