Name: Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Dynein- und Kinesin-Motorensembles auf DNA-Origami-Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung. Diese Methode ermöglicht präzise Studien zu kooperativen Transportmechanismen motorischer Proteine.

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Wir danken K. Chau, J. Morgan und A. Driller-Colangelo für ihren Beitrag zu den Techniken des segmentierten DNA-Origami-Chassis. Wir danken auch ehemaligen Mitgliedern der Laboratorien Reck-Peterson und Shih für hilfreiche Diskussionen und Beiträge zur ursprünglichen Entwicklung dieser Techniken. Wir danken J. Wopereis und dem Smith College Center for Microscopy and Imaging und L. Bierwert und dem Smith College Center for Molecular Biology. Wir danken dem NSF MRT-Programm für die Anschaffung eines TIRF-Mikroskops.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die molekularen Konstruktionstechniken von DNA-Origami bieten eine einzigartige Möglichkeit, Motorensembles mit definierten Architekturen, Motorzahlen und Typen zu konstruieren, was Studien darüber ermöglicht, wie das entstehende Verhalten aus bestimmten Motorkonfigurationen entsteht31. Da strukturelle und zelluläre Studien weiterhin Beispiele von Zytoskelettmotoren aufklären, die in Teams arbeiten, werden Techniken zur Isolierung und Untersuchung der biophysikalischen und biochemischen Mechanisme...

