Name: Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden aus epithelialen und stromalen Zellen. Diese Methode ermöglicht physiologische Studien zu hormonellen Reaktionen und Krankheitsmechanismen außerhalb des Körpers.

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Diese Studie wurde vom NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) und dem Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK) finanziert. Wir möchten die Northwestern Pathology Core Facility für die Verarbeitung der festen Organoide für paraffinige Einbettung würdigen. Wir möchten das gesamte UG3-Team einschließlich der Labore Woodruff, Burdette und Urbanek für die aufschlussreichen Diskussionen und Kooperationen würdigen.

Endometriale Proben wurden von prämenopausalen Frauen gesammelt, die sich einer routinemäßigen Hysterektomie für gutartige Gebärmuttererkrankungen im Northwestern University Prentice Women es Hospital unterziehen, gemäß einem vom Institutional Review Board genehmigten Protokoll. Die schriftliche Zustimmung wurde von allen Frauen eingeholt, die in die Studie einbezogen wurden.
1. Herstellung von Agarose-Formen
<ol><li>Vor Beginn der Zellisolierung 1,5% Agarose-Mikroformen(Materialtabelle) gießen und ausdemieren, um die Organoide gemäß den Anweisungen des Herstellers zu beherbergen.</li>
</ol>2. Erzeugung von Endometrium-Organoiden
<ol><li>Ernte primäre stromal- und epitheliale Zellen
	<ol>
<li>In einem Biosicherheitsschrank mit aseptischer Technik Enzymlösung (2,5 mg/ml Kollagenase Typ I + 0,1 mg/ml DNase I in 10 ml Dispase [500 Einheiten]) bei 37 °C vorbereiten und die Lösung mit einem 0,2 m-Spritzenfilter in ein 15 ml konisches Rohr steril filtern.</li>
		<li>In einem Biosicherheitsschrank mit aseptischer Technik Endometrium aus den Gebärmutterbiopsien abkratzen und Gewebe unter der Haube in sehr kleine Stücke mit einem Skalpell zerkleinern. HINWEIS: Endometriumgewebe, das mindestens 20 mm x 10 mm x 1 mm beträgt, ist erforderlich, um eine ausreichende Anzahl von Organoiden zu erzeugen.</li>
		<li>In einer 15 ml konischen Röhre frisch gehacktes Gewebe in die Enzymlösung geben. Schließen Sie die Kappe und wickeln Sie die Oberseite mit einem Wachsfilm (Materialtabelle), um eine Kontamination zu verhindern.</li>
		<li>Das Rohr mit Gewebe in ein Wasserbad oder einen Inkubator bei 37 °C 30 min mit sanftem Schütteln (80 bis 100 U/min) geben.</li>
		<li>Stapeln Sie ein 100-m-Zellsieb auf einem 20-m-Zellsieb auf einem 50 ml konischen Röhrchen. Filtern Sie die Lösung durch die beiden Siebe und spülen Sie dann das 15 ml konische Rohr mit 10 ml der ausgewogenen Salzlösung von Hank (HBSS; Materialtabelle) und legen Sie die Wäsche durch das Sieb, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt werden. HINWEIS: Die Durchflussflüssigkeit enthält Stromalzellen und rote Blutkörperchen (insgesamt ca. 20 ml). Epithelzellen werden auf dem 20-m-Sieb gesammelt. Brocken unverdautes Gewebe verbleiben auf dem 100 m Sieb. Entsorgen Sie unverdautes Gewebe in einen Biorisiko-Abfallbehälter.</li>
