Name: Prostataorganoidkulturen als Werkzeuge zur Übersetzung von Genotypen und Mutationsprofilen in pharmakologische Reaktionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Lernen Sie die Bewertung pharmakologischer Reaktionen in Prostataorganoidkulturen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genotyp-Einflüssen auf Arzneimittelwirkungen und die Modellierung von Resistenzmechanismen.

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K.P. wird von NIH 1F32CA236126-01 unterstützt. C.L.S. wird von HHMI unterstützt; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; und Starr Cancer Consortium. W.R.K. wird von dutch Cancer Foundation/KWF Buit 2015-7545 und Prostate Cancer Foundation PCF 17YOUN10 unterstützt.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Arbeiten wurden mit zuvor etablierten murinen Organoiden und patientenabgeleiteten Organoiden durchgeführt. Alle tierischen Arbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Research Animal Resource Center des Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IACUC: 06-07-012) durchgeführt. Alle patientenabgeleiteten Gewebe wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften des Memorial Sloan Kettering Cancer Center (IRB: 12001) gesammelt.
1. Mittel- und Puffervorbereitung
<ol><li>Vor Beginn des Experiments die Kellermembranmatrix (z.B. Matrigel) bei 4 °C über Nacht auftauen. Halten Sie es während des Gebrauchs auf Eis.</li>
	<li>Kulturplatten vor Experimenten für 24 h bei 37 °C platzieren. Dies wird der Kellermembran-Matrixkuppel (im Folgenden als Matrixkuppel bezeichnet) helfen, polymerisieren zu können. Die Beschichtung von Organoiden wird in Schritt 2.1.2 beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie das organoide Medium gemäß dem etablierten Protokoll5vor.</li>
	<li>Bereiten Sie das organoide Medium ohne Zugabe eines epidermalen Wachstumsfaktors vor (EGF; siehe Tabelle der Materialien für Komponenten). EGF unterdrückt die AR-Transkriptionsausgabe und verleiht Anti-Androgen-Resistenz5.</li>
	<li>Bereiten Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) vor. HINWEIS: Dieses Medium wird verwendet, um die enzymatische Verdauung mit Trypsin-Ersatz in abschnitt2-4 zu hemmen.</li>
	<li>Bereiten Sie Arzneimittellösungen gemäß dem Herstellerprotokoll vor. Für Enzalutamid/mdv3100 (im Folgenden als Antiandrogen der zweiten Generation bezeichnet) wird eine Stammlösung von 100 M in Dimethylsulfoxid (DMSO) zubereitet. Der Vorrat kann bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden und muss nicht frisch gemacht werden.</li>
</ol>2. Isolierung, enzymatische Verdauung und Etablierung von Organoiden
<ol><li>Isolieren Sie Prostata-Organoide aus Maus oder menschlichem Gewebe nach den zuvor festgelegten Protokollen5,7. Eine kurze Beschreibung finden Sie unten.<ol>
<li>Mince und enzymatisch verdauen Prostatagewebe, um eine einzellige Suspension zu produzieren. In diesem Experiment wurde 1 ml von 5 mg/ml Kollagenase Typ II in ADMEM/F12 zur Verdauung von 50 mg Prostatagewebe verwendet.</li>
		<li>Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min, zählen Sie die Zellen, setzen Sie sie in der Kellermembranmatrix wieder auf und Platten mit der entsprechenden Dichte5,7 in den Matrixkuppeln auf vorgewärmten organoiden Kulturplatten (Plating Methode ist in Abbildung 1Adargestellt.</li>
		<li>Lassen Sie die Kuppeln verfestigen und fügen Sie Medien auf die Oberseiten der Kuppeln, so dass sie vollständig abgedeckt sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wachsen Sie Organoide auf die gewünschte Menge für nachgeschaltete Anwendungen. Die Zellennummer kann durch Standardzählmethoden bestimmt werden. Weitere Informationen zur Dichte finden Sie im anwendungsspezifischen Abschnitt des Protokolls.</li>
	<li>Mit einer P1000 Pipette, ziehen Sie das Medium und Pipette nach oben und unten zu stören. Wenn die Kellermembranmatrix vollständig gestört ist, übertragen Sie die Suspension in ein 15 ml konisches Rohr. Platzieren Sie nicht mehr als 10 Kuppeln pro einzelnem 15 ml konischen Rohr. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.</li>
	<li>Ziehen Sie den Überstand ab und waschen Sie das Zellpellet mit 5 ml PBS. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.</li>
	<li>Ziehen Sie den Überstand ab und setzen Sie das Pellet in 4 ml Trypsin-Ersatz wieder auf. 5-10 min mit Schütteln bei 37 °C verdauen. Fügen Sie ein gleiches Volumen organoiden Medium + 10% FBS, um den Trypsin-Ersatz zu hemmen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.</li>
	<li>Ziehen Sie den Überstand ab und setzen Sie ihn in 1 ml PBS wieder auf.</li>
	<li>Filtern Sie die Suspension mit einem 40-mm-Filter, um eine Einzelzellensuspension zu gewährleisten. Quantifizieren Sie die Zellennummer mit einem Hämozytometer oder einem gleichwertigen Zählgerät. HINWEIS: Wenn es schwierig ist, lebensfähige Einzelzellen zu erhalten, verwenden Sie die Durchflusssortierung, um eine Einzelzellenlösung zu erhalten.</li>
</ol>3. Beurteilung der Organoidbildungskapazität
HINWEIS: Um den Prozentsatz der Zellen zu bestimmen, die ein Organoid erzeugen können, kann ein Seeding-Assay als Proxy für das Stamm-/Vorläuferpotential durchgeführt werden. Die Organoidbildungskapazität ist auch wichtig für die Definition einer Zellsäzahl für die Lebensfähigkeits-Assays.
<ol><li>Verdünnen Sie die in Schritt 2,7 bis 100 Zellen pro 10 l der Suspension erhaltene Zellsuspension mit organoiden Mitteln, die 10 M Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 enthalten.</li>
	<li>Übertragen Sie 1.100 Zellen (110 L Suspension) in ein neues konisches Rohr.</li>