Dynein und Kinesin sind zytoskelettale motorische Proteine, die für unzählige Funktionen in eukaryotischen Zellen verantwortlich sind1. Durch die Umwandlung der chemischen Energie der ATP-Hydrolyse in produktive Arbeit, diese Motoren translozieren auf Mikrotubuli, um zu schleppen und zu verteilen verschiedene intrazelluläre Ladungen. Sie koordinieren auch in den massiven intrazellulären Umlagerungen im Zusammenhang mit Mitose, wo sie orchestrierte Kräfte aufweisen, die zur Positionierung und Trennung von Chromosomen beitragen. Strukturelle, biochemische und biophysikalische Assays, einschließlich Einzelmolekülbeobachtungen, haben die Mechanismen dieser Motoren auf individueller Ebene aufgedeckt (gut in früherenArbeiten2,3,4). Viele der Aufgaben der Motoren erfordern jedoch, dass sie in kleinen Ensembles ähnlicher und gemischter Motortypen arbeiten. Vergleichsweise weniger wird über die Mechanismen verstanden, die die Aktivität und die endgültige Beweglichkeit dieser Ensembles koordinieren5,6. Diese Wissenslücke ist zum Teil auf die Schwierigkeit zurückzuführen, Ensembles mit steuerbaren Merkmalen wie Motortyp und Kopiernummer zu erstellen. In den letzten zehn Jahren wurden die molekularen Konstruktionstechniken von DNA-Origami eingesetzt, um dieses Problem zu lösen. Für die Mikrotubuli-basierten Motoren sind einige Beispiele dieser Untersuchungen einzelmolekulare Beobachtungen von Ensembles von zytoplasmatischem Dynein-17,8,9, intraflagellar dynein11, verschiedene Kinesinmotoren12,13, und Mischungen von Dyneins und Kinesinen7,14,15. Hier stellen wir Details der Reinigung und Oligonukleotid-Etikettierung von Motoren aus Hefe7,16,17,18,19,20, die Faltung und Reinigung von segmentierten DNA-Origami mit abstimmbarer Konformität8und die Abbildung der Hefemotoren, die die Fahrwerksstrukturenantreiben 7,18.
Die Konstruktion von Motorensembles für die In-vitro-Einzelmolekülbeobachtung erfordert drei Hauptanstrengungen. Die erste ist die Expression, Reinigung und Kennzeichnung von Motorkonstrukten, die für die Befestigung an DNA-Origami geeignet sind. Die zweite ist die Produktion und Reinigung definierter DNA-Origami-Strukturen (oft als "Chassis" bezeichnet). Und die dritte ist die Konjugation der Motoren an die Chassis-Struktur gefolgt von Beobachtung mit totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF). Hier stellen wir etablierte Protokolle für diesen Prozess für rekombinante Mikrotubuli-basierte Motoren bereit, die aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18 gereinigt werden. 19. DNA-Origami-basierte Motorensembles wurden sowohl mit rekombinanten Kinesin15 als auch mit Dynein7,8,18 In diesem Hefeexpressionssystem hergestellten Konstrukten untersucht16 ,17,18,19. Dieses Protokoll gilt für diese Konstrukte, da sie vom galaktoseinduzierten Promotor kontrolliert und mit denselben Protein-Tags zur Reinigung (ZZ und TEV Protease Linker) und für DNA-Oligokonjugation (SNAPtag) verschmolzen werden.
Spezifische Hefestämme erzeugen spezifische Motorkonstrukte. Zum Beispiel wurde das Dynein, das verwendet wurde, um die Rolle der Ladungskonformität zu untersuchen, von der Sorte RPY10847,8gereinigt. Im Allgemeinen können Stämme, die Motorkonstrukte mit den entsprechenden genetischen Modifikationen für die Expression und Reinigung enthalten, von den Laboratorien angefordert werden, die die Verwendung dieser Motoren veröffentlicht haben. Konstrukte mit neuartigen Attributen wie Mutationen oder Tags können mit rekombinanten genetischen Techniken wie Lithiumacetat-Transformation21 und kommerziellen Kits erstellt werden. Detaillierte Protokolle zur Herstellung modifizierter motorischer Proteine in Hefe für Einzelmolekülstudien wurden veröffentlicht19. Zusätzlich zu den Motoren, die mit dem SNAPtag verschmolzen werden, müssen die Oligos, die zur Kennzeichnung der Motoren verwendet werden, mit dem SNAP-Substrat Benzylguanin (BG) konjugiert werden; zuvor veröffentlichte Protokolle beschreiben die Bildung und Reinigung von BG-Oligo-Konjugaten18. Die hier beschriebene Gesamtstrategie wurde auch für actin-basierte Motoren (siehe frühere Arbeiten für Beispiele22,23,24) und Motoren verwendet, die von anderen Organismen und Expressionssystemen gereinigt wurden (siehe vorherige arbeitet für Beispiele7,9,10,11,12,13,14).
Polymerisierte Mikrotubuli (MTs) werden in diesen Experimenten in zwei verschiedenen Verfahren eingesetzt. Mt AffinitätSreinigung von Funktionsmotoren erfordert MTs, die nicht mit anderen funktionellen Gruppen gekennzeichnet sind, während die Motor-Ensemble-Motilität TIRF Assay MTs erfordert, die mit Biotin und Fluorophoren gekennzeichnet sind. In allen Fällen werden MTs mit Taxol stabilisiert, um eine Denaturierung zu verhindern. Der MT-Affinitätsreinigungsschritt wird verwendet, um alle nicht-motilen Motoren mit einer hohen MT-Affinität zu entfernen, da diese Motoren die Beweglichkeit des Ensembles verändern können, wenn sie mit einem Chassis konjugiert werden. Dabei binden aktive Motoren die MTs und bleiben in lösungsweise, während sich im MT-Pellet eng bindende Motoren drehen. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Motoren auf dem Chassis aus einer aktiven Population stammen.
Eine Vielzahl von DNA-Origami-Strukturen wurden verwendet, um zytoskelettale motorische Ensembles zu studieren. Mit zunehmendem mechanistischen Verständnis des Ensembletransports sind die in Experimenten verwendeten DNA-Origami-Strukturen immer komplexer geworden. Grundsätzlich könnte jede Struktur für diesen Zweck angepasst werden, sofern sie so geändert wird, dass sie einsträngige DNA-Anhaftungsstellen für Motoren und Fluorophore umfasst. Spezifische Chassis-Designs und Attribute können nützlich sein, um bestimmte Fragen über das auftauchende Verhalten von Motoren-Ensembles zu untersuchen. Zum Beispiel wurden starre Stäbe verwendet, um grundlegende Kenntnisse darüber zu entwickeln, wie die Kopiernummer den Transport von Teams von Dyneins und Kinesinen beeinflusst7,15,18und 2D-Plattformen wurden verwendet, um Myosin-Ensemble zu studieren Navigation von actin-Netzwerken22. Strukturen mit variabler oder abstimmbarer Flexibilität wurden verwendet, um die Rollen der elastischen Kopplung zwischen Motoren zu verstehen und zu untersuchen, wie sich die Schrittsynchronisierung auf die Beweglichkeit8,24auswirkt. In jüngerer Zeit werden sphärische Strukturen verwendet, um Einen Einblick in die Auswirkungen geometrischer Abhängigkeiten auf die Motor-Track-Bindung auf die Dynamik der Beweglichkeit25zu gewinnen.
In diesem Protokoll bieten wir spezifische Schritte für Ensembleexperimente an segmentierten Chassis mit variabler Steifigkeit an. Bindungsstellen auf dem Chassis werden manchmal als "Griffe" bezeichnet, während ergänzende DNA-Sequenzen, die diese Griffe binden, als "Antihandles" bezeichnet werden. Die Anzahl der Motoren auf diesen Chassis wird bestimmt, welche Segmente verlängerte Griffklammern mit Komplementarität zum Antihandle-Oligo auf den Oligo-markierten Motoren enthalten. Die Verwendung unterschiedlicher Griffsequenzen auf verschiedenen Segmenten ermöglicht die Bindung verschiedener Motorentypen an bestimmte Stellen auf dem Chassis. Das hier beschriebene Chassis besteht aus 7 aufeinanderfolgenden starren Segmenten, die jeweils aus 12 doppelsträngigen DNA-Helices bestehen, die in 2 konzentrischen Ringen8angeordnet sind. Die starren Segmente enthalten die Motorgriffe und sind durch Regionen verbunden, die entweder flexible einsträngige DNA oder starre doppelsträngige DNA sein können, je nach Abwesenheit bzw. Vorhandensein von "Linker"-Heftklammern. Die Übereinstimmung der Fahrwerksstruktur wird somit durch das Vorhandensein oder Fehlen dieser "Linker"-Heftklammern bestimmt. Weitere Informationen und spezifische DNA-Sequenzen finden Sie in früheren Berichten8. Darüber hinaus können mehrere Methoden verwendet werden, um Chassis26zu reinigen. Hier wird die rate-zonale Glyzeringradientenzentrifugationsmethode27 beschrieben.