		<li>Invertieren Sie das 20 m Zellsieb von Schritt 2.1.5 auf ein neues 50 ml konisches Rohr und waschen Sie die Epithelzellen vom Sieb mit 20 ml organoiden Medien (Materialtabelle) ergänzt mit 1% Stift/Strep.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die konischen Rohre aus den Schritten 2.1.5 und 2.1.6 bei 500 x g für 5 min.</li>
		<li>Mit den gesammelten Stromalzellen den Überstand entfernen und das Pellet mit 10 ml roter Blutzelllysepuffer wieder aufhängen.  Bei 37 °C für 10 bis 15 min inkubieren. Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 500 x g für 5 min, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 200 bis 300 l Organoidmedien wieder auf (weitere Anweisungen siehe Schritt 2.2.2).</li>
		<li>Entfernen Sie mit den gesammelten Epithelzellen den Überstand und setzen Sie ihn mit 100 l Organoidmedien erneut aus (weitere Anweisungen finden Sie unter Schritt 2.2.2).</li>
	</ol></li>
	<li>Säzellen
	<ol>
<li>Nach dem Ausgleich der 1,5% Agarose-Formen in Brunnen (1 Form pro Brunnen) einer 24-Well-Platte, entfernen Sie organoide Medien an der Außenseite der Agarose-Formen und kippen Sie die Gewebekulturplatte, so dass das Medium aus der Zellsäkammer der Agarose-Gerichte auch sorgfältig entfernt werden.</li>
		<li>Sehen Sie epitheliale (ab Schritt 2.1.9) und stromale (ab Schritt 2.1.8) Zellsuspensionen unter dem Mikroskop.  Fügen Sie entweder den epithelialen oder stromalen Zellsuspensionen jeweils mehr organoide Medien hinzu, so dass die Suspensionen in etwa gleich dicht sind. HINWEIS: Epithelzellen verklumpen zusammen, und es ist nicht ratsam, Epithelzellen in einzelzellige Suspensionen zu verdauen/trypsinisieren.</li>
		<li>Kombinieren Sie 1 Teil der Stromalzellen mit 3 Teilen der Epithelzellen nach Volumen.</li>
		<li>Pipette 50 l (60.000 Zellen) der kombinierten Zellsuspension in die Zellsaatkammer der Agaroseform.</li>
		<li>Sobald die Agarose-Formen mit Zellen gefüllt sind, fügen Sie vorsichtig 400 l frische organoide Medien in den Brunnen der 24-Well-Platte. HINWEIS: Das Medium reicht knapp unter der Oberfläche der Agarose-Gerichte und lässt die Zellen nicht aus den Formen schweben. Nach 2 bis 3 Tagen setzen sich die Zellen ab und beginnen, Organoide zu bilden.</li>
		<li>Wechseln Medium jeden zweiten Tag mit 500 L Organoid-Medien.</li>
		<li>Nach 2-3 Tagen, ändern Medium zu einem, das mit 0,1 nM Estradiol (E) und 0,8 nM Testosteron (T) ergänzt wird, um die Organisation von Epithel- und Stromalzellen zu fördern. HINWEIS: Obwohl die Organisation von Epithel- und Stromalzellen mit oder ohne Hormone auftreten kann, organisieren sich mehr Organoide in Gegenwart von Hormonen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ernte von Endometrium-Organoiden für Experimente
HINWEIS: Nach Abschluss des Experiments können Endometrium-Organoide für die Histologie oder RNA-Analyse verarbeitet werden. Die folgenden Schritte beschreiben, wie die Organoide verarbeitet werden.