	<li>Fügen Sie 285 L Kellermembranmatrix hinzu und suspendieren Sie die Zellen. Dies führt zu einer Matrixkonzentration von 70 %. HINWEIS: Die Verdünnung der Kellermembranmatrix während der Aussaat reduziert die Streuung der Kuppelgröße, die durch die Viskosität der Proteinmatrix verursacht wird, erheblich.</li>
	<li>Samenzellen in 35 L Matrixkuppeln in einer vorgewärmten 24-Well-Platte, was zu 200 Zellen/Well führt. Platte 3-5 repliziert pro Probe (siehe auch Beschichtungsmethode in Abbildung 1A und Schritt 2.1.2).</li>
	<li>Um sicherzustellen, dass die Zellen innerhalb der Matrixkuppel verbleiben, kippen Sie die Platte um und legen Sie sie in einen Zellinkubator, um die Kellermembranmatrix zu erstarren.</li>
	<li>Nach 10 min entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie Medium mit dem Rho-Kinase-Inhibitor hinzu.</li>
	<li>Erfrischen Sie das Medium alle 2 Tage. Nach 7 Tagen, quantifizieren Sie die Anzahl der Organoide. Halten Sie den Rho-Kinase-Inhibitor in den Medien während des gesamten Experiments.</li>
	<li>Zählen Sie die Anzahl der pro Kuppel eingerichteten Organoide und berechnen Sie den Prozentsatz der Organoide, die aus der Gesamtzahl der plattierten Zellen (200 Zellen) gebildet werden. HINWEIS: Die Organoiden-Betriebsverhältnisse variieren je nach Zelltyp und Genotyp zwischen 3%und 60%.</li>
</ol>4. Bestimmung der pharmakologischen Reaktionen von Organoiden
<ol><li>Weiter von Schritt 2.7, Samen 1.000-10.000 Zellen in einer Matrixkuppel. Verwenden Sie die Organoidbildungseffizienz und Wachstumsgeschwindigkeit als Proxy für die Bestimmung der endgültigen Zellzahl. HINWEIS: Empfohlene Zellennummern sind in Tabelle 1angegeben. Verwenden Sie drei bis fünf Replikationen pro Bedingung pro Analyse. Verwenden Sie eine Endkonzentration von 70% Kellermembranmatrix, um Pipettierfehler zu reduzieren, die durch die Viskosität induziert werden.</li>
	<li>Saat 35 l Matrixkuppeln in einer 24-Well-Platte und lassen Sie die Kuppeln wie in Abschnitt 3 verfestigen (siehe auch Beschichtungsverfahren in Abbildung 1A und Schritt 2.1.2). Fügen Sie Medium mit dem Rho-Kinase-Inhibitor und Medikament der Wahl. Diese Methode kann auf alle Medikamente angewendet werden, aber in diesem Protokoll wird ein Anti-Androgen der zweiten Generation bei 10 M für ein Beispiel verwendet. Um die halbmaximale hemmende Konzentration (IC50) zu bestimmen, führen Sie eine log10 inkrementelle, und als Kontrolle, verwenden Sie das Fahrzeug, in dem das Medikament gelöst wurde.</li>
	<li>Erfrischen Sie das Medium alle zwei oder drei Tage und analysieren Sie die Organoide am 7. Tag, um die pharmakologische Reaktion des Arzneimittels zu bestimmen. Die Zeitpunkte können je nach Experiment und Medikament variieren. HINWEIS: Organoide müssen nicht versucht werden, um diese Assays durchzuführen.</li>
	<li>Um Organoide intakt zu halten, mit einer P1000 Pipette, ziehen Sie das Medium und Pipette nach oben und unten, um die Kellermembranmatrix zu stören.</li>
	<li>Wenn die Kellermembranmatrix vollständig gestört ist, übertragen Sie die Suspension auf ein 15 ml konisches Rohr. Übertragen Sie nicht mehr als 10 Matrixkuppeln pro 15 ml konischem Rohr.</li>
	<li>Zentrifuge bei 300 x g für 5 min. Den Überstand abziehen und mit 5 ml PBS waschen.</li>
	<li>Organoide in 1 ml PBS wieder aufsetzen und die Organoide mit Trituration und einer gläsernen Pasteurpipette stören.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Anzahl der organoiden Fragmente. Seed 5 repliziert, die 100 organoide Fragmente enthalten, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben.</li>
	<li>Führen Sie den Zelllebensfähigkeitstest wie unten in Abschnitt 7 beschrieben durch.</li>
</ol>5. RNA-Isolierung von Organoiden
HINWEIS: Kommerziell erhältliche säulenbasierte Methoden liefern eine gute Quantität und Qualität der RNA. Um eine gute RNA-Menge zu gewährleisten, verwenden Sie mindestens eine Kuppel pro Probe; Es wird jedoch empfohlen, drei Kuppeln zu verwenden, die in einem einzigen Brunnen einer 12-Well-Platte gesät werden können.
<ol><li>ß-Mercaptoethanol hinzufügen (1%) glutathionlyse puffer im RNA-Isolationskit.</li>
	<li>Ziehen Sie das Medium aus den Kellermembrankuppeln mit Organoiden ab und fügen Sie 750 l dieses Puffers hinzu. Pipette nach oben und unten mit einer P1000 Pipette. Überprüfen Sie, ob die gesamte Kellermembranmatrix aufgelöst wurde.</li>
	<li>750 L Ethanol hinzufügen und durch Pipettieren mischen. Anschließend 700 l des Gemischs auf die Säule übertragen, bei 12.000 x g 1 min zentrifugieren und mit dem Rest des Lysats wiederholen.</li>
	<li>Führen Sie Wähungen und eine On-Column-DNase-Behandlung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Elute-RNA in 30-50 l RNAse-freiem Wasser.</li>
	<li>Messen Sie die Konzentrationen mit einem Fluorometer bei OD = 260 nm und 280 nm und lagern Sie bei -80 °C oder setzen Sie sich mit nachgelagerten Anwendungen fort.</li>
</ol>6. Proteinisolation von Organoiden
HINWEIS: Für die Proteinisolierung bereiten Sie den Standard-RIPA-Puffer vor, der Phosphatase- und Proteaseinhibitoren enthält (Materialtabelle). Es wird empfohlen, mindestens drei Kuppeln zu verwenden, die in einem einzigen 12 Brunnen gesät werden können.
<ol><li>Mit einer P1000 Pipette, ziehen Sie das Medium aus der Zelle mit den Keller Membrankuppeln mit Organoiden und Pipetten nach oben und unten, um die Kellermembranmatrix zu stören.</li>
	<li>Wenn sie vollständig gestört ist, übertragen Sie die Aufhängung auf ein 15 ml konisches Rohr. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.</li>
