Pneumokokken-Infektion von primären humanen Endothelzellen im konstanten Fluss

Die Verwendung dieses Endothelzellkultursystems ermöglicht die Assimilation der Situation im Blutfluss. Und mit dieser Situation können wir bakterielle Infektionsprozesse analysieren, einschließlich der Identifizierung von bakteriellen Vektoren und auch von Zellvektoren, die an diesem Prozess beteiligt sind. Diese Technik ebnet den Weg, um die Auswirkungen von bakteriellen Infektionen auf die Gefäßintegrität zu erforschen, einschließlich der Auswirkungen auf Morphogenese-Mechanismen, auf Entzündungsreaktionen und Immunregulation.

Diese Technik erfordert eine besondere Handhabung der Endothelzellen und daher ist eine visuelle Beschreibung besser als nur eine verbale Erklärung. Diese Methode bietet Einblicke in mehrere andere Forschungsbereiche, die mit durchlässigen Gefäßsystemen korreliert sind, wie z. B. Endothelzelldifferenzierung, Wundheilung, Tumorgenese und Angiogenese. Einer der wichtigsten Schritte ist die standardisierte Zellkultivierung sowie die genaue Handhabung der primären Endothelzellen.

Diese Technik erfordert eine spezielle Zellkultur-Handhabung, die nicht durch nur verbale Erklärung klar sein könnte. Um zu beginnen, arbeiten Sie in einer sterilen Umgebung mit einer sauberen Bank. Verwenden Sie eine Pipette, um 100 Mikroliter einer 2% sterilgefilterten Schweinegelatine PBS-Lösung in ein einziges Reservoir eines Temperaturausgleichskanalschlittens zu injizieren.

Legen Sie den gelatinebeschichteten Kanalschlitten auf eine dünne Polystyrol- oder Styroporplatte, um einen Temperaturabfall mit einer Ein-Milliliter-Luer-Spritze zu verhindern, um 100 Mikroliter der viermal 10 bis fünfmilliliter HUVEC-Suspension in den Schlitten zu geben, um den HUVEC zu saaten und zu kultivieren. Inkubieren Sie den Kanalschlitten mit dem HUVEC 60 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Danach füllen Sie jedes mittlere Reservoir an beiden Enden des Kanalschlittens mit 60 Mikroliter ECGMS-Medium.

Weitere eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Um die mikrofluidische Pumpe einzustellen, schließen Sie zunächst den gleichgelegten Perfusionssatz an die Pumpeneinheit an, füllen Sie sie mit 13,6 Milliliter ECGMS-Medium und starten Sie die Pumpensteuerungssoftware. Wählen Sie im Menü des Fluidgeräte-Setups den geeigneten Perfusionssatz und die Art der Kammerrutsche mithilfe der Scroll-Down-Fenster aus.

Wählen Sie 0,007 Dyne Sekunde pro Quadratzentimeter in der Software für mittlere Viskosität. Schließen Sie außerhalb des Inkubators eine mit trocknenden Kieselsäureperlen gefüllte Glasflasche an die Luftdruckschläuche an. Wählen Sie die Durchflussparameter im Softwaremenü aus, stellen Sie den Druck auf 40 Millibar ein und spülen Sie die Pumpenrohre mit dem flüssigen Medium, indem Sie den kontinuierlichen Mittleren Strom starten.

Wir sorgen durch den Einsatz subkonfluent gewachsener HUVECs für eine enge Zellbefestigung und konzentrieren uns zusätzlich darauf, Luftblasen aus dem System zu holen sowie eine unabhängige Stromversorgung für das Pumpensystem zu nutzen. Tippen Sie auf die Schlauchanschlüsse, um Luftblasen zu entfernen und sicherzustellen, dass keine Luftblasen im Pumpensystem zirkulieren. Zum Anschluss des Kanalschlittens stoppen Sie die Durchflusszirkulation in der Pumpensteuerungssoftware und halten den mittleren Durchfluss und die Perfusionsschläuche, indem Sie die Rohre in der Nähe der Luer-Verbindung spannen.

Schließen Sie den Kanalschlitten an und vermeiden Sie Luftblasen. In der Pumpensteuerungssoftware Advanced Tab, verwenden Sie die Software-Tool-Zyklus-Ersteller, um die gewünschten Scherspannungszyklen für die Strömungskultivierung zu programmieren. Programmieren Sie die Scherspannungsstufen für die Durchflusszirkulation und beginnen Sie mit der Langzeitdurchblutung.

Beginnen Sie mit fünf Dyne pro Quadratzentimeter, was einer Durchflussrate von 5,44 Milliliterpro Minute für 30 Minuten entspricht, gefolgt von einem kontinuierlichen Durchfluss bei Scherspannung von 10 Dyne pro Quadratzentimeter, was einer Durchflussrate von 10,85 Millilitern pro Minute entspricht. Steuern Sie ausgewogenes Reservoirpumpen. Platzieren Sie die Fluideinheit mit dem angeschlossenen Kanalschlitten in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.