<ol><li>
Histologie
	<ol>
<li>1,5% Agarose in phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) durch Kochen auflösen. Lassen Sie die flüssige Agarose auf ca. 50 °C abkühlen.</li>
		<li>Kippen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die 24-Well-Platte und pipetten Sie das Medium vorsichtig von der Außenseite der Agaroseform heraus. Das Medium vorsichtig aus dem Inneren der Agaroseform herauszupfeifen, um eine Störung der Organoide zu vermeiden.</li>
		<li>Unter einem Sezieren mikroskop, sorgfältig Pipette 70-75 l warm (50 °C) 1,5% Agarose in die Kammer der Agaroseschale. Achten Sie darauf, die Organoide nicht zu stören.</li>
		<li>Bei 4 °C 5 min abkühlen lassen.</li>
		<li>4% Paraformaldehyd (PFA) in jeden Brunnen der 24 Brunnenplatte geben und die gesamte versiegelte Agaroseform mit Organoiden über Nacht bei 4 °C fixieren. Dann in 70% Ethanol bei 4 °C lagern, bis sie für die Paraffineinbettung bereit sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA-Isolierung
	<ol>
<li>Kippen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die 24-Well-Platte und pipetten Sie vorsichtig das Medium aus der Kammer der Agaroseform heraus.</li>
		<li>Kraftvoll Pipette 1 ml frisches organoides Medium direkt in die Agaroseform, so dass die Organoide aus den Mikrobrunnen gespült werden. Achten Sie darauf, nicht zu viele Blasen zu erstellen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Pipettenz erneut mit dem gleichen Medium aus Schritt 3.2.2.</li>
		<li>Sammeln Sie alle Mediums, das die Organoide enthält. Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit, um die Organoide zu sammeln und zur RNA-Extraktion überzugehen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidualization+of+the+human+endometrium%3A+mechanisms%2C+functions%2C+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li>
<li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progesterone+receptor+regulates+implantation%2C+decidualization%2C+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li>
<li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+action+in+endometrial+cancer%2C+endometriosis%2C+uterine+fibroids%2C+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li>
<li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS%2FMS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir haben menschliche Endometrium-Organoide erzeugt, die aus epitheliaalen und stromalen Zellen des Endometriums bestehen, ohne die Verwendung von exogenen Gerüstmaterialien. Während bereits gezeigt wurde, dass primäre endometriale Epithelzellen Organoide bilden können6,7, wurden diese Zellen in eine gelatineartige Matrix von Proteinen eingebettet, die von Maussarkomzellen abgesondert wurden (siehe Tabelle der Materialien), um sphäroidartige Stru...

Das menschliche Endometrium säumt die Gebärmutterhöhle und dient als erster Kontakt für den Embryo während der Implantation. Das Endometrium besteht aus luminalen und drüsen Epithelzellen, unterstützenden stromalen Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen. Zusammen bilden diese Zelltypen das Endometriumgewebe, das eines der reaktionsschnellsten Gewebe für Sexualsteroidhormoneist 1. Die Veränderungen, die während jedes Menstruationszyklus auftreten, sind auffallend. Ein angemessenes Wachstum und eine Umgestaltung des Endometriums ist erforderlich, damit eine Embryoimplantation möglich ist. Eine aberrante Reaktion auf Östrogen und Progesteron kann zu einem feuerfesten Endometrium führen, das keine erfolgreiche Etablierung einer Schwangerschaft zulässt und sogar zu Krankheiten wie endometriener Neoplasie führen kann.
Um die Hormonreaktionen und wesentlichen Veränderungen im Endometrium zu untersuchen, wurden Zellen aus Endometriumgeweben, die von Patienten während der Operation oder der Endometriumbiopsie entnommen wurden, in der Zellkultur vermehrt. Endometrium-Stromalzellen vermehren sich bevorzugt und vermehren sich leicht, und der durch Progesteron induzierte Differenzierungsprozess kann in vitro rekapituliert werden. Als Ergebnis wurde während dieses Differenzierungsprozesses viel gelernt, die so genannten Dezidualisierung2,3. Der andere große Zelltyp im Endometrium, die luminalen und drüsigen Epithelzellen, wachsen jedoch nicht gut als traditionelle Monolayer, verlieren Polarität, werden seneszierend und haben ein begrenztes proliferatives Potenzial. Infolgedessen ist weniger über ihre Biologie und ihre Rolle im menschlichen Endometrium bekannt. Da viele Neoplasie aus den Epithelzellen stammen, müssen Mechanismen, die mit Hyperplasie oder Transformation in Krebszellen verbunden sind, noch vollständig definiert werden. Darüber hinaus haben Studien festgestellt, dass die Hormonreaktion die intimen parakrinen Aktionen zwischen den epitheliaalen und stromalen Zellen des Endometriums4,5umfasst.