	<li>Den Überstand abziehen und mit 5 ml eiskaltem PBS waschen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.</li>
	<li>Ziehen Sie den Überstand ab und setzen Sie das Pellet in 4 ml Trypsin-Ersatz wieder auf. 5-10 min verdauen, während sie bei 37 °C schütteln.</li>
	<li>Fügen Sie ein gleiches Volumen des organoiden Mediums + 10% FCS hinzu, um den Trypsin-Ersatz zu hemmen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min. HINWEIS: Nach der Zentrifugation sollte keine Kellermembranmatrix im Pellet sichtbar sein.</li>
	<li>Den Überstand abziehen und mit 5 ml eiskaltem PBS waschen. Ziehen Sie den Überstand ab und setzen Sie das Zellpellet in 300 l Lysepuffer mit einer P1000 Pipet wieder ab und übertragen Sie es dann in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.</li>
	<li>10 min auf Eis bebrüten und anschließend 2x für je 30 s bei gekühltem Wasser bei einer Temperatur von 4 °C beschallen. Legen Sie die Röhre wieder auf Eis und führen Sie die Proteinquantifizierung mit Standardmethoden durch.</li>
	<li>Denaturieren Sie das Protein durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat (SDS), das Belastungsfarbstoff enthält, und kochen Sie 5 min bei 95 °C. Lysate bei -80 °C lagern oder mit nachgeschalteten Anwendungen fortfahren.</li>
</ol>7. Zelllebensfähigkeitstest mit Organoiden
HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeit kann mit dem handelsüblichen Zelllebensfähigkeits-Assay-Kit und einem Luminometer beurteilt werden. Bereiten Sie Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Es werden fünf Replikationen pro Zustand empfohlen: eine Replikation, die aus einer 35-L-Kellermembran-Matrixkuppel in einem Brunnen einer 24-Well-Platte besteht.
<ol><li>Zeichnen Sie das Medium der organoiden Kultur ab, wobei Sie darauf achten, die Matrixkuppeln intakt zu lassen.</li>
	<li>Fügen Sie 65 L PBS und Pipette nach oben und unten hinzu, um die Matrixkuppel zu stören.</li>
	<li>Fügen Sie 100 L des Zelllebensfähigkeits-Assay-Kit-Puffers hinzu und setzen Sie sie durch Pipettieren wieder auf.</li>
	<li>Bei Raumtemperatur (RT) 10 min mit Schütteln inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie 100 l gemisch auf eine nicht transluzente Platte, die für das Luminometer geeignet ist, und führen Sie das Lesen gemäß den Anweisungen des Herstellers für das Zelllebensfähigkeits-Assay-Kit durch.</li>
</ol>8. Zubereitung von Organoiden für xenografting
HINWEIS: Organoide sind auch für subkutane Transplantationen bei immungeschwächten Tieren sowie isogenen Mäusen geeignet. Um sicherzustellen, dass in vivo injizierte Organoide unterscheidbar sind, kennzeichnen Sie Organoide mit einem konstitutiv exzierenden Fluorophor5. Es wird empfohlen, ein Pilotexperiment für die Transplantation mit 5 x 105 Zellen bis 2 x 106 Zellen pro Injektion durchzuführen, mit Schritten von 5 x 106 Zellen, da die Pfropfeffizienz zwischen organoiden Linien variiert.
<ol><li>Mit einer P1000 Pipette, ziehen Sie das Medium und Pipette nach oben und unten, um die Kellermembranmatrix zu stören. Wenn sie vollständig gestört ist, übertragen Sie die Aufhängung auf ein 15 ml konisches Rohr. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min. HINWEIS: Übertragen Sie nicht mehr als 10 Matrixkuppeln pro 15 ml konischem Rohr.</li>
	<li>Den Überstand abziehen und mit 5 ml PBS waschen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.</li>
	<li>Ziehen Sie den Überstand ab und setzen Sie das Pellet in 4 ml Trypsin-Ersatz wieder auf. 5-10 min verdauen, während sie bei 37 °C schütteln.</li>
	<li>Fügen Sie gleicheVolumen des organoiden Mediums + 10% FBS hinzu, um den Trypsin-Ersatz zu hemmen. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.</li>
	<li>Ziehen Sie den Überstand ab und setzen Sie ihn in 1 ml PBS wieder auf. Filtern Sie die Suspension mit einem 40-mm-Filter, um eine Einzelzellensuspension zu gewährleisten. Quantifizieren Sie Zellen mit Standardmethoden.</li>
	<li>Drehen Sie die Zellen im PBS+ Rho-Inhibitor auf eine Konzentration von 2 x 106 Zellen pro 100 l aus (siehe Tabelle 2 für Zellkonzentrationen und absolute Zellzahl, die für unterschiedliche Konzentrationen erforderlich sind). Verwenden Sie ein gleiches Volumen der Kellermembranmatrix, um eine 1:1 Suspension zu erzeugen. Legen Sie die Suspension auf Eis.</li>
	<li>Injektion von Zellen nach Standardprotokollen und Überwachung des Xenograft-Wachstums mit Standardmethoden8.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162 (2), 454(2015).</li>
<li>Arora, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+Receptor+Confers+Resistance+to+Antiandrogens+by+Bypassing+Androgen+Receptor+Blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade.</a> Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).</li>
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<li>Mu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+promotes+lineage+plasticity+and+antiandrogen+resistance+in+TP53-+and+RB1-deficient+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer.</a> Science. 355 (6320), 84-88 (2017).</li>
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<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Cultures+Derived+from+Patients+with+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
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<li>Carver, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+feedback+regulation+of+PI3K+and+androgen+receptor+signaling+in+PTEN-deficient+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer.</a> Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).</li>
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</ol>