Starten Sie die Steuerung der Mikroskopsoftware und passen Sie die Haupteinstellungen für die fluoreszenzmikroskopische Überwachung an, indem Sie die entsprechenden Filtereinstellungen auswählen. Zur mikroskopischen Visualisierung legen Sie die Fluideinheit in die 37 Grad Celsius Heizkammer. Platzieren Sie die Kanalrutsche auf der Bühne eines vorgewärmten Mikroskops.

Kontrollieren Sie die Zellmorphologie und die Integrität der HUVEC-Schicht vor der Injektion von Histamin und Bakterien in die Durchblutung. Behalten Sie die Flow-Einstellung bei. Induzieren Sie die Freisetzung von VWF aus endotheliaallebensfähigen Palade-Körpern, indem Sie 136 Mikroliter einer 100 Millimolar-Histamin-Stammlösung durch einen Injektionsport in das in den Perfusionsschläuchen zirkulierende ECGMS-Medium injizieren.

Zum Immunfluoreszenznachweis von mehrfach verfeinerten VWF-Strings 20 Mikrogramm eines VWF-spezifischen FITC-konjugierten Antikörpers in einem Volumen von 200 MikroliterPBS in das zirkulierende 13,6 Milliliter ECGMS-Medium. Um die Pneumokokken-Befestigung an den auf HUVEC-Zelloberflächen erzeugten VWF-Strings zu quantifizieren, spritzen Sie mit dem Injektionsanschluss 1,35 mal 10 mal 10 in die achte KBE pro Milliliter RFP, die Pneumokokken in einem maximalen Volumen von einem Milliliter in das ECGMS-Medium ausdrücken. Wählen Sie ein 63-faches Öl-Tauchobjektiv für die Mikroskopvergrößerung und passen Sie die Fluoreszenzfiltereinstellungen in der Mikroskopsoftware an den RFP-Kanal mit einem 540-Nanometer-Detektionsfilter zur Detektion von RFP-exezierenden Pneumokokken an.

Für die Quantifizierung der bakteriellen Bindung an die VWF-Strings erstellen Sie Momentaufnahmen von Z-Stacks von mindestens 30 repräsentativen Feldansichten, die jeweils etwa 10 morphologisch intakte HUVEC enthalten, und zählen die Menge an Pneumokokken. Um die bakterielle Anhaftung nach fixierender Fixierung vor der immunfluoreszentorben Färbung zu bewerten, stoppen Sie den Fluss, entfernen Sie 10 Milliliter ECGMS-Medium aus den Pumpenspeichern, und fügen Sie 10 Milliliter PBS hinzu, die mit 5% Paraformaldehyd ergänzt werden, und gehen Sie entsprechend dem Manuskript vor. In diesem Protokoll beginnen die prinzipiellen experimentellen Schritte mit einer Vorkultivierung von primären Endothelzellen zur Subkonfluenz in Zellkulturkolben.

Die Zellen werden dann in einen gelatinebeschichteten Kanalschlitten gesät. Bakterien werden auf Agarplatten angebaut, gefolgt von der Kultivierung in einer komplexen flüssigen mittleren bis mittleren Logphase. Bei der mikrofluidischen Zellkultur ist ein Kanalschlitten mit Endothelzellen mit den Perfusionsröhren einer Fluideinheit des Pumpensystems verbunden und einem konstanten Durchfluss zur Zelldifferenzierung ausgesetzt.

Die Erzeugung der VWF-Strings wurde durch Histamin-Injektion bei einer Scherspannung von 10 Dynesekunden pro Quadratzentimeter induziert und mikroskopisch durch Immunfluoreszenzdetektion mit FITC-gekennzeichneten VWF-spezifischen Antikörpern überwacht. Nach Der Injektion von rotem Fluoreszenzprotein, das Bakterien in das zirkulierende Medium exzessiert, wurde die Pneumokokken-Anhaftung an den VWF-Strings mikroskopisch in Echtzeit durch Fluoreszenzemission bei 450 Nanometern visualisiert. Nach der Fixierung der Zellen mit PFA ermöglicht die Differentialimmunfluoreszenzfärbung die Visualisierung der bakteriellen Anhaftung an bestimmten Infektionszeitpunkten.

Der wichtigste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, eine enge Zellbefestigung auf der Gleitfläche zu gewährleisten, indem physiologische Scherspannungsniveaus angepasst und extreme Pumpendruckschwankungen vermieden werden. Neben der mikroskopischen Visualisierung kann diese Technik zur Untersuchung der pharmakologischen Wirkungen neuer Antiinfektiva und auch zur Analyse der langzeitigen Folgen der gefäßvaskulären Infektionsprozesse eingesetzt werden. Dieses Pumpensystem durchdringt bakterielle Krankheitserreger durch Luftdruck, um eine Übertragung über Aerosole zu verhindern.

Es wird empfohlen, die Biosicherheitsvorkehrungen zu befolgen.