Kürzlich wurde eine dreidimensionale (3D) Organoidkultur von endometriellen Epithelzellen von zwei unabhängigen Gruppen6,7, die erste Berichte über Organoide aus Endometriumgewebe sind. Diese Organoide bestanden aus endometrialen Epithelzellen, die in eine Proteinmatrix (Tabelle der Materialien)eingebettet waren, und enthielten kein wichtiges hormonell reaktionsfähiges Fach des Endometriums, die stromalen Fibroblasten. Da die Matrixproteine von Los zu Los variieren und Signalwege auslösen können, die nicht unbedingt im Gewebe vorkommen, wäre es ideal, die Matrixproteine durch Komponenten des Endometriums zu ersetzen. In der aktuellen Studie wird ein Protokoll zur Erzeugung von gerüstfreien menschlichen Endometriumorganoiden epitheliale und stromalen Zellen des menschlichen Endometriums vorgestellt. Das Vorhandensein von Stromalzellen bietet nicht nur die Unterstützung für Epithelzellen, sondern auch die notwendigen parakrinen Aktionen, die für die Endometriumhormonreaktion4,8,9 wichtig sein sollen. .
Das neue multizelluläre Endometriumorganoid bietet ein Modellsystem des Endometriums, das einfach zu erzeugen ist und sowohl epitheliale als auch stromale Zellen umfasst. Diese Organoide können verwendet werden, um langfristige hormonelle Veränderungen und frühe Ereignisse von Krankheiten wie Tumorigenese aufgrund von hormonellen Ungleichgewicht oder exogene Beleidigungen zu studieren. Die Komplexität dieser Organoide könnte schließlich auf andere Zelltypen erweitert werden, einschließlich endotheliale und Immunzellen mit möglicherweise myometrialen Zellen, um die Physiologie des menschlichen Gewebes wirklich nachzuahmen.

<table><tbody><tr><td>Agarose HS, Molekularbiologie</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Agarose-Formen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z764043</td><td>(https://www.microtissues.com/)</td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid (NH4Cl)</td><td>Amresco</td><td>0621</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ II, Pulver</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Corning</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Stain</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Östrogenrezeptor (SP1), monoklonaler Kaninchen-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9101-S</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield mit DAPI, Eindeckmedium für die Histologie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1x ohne Calcium, Magnesium und Phenolrot</td></tr><tr><td>Hämatoxylin-Fleckenlösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3530-32</td><td>Modifizierte Harris-Formulierung, quecksilberfreie</td></tr><tr><td>Heparinlösung</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07980</td><td>zu MammoCult media</td></tr><tr><td>hinzugefügt Hydrocortison-Stammlösung</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07925</td><td>zu MammoCult media</td></tr><tr><td>hinzugefügt Organoide Medien - Mammocult</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05620</td><td>ergänzt mit 2 & micro; L/mL Heparin und 5 & micro; L/mL Hydrocortison</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 16%ige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Progesteronrezeptor, PgR 1294, unkonjugiert, Kulturüberstand</td><td>Agilent Technologies</td><td>M356801-2</td><td></td></tr><tr><td>Proteinmatrix - Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigter Maus-Anti-E-Cadherin-Antikörper</td><td>BD Biociences</td><td>610181</td><td>Clone 36</td></tr><tr><td>Rekombinanter Anti-Vimentin-Antikörper [EPR3776]</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Lyse- und Isolationskit</td><td>Zymo Research</td><td>R2060</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Testosteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86500</td><td></td></tr><tr><td>Trichrome Stain</td><td>Abcam</td><td>ab150686</td><td></td></tr><tr><td>Wachsfilm - Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung von mehrzelligen humanen primären endometrium-organoiden

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Das menschliche Endometrium ist eines der hormonell ansprechbarsten Gewebe im Körper und ist für die Etablierung einer Schwangerschaft unerlässlich. Dieses Gewebe kann auch krank werden und Morbidität und sogar Tod verursachen. Modellsysteme zur Untersuchung der Humanendometriumbiologie sind auf In-vitro-Kultursysteme einzelner Zelltypen beschränkt. Darüber hinaus vermehren sich die Epithelzellen, eine der wichtigsten Zelltypen des Endometriums, nicht gut oder behalten ihre physiologischen Merkmale in der Kultur, und so bleibt unser Verständnis der Endometriumbiologie begrenzt. Wir haben zum ersten Mal Endometrium-Organoide erzeugt, die sowohl epitheliale als auch stromale Zellen des menschlichen Endometriums bestehen. Diese Organoide benötigen keine exogenen Gerüstmaterialien und organisieren sich gezielt so, dass Epithelzellen die sphäroidartige Struktur umfassen und mit Stromalzellen in der Mitte polarisieren, die Kollagen produzieren und absondern. Östrogen, Progesteron und Androgen-Rezeptoren werden in den epitheliaalen und stromalen Zellen exprimiert und Die Behandlung mit physiologischen Niveaus von Östrogen und Testosteron fördern die Organisation der Organoide. Dieses neue Modellsystem kann verwendet werden, um normale Endometriumbiologie und Krankheiten auf eine Weise zu studieren, die vorher nicht möglich war.