C.L.S ist Mitglied des Verwaltungsrats von Novartis; ist Mitbegründer von ORIC Pharmaceuticals und Miterfinder von Enzalutamid und Apalutamid; ist Wissenschaftsberater von Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra und PMV; und ist Mitbegründer von Seragon, das 2014 von Genentech/Roche gekauft wurde. W.R.K. ist Miterfinder und Patentinhaber der Organoidtechnologie.

Um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Anti-Androgen-Resistenz zugrunde liegen, und um potenzielle therapeutische Schwachstellen zu entdecken, müssen pharmakologische Reaktionen in Modellsystemen getestet werden, die Prostatakrebs imitieren. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur zuverlässigen Analyse pharmakologischer Reaktionen bei patientenabgeleiteten und gentechnisch veränderten Prostataorganoiden und zur Herstellung dieser Organoidproben für nachgelagerte Anwendungen beschrieben.
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Arzneimittelresistenz ist eines der größten klinischen Probleme in der Krebsbehandlung. Die Behandlung von metastasierendem Prostatakrebs (PCa) richtet sich in erster Linie an die Androgen-Signalachse. Anti-Androgen-Therapien der nächsten Generation (z. B. Enzalutamid und Abirateron) haben große klinische Erfolge gezeigt, aber praktisch alle PCa entwickelt sich schließlich in Richtung eines Androgen-unabhängigen Zustands oder kastrationsresistenten Prostatakrebses (CRPC).
Jüngste genomische und transkriptomische Profilierung von CRPC ergab, dass es drei allgemeine Mechanismen der Resistenz bei Prostatakrebs: 1) aktivierende Mutationen, die in der Wiederherstellung des Androgenrezeptors (AR) Signalisierung1; 2) Aktivierung der Bypass-Signalisierung, wie in einem präklinischen Modell für Anti-Androgen-Therapieresistenz der nächsten Generation veranschaulicht, in der die Aktivierung des Glukokortikoidrezeptors (GR) den Verlust der AR-Signalisierung2kompensieren kann; und 3) den kürzlich identifizierten Prozess der Linienplastizität, bei dem Tumorzellen Resistenzen erlangen, indem sie Linien von einem vom Wirkstoffziel abhängigen Zelltyp auf einen anderen Zelltyp umstellen, der nicht davon abhängig ist (der in PCa als AR-negativ dargestellt wird und/oder neuroendokrine Erkrankung [NEPC])3,4. Die molekularen Mechanismen, die Arzneimittelresistenzen verursachen, werden jedoch nicht verstanden. Darüber hinaus, erworbene Anti-Androgen-Resistenz kann zu therapeutischen Schwachstellen führen, die ausgenutzt werden können. Daher ist es wichtig, Arzneimittelreaktionen in Modellsystemen zu bewerten, die Phänotypen und Genotypen von Patienten imitieren.
Prostata-Organoide sind organotypische Kulturen, die in einer 3D-Proteinmatrix mit einem definierten Medium angebaut werden. Wichtig ist, Prostata-Organoide können aus gutartigem und krebsartigem Gewebe murinen oder menschlichen Ursprungs nachgewiesen werden, und sie behalten phänotypische und genotypische Merkmale, die in vivo gefunden werden5,6. Wichtig ist, sowohl Anti-Androgen-empfindliche PCa- als auch CRPC-Zellen sind im aktuellen Kompendium von Organoiden dargestellt. Darüber hinaus lassen sich Prostata-Organoide mit CRISPR/Cas9 und shRNA5leicht genetisch manipulieren. So sind Prostata-Organoide ein geeignetes Modellsystem, um Arzneimittelreaktionen zu testen und Resistenzmechanismen aufzuklären. Hier wird ein detailliertes Protokoll beschrieben, um Arzneimitteltests durchzuführen und pharmakologische Reaktionen mit Prostataorganoiden zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 200 nM</td></tr><tr><td>ADMEM/F12</td><td>Gibco/Life-Technologien</td><td>12634028</td><td>Organoid-Medium-Komponente</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Life-Technologien</td><td>17504-044</td><td>Organoid-Medium-Komponente</td></tr><tr><td>Zellkulturplatten</td><td>Fisher</td><td>657185</td><td></td></tr><tr><td>Zelltiter Glo</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-073</td><td>Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 1 nM</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 50 ng/ml für Maus, 5 ng/nl für</td>Human-FGF10</tr><tr><td></td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>Humanspezifische Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 10 ng/ ml</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Humanspezifische Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 5 ng/ml</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco/Life-Technologien</td><td>35050079</td><td>Organoid-Medium-Komponente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MADE IN-HOUSE</td><td>N/A</td><td>Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 10 mM</td></tr><tr><td>Matrigel (Wachstumsfaktor reduziert & </td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td>Organoide Mediumkomponente</td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>Organoide Mediumkomponente: Endkonzentration 1,25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>Humanspezifische Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 10 mM</td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>Peprotech oder stabile transfizierte 293t Zellen mit Noggin-Konstrukt (Karthaus et al. 2014)</td><td>120-10C</td><td>Organoide Mediumkomponente: Endkonzentration 10% konditioniertes Medium oder 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptavidin</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-109</td><td>Organoide Mediumkomponente</td></tr><tr><td>Phospatase-Inhibitoren</td><td>Merck Millipore</td><td>524629</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Tocris</td><td>3632464</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitoren</td><td>Merck Millipore</td><td>539131</td><td></td></tr><tr><td>R-SPONDIN</td><td>Peprotech oder stabile transfizierte 293t Zellen mit R-Spondin1 Konstrukt (Karthaus et al. 2014)</td><td>120-38</td><td>Organoide Medium Komponente: Endkonzentration 10% konditioniertes Medium oder 500 ng/ml</td></tr><tr><td>RIPA Puffer</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>RNA-easy Minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><ein href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=152121-30-7&amp; Schnittstelle=CAS%20Nr.& lang=de& region=US& focus=product">152121-30-7</a></td><td>Humanspezifische Organoid-Medium-Komponente: Endkonzentration 10 &mu; M</td></tr><tr><td>TryplE</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td>Organoid-Medium Komponente: Endkonzentration 10 &mu; M</td></tr></tbody></table>