<table><tbody><tr><td>2 mL Rundbodenröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Mit Biotin markiertes Tubulinprotein: Schweinegehirn, >99% rein</td><td>Cytoskeleton.com</td><td>T333P-A</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-BSA</td><td>Sigma</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Flaschenbaugruppe, Polycarbonat, 250 mL, 62 x 120 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>356013</td><td></td></tr><tr><td>Flasche, mit Verschlussbaugruppe, Polycarbonat, 10,4 mL, 16 x 76 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>355603</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalfiltereinheit</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>17096901</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Spin Chromatographie-Säulen, leer</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204EDU</td><td></td></tr><tr><td>P8064 Gerüst</td><td>Tilibit</td><td>2 mL bei 400 nM</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Chromatographie-Säulen</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>ProTev Protease</td><td>Promega</td><td>V6101</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Doppelseitiges Klebeband mit Spender</td><td>amazon.com</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-500 HR</td><td>GE Healthcare</td><td>17061310</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>434302</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA-Färbung</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulinprotein (>99 % rein): Schweinehirn</td><td>Cytoskeleton.com</td><td>T240-B</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin, HiLyte 647</td><td>Cytoskeleton.com</td><td>TL670M-A</td><td></td></tr><tr><td>ultraklare Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>344090</td><td></td></tr></tbody></table>

produktion von dynein und kinesin motor ensembles auf dna origami nanostrukturen für die einzelmolekülbeobachtung