Ein Schaltplan des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt. Uterusgewebe wurde aus der Operation gewonnen, nachdem es von Pathologen untersucht wurde. Die Endometriumschleimhaut wurde durch Abkratzen vom Myometrium getrennt und das Endometriumgewebe enzymatisch zu den Zellen verdaut, wie im Protokoll beschrieben. Epithel- und Stromalzellen wurden in den Agaroseformen in Mikrobrunnen zugegeben. Nach 7 Tagen in der Kultur wurden Organoide mit E und T für weitere 7 bis 14 Tage behandelt.
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Ein Protokoll zur Erzeugung menschlicher primärer Endometrium-Organoide, die aus epithelialer und stromaler Zellen bestehen und Eigenschaften des nativen Endometriumgewebes beibehalten, wird vorgestellt. Dieses Protokoll beschreibt Methoden von der Erfassung des Gebärmuttergewebes bis zur histologischen Verarbeitung von Endometriumorganoiden.

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Das Endometrium ist ein Gewebe, das sich jeden Monat als Reaktion auf Hormone ändert. Hormonungleichgewicht kann die Anhaftung von Embryonen verhindern und auch Krankheiten wie Krebs verursachen. Unser Protokoll baut das Endometrium wieder auf, so dass es außerhalb des Körpers der Frau auf physiologische Weise untersucht werden kann.Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es eine 3D-Struktur von Zellen bietet, die aus zwei hormonell reagierenden Zelltypen bestehen, den epitheliaalen und stroma Zellen, die sich spezifisch organisieren und verhalten, wie sie es im Körper tun. Da die Organoide das Gewebeverhalten besser imitieren können, können sie schließlich verwendet werden, um verschiedene Medikamente zu testen. Die endometrialen Organoide können verwendet werden, um direkte Auswirkungen der derzeit bekannten Risikofaktoren für Krebs zu untersuchen, einschließlich Fettleibigkeit und polyzystischem Ovarialsyndrom.Unsere Organoide betonen die Bedeutung parakriner Aktionen zwischen zwei Zelltypen. Es ist wichtig, mit einer ausreichenden Menge an Gewebe zu beginnen. Es kann schwierig sein, die richtige Dichte von Epithel- und Stromalzellen zu erhalten.Auch die Organoide sind recht klein und können mit IHC-Färbung schwer zu visualisieren sein. Die Visualisierung dieses Verfahrens ist wichtig, da es einige Schritte gibt, die nach dem Sehen viel leichter zu verstehen sind. Dazu gehören immer die richtige Gewebeschicht der Gebärmutter, immer die richtige Dichte der Zellen zu kombinieren, und Saat der Agarose Formen.Vor Beginn der Zellisolierung 1,5% Agarose-Mikroformen nach den Anweisungen des Herstellers zur Unterbringung der Organoide gießen und ausdemieren. Verwenden Sie in einem Biosicherheitsschrank aseptische Techniken, um eine Enzymlösung bei 37 Grad Celsius herzustellen und die Lösung mit einem 0,2-Mikrometer-Spritzenfilter mit einem 0,2-Mikrometer-Spritzenfilter in ein 15-Milliliter-Konusrohr zu filtern. Mit einem Skalpell Endometrium aus den Gebärmutterbiopsien abkratzen und das Gewebe in sehr kleine Stücke zerkleinern.Legen Sie das frisch gehackte Gewebe in die 15-Milliliter-Konustube, die die Enzymlösung enthält. Schließen Sie die Kappe und wickeln Sie die Oberseite des Rohres mit einem Wachsfilm, um eine Kontamination zu verhindern. Legen Sie die Röhre 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit sanftem Schütteln in ein Wasserbad oder einen