prostataorganoidkulturen als werkzeuge zur Übersetzung von genotypen und mutationsprofilen in pharmakologische reaktionen

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Pharmakodynamik, des Stammzellpotenzials und der Krebsdifferenzierung in Prostataepithelialorganoiden vorgestellt. Prostata-Organoide sind Androgen-responsive, dreidimensionale (3D) Kulturen in einem definierten Medium gewachsen, die dem Prostataepithel ähnelt. Prostata-Organoide können aus Wildtyp- und gentechnisch veränderten Mausmodellen, gutartigem menschlichem Gewebe und fortgeschrittenem Prostatakrebs hergestellt werden. Wichtig ist, dass von Patienten abgeleitete Organoide Tumoren in der Genetik und in vivo Tumorbiologie sehr ähnlich sind. Darüber hinaus können Organoide mit CRISPR/Cas9- und shRNA-Systemen genetisch manipuliert werden. Diese kontrollierte Genetik macht die Organoidkultur als Plattform attraktiv, um die Auswirkungen von Genotypen und Mutationsprofilen auf pharmakologische Reaktionen schnell zu testen. Experimentelle Protokolle müssen jedoch speziell an die 3D-Natur von organoiden Kulturen angepasst werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Beschrieben sind detaillierte Protokolle für die Durchführung von Seeding-Assays, um die Organoidbildungsfähigkeit zu bestimmen. Anschließend zeigt dieser Bericht, wie medikamentöse Behandlungen durchgeführt und pharmakologische Reaktionen durch Durchführbarkeitsmessungen, Proteinisolation und RNA-Isolation analysiert werden können. Schließlich beschreibt das Protokoll, wie Organoide für Xenografting und nachfolgende In-vivo-Wachstumstests mit subkutaner Transplantation vorbereitet werden. Diese Protokolle liefern hochreproduzierbare Daten und sind weithin auf 3D-Kultursysteme anwendbar.