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Zytoskelettmotoren sind verantwortlich für eine Vielzahl von Funktionen in eukaryotischen Zellen, einschließlich Mitose, Frachttransport, Zellbewegung und andere. Viele dieser Funktionen erfordern Motoren, um in Ensembles zu arbeiten. Trotz einer Fülle von Kenntnissen über die Mechanismen einzelner Zytoskelettmotoren ist vergleichsweise weniger über die Mechanismen und das aufkommende Verhalten von Motorensembles bekannt, deren Beispiele Veränderungen der Ensemble-Prozessivität und -geschwindigkeit mit Motornummer, Standort und Konfiguration ändern. Die strukturelle DNA-Nanotechnologie und die spezifische Technik des DNA-Origami ermöglichen die molekulare Konstruktion klar definierter Architekturen von Motorensembles. Die Form der Ladungsstrukturen sowie die Art, Anzahl und Platzierung der Motoren auf der Struktur können alle gesteuert werden. Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Herstellung dieser Ensembles und deren Beobachtung mittels totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Verfügung. Obwohl diese Techniken speziell für Zytoskelettmotoren angewendet wurden, sind die Methoden auf andere Proteine verallgemeinert, die sich in Komplexen zusammensetzen, um ihre Aufgaben zu erfüllen. Insgesamt bietet die DNA-Origami-Methode zur Schaffung klar definierter Ensembles von motorischen Proteinen ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Mechanismen zu sezieren, die zu auftauchendem motilen Verhalten führen.

Erfolgreiche Reinigungen von Motoren und Fahrwerksstrukturen wurden durch Gelelektrophorese geprüft. Die SDS-PAGE-Analyse bestätigte die erfolgreiche Extraktion von Farbstoff aus Hefe (Abbildung 2), da das in Schritt 2.3.7 gesammelte Endfiltrat ein klares, scharfes Band an der Position von 350 kDa zeigte. Wie erwartet, fehlte dieses Dynein-Band in der Durchfluss- und Waschung, die unerwünschte Proteine entfernte, und den Perlen, von denen Dynein spaltete. Die...

Ziel dieses Protokolls ist es, Ensembles molekularer Motoren auf DNA-Origami-Nanostrukturen zu bilden und die Ensemblemotilität mittels totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie zu beobachten.

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Unser Protokoll ist darauf ausgelegt, die biophysikalischen Mechanismen für den Transport von Fracht durch Teams identischer oder entgegengesetzter zytoskelettaler motorischer Proteine zu untersuchen. Durch die Verwendung von DNA-Origami für die molekulare Konstruktion kann diese Methode für die Art, Anzahl und Position von Motoren auf genau definierten Ladungsformen wählen. Während sich dieses Protokoll auf die mikrotubulierbasierten Motoren Dynein und Kinesin konzentriert, ist es anpassungsfähig an das aktinbasierte Motormyosin sowie auf andere Proteinsysteme, die kooperativ funktionieren.Ein herausfordernder Aspekt dieses Protokolls ist die Aufrechterhaltung der Integrität und Aktivität der motorischen Proteine während des gesamten Reinigungsprozesses, da sie empfindlich auf Hitze und mechanische Kraft reagieren. Um das motorische Proteinwachstum und die Expression über Galaktose-Promotor zu induzieren, verwenden Sie einen sterilen Impfstab, um den gefrorenen Hefestamm von Interesse auf einer Hefe-Pepton-Dextrose-Kulturplatte für eine drei- bis viertägige Inkubation bei 30 Grad Celsius zu streifen. Am vierten Tag der Kultur, wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern zwischen 1

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video beschreibt eine Methode, um die Assemblierung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Molekülen an bestimmten Loci mit Hilfe von Einzelmolekül-Bildgebung zu visualisieren. Diese Kondensate werden durch LCD-LCD- und LCD-DBD-Wechselwirkungen gebildet, die die Rekrutierung von RNA-Polymerase II und eine verbesserte Gentranskription ermöglichen.

Einzelmolekül-Bildgebung zur Visualisierung der Ansammlung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Vorhängen

DNA-Origami ist eine leistungsfähige Methode zur Herstellung nanoskaliger Objekte präzise durch die Programmierung der Selbstorganisation von DNA-Molekülen. Hier beschreiben wir, wie DNA-Origami genutzt werden, um einen Roboter Roboter erfassen kann biologische Signale und reagiert durch Shape Shifting, anschließend auf eine gewünschte Wirkung weitergeleitet zu entwerfen.