Inkubator.Danach stapeln Sie ein 100-Mikron-Zellsieb auf einem 20-Mikrometer-Zellsieb auf einem 50-Milliliter-Konustube. Filtern Sie die Lösung durch die beiden Siebe. Spülen Sie das 15-Milliliter-Konische Rohr mit HBSS und legen Sie diese Wäsche durch das Sieb, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt werden.Dann invertieren Sie das 20-Mikron-Zellsieb auf ein neues 50-Milliliter-Konikonrohr und waschen Sie die Epithelzellen vom Sieb mit 20 Milliliterorganoiden Medien, ergänzt mit 1%Penicillin und Streptomycin. Zentrifugieren Sie die konischen Rohre bei 500 G für fünf Minuten. Für die gesammelten Stromalzellen den Überstand entfernen und das Pellet in 10 Millilitern roter Blutkörperchenlysepuffer wieder aufsetzen.Bei 37 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten inkubieren. Zentrifugieren Sie diese Zellen bei 500 G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 200 bis 300 Mikroliterorganoidmedien wieder auf.Für gesammelte Epithelzellen, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter organoiden Medien aus. Nachdem die 1,5%agarose Formen ausgeglichen sind, entfernen Sie die Organoidmedien an der Außenseite der Agaroseformen und neigen Sie die Gewebekulturplatte, so dass auch das Medium aus der Zellsäkammer der Agarose-Gerichte vorsichtig entfernt werden kann. Sehen Sie sich die epithelialen und stromalen Zellsuspensionen unter dem Mikroskop an und fügen Sie den Suspensionen weitere organoide Medien hinzu, sodass Sie nur 100 Mikroliter gleichzeitig hinzufügen, sodass die Suspension in etwa gleich dicht ist.Kombinieren Sie dann einen Teil der Stromalzellen mit drei Teilen der Epithelzellen nach Volumen. Pipette 50 Mikroliter der kombinierten Zellsuspension in die Zellsäkammer der Agaroseform. Sobald die Agarose-Formen mit Zellen gefüllt sind, fügen Sie vorsichtig 400 Mikroliter frische organoide Medien in die Brunnen der 24-Well-Platte.Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, um sicherzustellen, dass das Medium jeden zweiten Tag mit 500 Mikroliter organoiden Medien zu ändern. Nach sieben Tagen, ändern Sie das Medium in ein, das mit 0,1 Nanomolar Estradiol und 0,8 Nanomolar Testosteron ergänzt wird, um die Organisation der Epithel- und Stromalzellen zu fördern. Lösen Sie zunächst 1,5% Agarose in PBS durch Kochen auf.Die flüssige Agarose in ein Becherglas mit heißem Wasser geben und auf ca. 50 Grad Celsius abkühlen lassen. Kippen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die 24-Well-Platte und pipetten Sie das Medium vorsichtig von der Außenseite der Agaroseform heraus. Dann pipette sorgfältig das Medium aus dem Inneren der Agarose Schimmel, um zu vermeiden, stören die Organoide.Zwischen 70 und 75 Mikroliter warme, 1,5%Agarose vorsichtig in die Kammer der Agaroseschale geben, wobei darauf zu achten ist, die Organoide nicht zu stören. Lassen Sie die Platte bei vier Grad Celsius für fünf Minuten abkühlen. Danach 4% Paraformaldehyd in jeden Brunnen der 24-Well-Platte geben und die gesamte versiegelte Agaroseform über Nacht bei vier Grad Celsius fixieren.Am nächsten Tag lagern Sie die Platte in 70% Ethanol bei vier Grad Celsius, bis sie für die Paraffineinbettung bereit ist. Um mit der RNA-Isolation zu beginnen, sehen Sie sich die Platte unter einem Sezierendes Mikroskop an. Kippen Sie die Platte und pipette vorsichtig aus dem Medium aus der Kammer der Agarose