Seeding-Effizienz Die Organoidbildungsfähigkeit wird durch Phänotyp und Genotyp bestimmt. Wildtyp (WT) Prostata-Basalzellen zeigten eine überlegene Organoidbildungskapazität (30%-40%) im Vergleich zu Leuchtzellen (3%) (Abbildung 1A). Nach der organoiden Etablierung nahm die Formationskapazität drastisch zu. In der Regel können 25%-30% der Zellen, die aus einem WT-Organoid gewonnen werden, ein neues Organoid bilden (<strong...

Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung pharmakologischer Reaktionen bei prostataepitheliale Organoide vorgestellt. Organoide ähneln der in vivo-Biologie und rekapitulieren die Genetik der Patienten, was sie zu attraktiven Modellsystemen macht. Prostata-Organoide können aus Wildtyp-Prostata, gentechnisch veränderten Mausmodellen, gutartigem menschlichem Gewebe und fortgeschrittenem Prostatakrebs hergestellt werden.

Prostataorganoidkulturen als Werkzeuge zur Übersetzung von Genotypen und Mutationsprofilen in pharmakologische Reaktionen

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Dieses Protokoll bietet Standard- und reproduzierbare Methoden zur Beurteilung pharmakologischer Reaktionen in Prostataorganoidkulturen. Prostataorganoidkulturen bieten ein In-vitro-System, das viele Aspekte der In-vivo-Biologie und pharmakologischen Reaktion bewahrt, indem es Zellen ermöglicht, eine dreidimensionale Struktur in einer Kellermembranmatrix anzunehmen. Wir freuen uns besonders über die Verwendung dieser Methoden, um zu beurteilen, wie der Genotyp die pharmakologische Reaktion in der Prostata diktiert und die Arzneimittelresistenz zu modellieren.Diese Methoden können auf organoide Kultursysteme angewendet werden, die die Dome-Beschichtungsmethode verwenden. Die Komponenten in den Medien, wie z. B. Wachstumsfaktoren, können jedoch je nach Gewebetyp unterschiedlich sein. Die visuelle Demonstration wird eine genauere und detailliertere Diskussion der Protokollschritte und ihrer Unterschiede zu den vielen anderen veröffentlichten organoiden Kultursystemen ermöglichen, die Forschern zur Verfügung stehen.Organoidkultur ist in der Regel zeitaufwändiger als zweidimensionale Zellkultur. Achten Sie darauf, zusätzliche Zeit für diese Methoden zuzuweisen. Beginnen Sie mit der Isolierung von Prostataorganoiden aus Maus oder menschlichem Gewebe.Hacken und enzymatisch verdauen das Gewebe, um eine einzellige Suspension zu produzieren, dann sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 mal g für fünf Minuten. Zählen Sie die Zellen und setzen Sie sie in der Kellermembranmatrix wieder aus. Dann platten sie mit der entsprechenden Dichte in den Matrixkuppeln auf vorgewärmten organoiden Kulturplatten.Kuppeln sollten zwei Millimeter voneinander entfernt und von der Seite des Brunnens sein. Nach der Erstarrung, fügen Sie vorsichtig Medien von der Seite des Brunnens, um zu vermeiden, dass die Matrix gestört. Nachdem die Kuppeln verfestigt haben, fügen Sie Medien auf der Oberseite der Kuppel, so dass sie vollständig bedeckt sind.Wachsen Sie Organoide auf die gewünschte Menge für nachgeschaltete Anwendungen, die die Zellzahl mit Standardzählmethoden bestimmen. Wenn die Organoide einsatzbereit sind, ziehen Sie das Medium mit einer Pten00 Pipette und Pipette nach oben und unten, um die Kellermembranmatrix zu stören. Die Suspension fünf Minuten lang auf ein 15 Milliliter Konisches Rohr und eine Zentrifuge mit 300 mal g übertragen.Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet mit fünf MilliliterPBS. Wiederholen Sie die Zentrifugation, setzen Sie das Pellet dann in vier Milliliter Trypsin-Ersatz wieder auf und lassen Sie es fünf bis zehn Minuten verdauen, während es bei 37 Grad Celsius schüttelt. Fügen Sie ein gleiches Volumen organoiden Mediums mit 10%FBS hinzu, um den Trypsin-Ersatz zu hemmen und das Rohr fünf Minuten lang bei 300 mal g zentrifugieren.Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in einem Milliliter PBS wieder aus. Dann die Zellen mit einem 40-Mikrometer-Filter belasten, um eine einzellige Suspension zu gewährleisten und sie mit einem Hämozytometer zu zählen. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf 100 Zellen pro 10 Mikroliter mit Organoidmedium mit 10 Mikromolar-Rho-Kinase-Inhibitor Y27632.