Entwerfen einer Bio-responsive Robot von DNA Origami

DNA-Origami ist eine leistungsfähige Methode zur Herstellung präziser nanoskaliger Objekte durch Programmierung der Selbstorganisation von DNA-Molekülen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Faltung eines bioresponsiven Roboters aus DNA-Origami, seine Aufreinigung und Negativfärbung für die transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung (TEM).

Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

Wir beschreiben das ausführliche Protokoll für Konstruktion, Simulation, nass-Laborversuche und Analyse für eine rekonfigurierbare DNA Akkordeon Rack 6 mal 6 Maschen.

Design und Synthese eines rekonfigurierbaren DNA-Akkordeon-Racks

Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für T4 Ligatur und Geruchsstoffen Seite Reinigung der kleine kreisförmige DNA-Moleküle, Glühen und native Seitenanalyse der kreisförmigen Platten, Montage und AFM Imaging von 1D und 2D DNA Nanostrukturen sowie Agarose-gel Elektrophorese und Zentrifugation Reinigung des endlichen DNA Nanostrukturen.

Stabile DNA-Motive, 1D und 2D Nanostrukturen aus kleinen kreisförmigen DNA-Moleküle gebaut

Wir präsentieren ein Protokoll zur molekularen Shuttles zu bauen wo treiben Motorproteine Kinesin Oberfläche eingehalten Farbstoff-markierten Mikrotubuli. Schwachen Wechselwirkungen die Kinesine mit der Oberfläche ermöglicht ihre reversible Bindung. Dadurch entsteht ein Nano-System das dynamische Montage und Demontage der Komponenten unter Beibehaltung seiner Funktionalität aufweist.

Montage von molekularen Shuttles Powered by reversibel befestigt Kinesine

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erstellung diskreter und genauer anorganischer Nanostrukturen auf Substraten, die DNA-Origami-Formen als Leitmotive verwenden. Die Methode wird durch die Erstellung von plasmonischen Gold-Bowtie-förmigen Antennen auf einem transparenten Substrat (Saphir) demonstriert.

DNA Origami-vermittelte Substrat Nanomusterung von anorganischen Strukturen für Sensoranwendungen

Das bidirektionale mitotische Kinesin-5 Cin8 sammelt sich in Clustern an, die sich während ihrer Motilität teilen und verschmelzen. Die Akkumulation in Clustern verändert auch die Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit von Cin8. Hier wird ein Protokoll für Motilitätsassays mit gereinigtem Cin8-GFP und die Analyse der beweglichen Eigenschaften einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 beschrieben.

Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Rekonstitution von Mikrotubulibündeln in vitro und zur direkten Quantifizierung der in ihnen ausgeübten Kräfte durch simultanes optisches Einfangen und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Dieser Assay ermöglicht die Messung der Kräfte und Verschiebungen, die von Proteinensembles in aktiven Mikrotubuli-Netzwerken erzeugt werden, auf Nanoskala-Ebene.

Direkte Messung von Kräften innerhalb rekonstituierter aktiver Mikrotubulibündel

Diese Studie beschreibt die Reinigung von KIF1A (1-393LZ), einem Mitglied der Kinesin-3-Familie, unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Expressionssystems. Die In-vitro-Einzelmolekül - und Multimotor-Gleitanalyse dieser gereinigten Motoren zeigte robuste Motilitätseigenschaften, die mit Motoren aus Säugetierzelllysat vergleichbar sind. Somit ist das Sf9-Baculovirus-System in der Lage, Motorprotein von Interesse zu exprimieren und zu reinigen.

Einzelmolekülanalyse von Sf9-gereinigten superprozessiven Motoren der Kinesin-3-Familie

Erfahren Sie die Herstellung von Dynein- und Kinesin-Motorensembles auf DNA-Origami-Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung. Diese Methode ermöglicht präzise Studien zu kooperativen Transportmechanismen motorischer Proteine.

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

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