Übertragen Sie 1, 100 Zellen in ein neues konisches Rohr und fügen Sie 285 Mikroliter Kellermembranmatrix hinzu, was zu einer Matrixkonzentration von 70 % führt. Als nächstes säen Sie die Zellen in 35 Mikroliter Matrixkuppeln in einer vorgewärmten 24 WellPlatte, die dafür sorgt, dass pro Probe drei bis fünf Wiederholungen vergoldet werden. Drehen Sie die Platte und legen Sie sie in einen Zellinkubator, um die Kellermatrix zu verfestigen.Nach 10 Minuten die Platte aus dem Inkubator entfernen und Medium hinzufügen, das den Rhokinase-Inhibitor enthält. Erfrischen Sie das Medium alle zwei Tage und nach sieben Tagen, zählen Sie die Anzahl der Pro-Kopf-Gebildeten und berechnen Sie den Prozentsatz der Organoide, die aus der Gesamtzahl der Zellen gebildet werden. Nach der Isolierung der Organoide wie zuvor beschrieben, Samen 1 000 bis 10 000 Zellen in der Matrixkuppel mit Organoid-Bildung Effizienz und Wachstumsgeschwindigkeit als Proxy für die Bestimmung der endgültigen Zellzahl.Dann säen Sie 35 Mikroliter Matrixkuppeln in einer 24-Well-Platte und lassen Sie die Kuppel verfestigen. Fügen Sie Medium mit dem Rho-Kinase-Inhibitor und dem Medikament der Wahl hinzu. Führen Sie ein Log 10 inkrementell durch, um die halbmaximale hemmende Konzentration mit dem Fahrzeug zu bestimmen, in dem das Medikament als Kontrolle gelöst wurde.Erfrischen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage und analysieren Sie die Organoide am siebten Tag, um die pharmakologische Reaktion auf das Medikament zu bestimmen, indem Sie einen Zelllebensfähigkeitstest durchführen, wie im Manuskript beschrieben. Um organoide Fragmente ohne Trypsinisierung zu verplatten, verwenden Sie eine Pten00 Pipette, um das Medium und die Pipette nach oben und unten zu saugen, um die Kellermembranmatrix zu stören. Wenn die Matrix vollständig gestört ist, übertragen Sie die Suspension fünf Minuten lang auf ein 15 Milliliter konisches Rohr und eine Zentrifuge bei 300 mal g.Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter PBS hinzu. Nach dem Waschen die Organoide in einem Milliliter PBS wieder aussetzen und die Organoide durch Triturierung mit einer gläsernen Pasteurpipette stören. Quantifizieren Sie die Anzahl der organoiden Fragmente und Samen fünf Repliken mit 100 Fragmenten, wie zuvor beschrieben.Sieben Tage später führen Sie einen Zelllebensfähigkeitstest nach Manuskriptanweisungen durch. Wilde Prostatabasalzellen zeigten eine überlegene Organoidbildung im Vergleich zu Leuchtzellen. Eine geringfügige Erhöhung der Organoidbildung wurde mit CRISPR-Cas9-vermitteltem Verlust von Pten oder P53 und Verlust der beiden weiteren erhöhten Formationskapazität erreicht.Die Auswirkungen von anti-androgenen Molekülen auf das Wachstum wurden in murinen Organoiden mit verschiedenen Genotypen getestet. Verlust von P53 verursachte keine Resistenz gegen die anti-androgenen Moleküle, aber Verlust von Pten erhöhte Resistenz. Der doppelte Verlust von P53 und Pten führte jedoch zu einem vollständigen Widerstand.Androgen-Rezeptor-Hemmung veränderte auch Phänotypen. Wild-Typ Pten gelöscht und P53 gelöschtE Organoide zeigten die Abnahme der organoiden Lumengröße, während Organoide mit Verlust von Pten und P53 waren phänotypisch unbeeinflusst. Wie erwartet, als diese Zellen subkutan in der Flanke transplantiert wurden, wuchsen nur die doppelt gelöschten Pten- und P53-Organoide.Zwei verschiedene menschliche Prostatakrebs-Organoide MSKPCA2 und MSKPCA3 wurden auf ihre Reaktion auf antiandrogene Moleküle getestet. Die Proliferation von MSKPCA2-Organoiden wurde stark gehemmt, während MSKPCA3-Organoide nicht betroffen blieben. MSKPCA2 drückte hohe Konzentrationen von Androgenrezeptoren und FKBP5 sowie markante leuchtdichte Proteine.MSKPCA3 drückte auch basale und mesenchymale Marker aus und zeigte keinen Ausdruck von FKBP5, was darauf hindeutet, dass diese Organoide einen nicht-luminalen Androgen-unabhängigen Phänotyp modellieren. Organoide müssen in regelmäßigen Abständen entweder durch Trypsinisierung oder Triturierung mit einer Glaspipette gestört werden, um lebensfähig zu bleiben. Die Häufigkeit hängt vom Ursprung der Art und dem Genotyp ab.Nach den beschriebenen Verfahren kann jede Art von Sequenzierungs- oder Proteomikexperiment der nächsten Generation durchgeführt werden. Diese Experimente würden die molekulare Grundlage der Phänotypen und pharmakologischen Reaktionen untersuchen. Diese dreidimensionale organoide Kulturtechnik ermöglicht es Forschern, pharmakologische Reaktionen in einem hochgradig kontrollierten genetischen Kontext in vitro zu untersuchen.Dies kann eine zuverlässige Alternative zu langwierigen In-vivo-Studien sein.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um menschliche primäre Prostata organoide Handhabung führen dann empfehle Endpunkte zur Beurteilung der Phänotyp. Aussaat, Kultur Wartung, Wiederherstellung von Matrix Gel sind morphologische Quantifizierung, einbetten und schneiden, FFPE-Schnitt, ganz-Mount Färbung und Anwendung von kommerziellen Assays bezeichnet.

Bearbeitung und Bewertung der menschlichen primäre Prostata organoide Kultur

Wir zeigen eine Methode zur Nekropsie und Zerlegung von Prostatakrebsmodellen der Maus, die sich auf die Prostatatumorsektion konzentriert. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Erzeugung von Maus-Prostatatumor-Organoiden wird ebenfalls vorgestellt.

Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Maus-Prostata-Organoide stellen einen vielversprechenden Kontext zur Bewertung von Mechanismen dar, die die Differenzierung regulieren. Dieses Papier beschreibt einen verbesserten Ansatz zur Etablierung von Prostataorganoiden und führt Methoden ein, um (1) Proteinlysat aus Organoiden zu sammeln und (2) Organoide für die konfokale Volltonmikroskopie zu fixieren und zu färben.

Bewertung der Differenzierungskapazität von Mausprostataepithelzellen mithilfe der organoiden Kultur

Dreidimensionale Kulturen von Patienten-BMPC-Proben und Xenografts von Knochenmetastasierung Prostatakrebs erhalten die funktionelle Heterogenität ihrer ursprünglichen Tumoren, was zu Zysten, Sphäroiden und komplexen, tumorartigen Organoiden führt. Dieses Manuskript bietet eine Optimierungsstrategie und ein Protokoll für die 3D-Kultur heterogener Patientenproben und deren Analyse mit IFC.

Etablierung und Analyse von dreidimensionalen (3D) Organoiden, abgeleitet von Patienten prostatakrebs Knochenmetastasen Proben und ihre Xenografts

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Bewertung von Arzneimittelsensitivitäten gegenüber zielgerichteten Signalinhibitoren in NSCLC-patientenabgeleiteten Organoidmodellen.

Profiling der Sensitivität gegenüber zielgerichteten Therapien in EGFR-mutierten NSCLC-patientenabgeleiteten Organoiden

Dieses Protokoll beschreibt eine halbautomatische Methode für Organoid-Wirkstoff-Screenings mit mittlerem bis hohem Durchsatz und mikroskopunabhängige, automatisierte Bildanalysesoftware zur Quantifizierung und Visualisierung multiparametrischer, einzelorganoider Arzneimittelreaktionen zur Erfassung der intratumoralen Heterogenität.

Multiparametrisches Tumor-Organoid-Wirkstoff-Screening mit Weitfeld-Live-Cell-Imaging für die Bulk- und Einzelorganoid-Analyse

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Etablierung von humanen Brustorganoiden aus patienteneigenen Brusttumorresektionen oder normalem Brustgewebe bereitgestellt. Das Protokoll enthält eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Kultivieren, Einfrieren und Auftauen von Brustorganoiden aus menschlichen Patienten.

Etablierung und Kultivierung von patienteneigenen Brustorganoiden

Tumor-Organoide haben die Krebsforschung und den Ansatz der personalisierten Medizin revolutioniert. Sie stellen ein klinisch relevantes Tumormodell dar, das es Forschern ermöglicht, dem Tumor in der Klinik einen Schritt voraus zu sein. Dieses Protokoll etabliert Tumor-Organoide aus frischen Gewebeproben des Pankreastumors und von Patienten stammenden Xenotransplantaten aus dem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse.

Etablierung von Pankreaskrebs-abgeleiteten Tumororganoiden und Fibroblasten aus frischem Gewebe

Die Heterogenität des Prostatakarzinoms und die Resistenz gegen die Behandlung bleiben Herausforderungen. Wir beschreiben ein Protokoll zur Generierung von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs), die wichtige elterliche Tumoreigenschaften erhalten. Dieses standardisierte Modell unterstützt das Wirkstoffscreening und die Weiterentwicklung der Präzisionsmedizin.

Etablierung und Pflege von patienteneigenen Prostatakrebs-Organoiden: Ein detailliertes experimentelles Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines auf Maus basierenden Prostataorganoidenmodells, das in 2D gezüchtet wurde. Dazu gehören Organoid-Dissoziation, Zellaussaatung, Differenzierung, Bewertung der Epithelintegrität und In-vitro-Infektionen mit uropathogenen Escherichia coli. Das Modell bietet apikale Zugänglichkeit und eignet sich für die Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen, wodurch die Einschränkungen traditioneller 3D-Organoidsysteme überwunden werden.

Erstellung eines auf Prostataorganoiden basierenden Mausmodells zur Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen

Lernen Sie die Bewertung pharmakologischer Reaktionen in Prostataorganoidkulturen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genotyp-Einflüssen auf Arzneimittelwirkungen und die Modellierung von Resistenzmechanismen.

Prostataorganoidkulturen als Werkzeuge zur Übersetzung von Genotypen und Mutationsprofilen in pharmakologische Reaktionen

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