Schimmel.Kraftvoll pipette einen Milliliter frisches organoides Medium direkt in die Agarose-Form, so dass die Organoide aus den Mikrobrunnen gespült werden, wobei darauf achten, nicht zu viele Blasen zu erzeugen. Wiederholen Sie diesen kraftvollen Pipettiervorgang, sobald Sie dasselbe Medium verwenden. Danach sammeln Sie das gesamte Medium, das die Organoide enthält.Zentrifuge bei 500 G, um die Organoide zu sammeln, und gehen Sie zur RNA-Extraktion. In dieser Studie werden menschliche Endometrium-Organoide, die aus epitheliaalen und stromalen Zellen des Endometriums bestehen, ohne die Verwendung von exogenen Gerüstmaterialien erzeugt. Für die histologische Verarbeitung werden die Agaroseformen, die die Endometrium-Organoide enthalten, mit Agarose versiegelt, gefolgt von einer Fixierung mit 4% Paraformaldehyd über Nacht.Diese Formen werden für Standard-Paraffin-Einbettungen für Histologie, Immunfluoreszenz oder Immunhistochemie verarbeitet. Das Hämatoxylin in der Eosinfärbung zeigt eine sphäroidartige Struktur mit einer einzigen Zellschicht, die die Außenseite und die Zellen in der Mitte auskundet. Zellspezifische Marker für Endometrium-, Epithel- und Stromalzellen zeigen Epithelzellen, die das Organoid mit Stromalzellen in der Mitte umgeben.Marker der endometrialen Physiologie bestätigen, dass die Endometrium-Organoide bestimmte Eigenschaften des nativen Gewebes beibehalten haben. Die Trichrome-Färbung, die Kollagenblau und Zellen rot färbt, zeigt das Vorhandensein von Kollagen in der Mitte, in der sich Stromalzellen residierten, und demonstriert eine aktive Produktion und Sekretion von Kollagen durch Stromalzellen, die dem nativen Gewebe ähneln. Darüber hinaus zeigt immunhistochemische Färbung das Vorhandensein von Östrogen-Rezeptoren, Androgen-Rezeptoren, und Progesteron-Rezeptoren in den epitheliale und stromalen Zellen.Es ist wichtig, die Zellen dicht zu bedecken, damit wir genügend Organoide für nachgelagerte Experimente haben. Dies wird einige Praxis in Anspruch nehmen. Endometriale Organoide können unter verschiedenen Bedingungen kultiviert und dann für Experimente wie Immunhistochemie oder Immunfluoreszenzfärbung geerntet werden, um die Proteinexpression zu untersuchen, oder für RNA geerntet werden, um die Genexpression zu untersuchen.Unser Labor untersucht, wie das Endometrium auf veränderte Hormonspiegel reagiert, was zu endometriender Hyperplasie und Krebs führen kann. Wir können diese Organoide für langfristige Behandlungen von Hormonen verwenden und pathologische Bedingungen wie überschüssiges Testosteron im polyzystischen Ovarialsyndrom oder Signale von Adipozyten hinzufügen, um Adipositas-induzierte Endometriumveränderungen zu untersuchen. Menschliches Gewebe gilt als biogefährlich, und es wird wichtig sein, geeignete Vorsichtsmaßnahmen zu treffen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die gesamte 3D-Struktur und der zelluläre Gehalt von Organoiden sowie ihre phänotypische Ähnlichkeit mit dem ursprünglichen Gewebe können mit dem hier beschriebenen einzelligen 3D-Bildgebungsprotokoll erfasst werden. Dieses Protokoll kann auf eine breite Palette von Organoiden mit unterschiedlichem Ursprung, Größe und Form angewendet werden.

Single-Cell Resolution Dreidimensionale Bildgebung intakter Organoide

Hier werden vier Methoden zur Erzeugung von Hodenorganoiden aus primären neonatalen murinen Hodenzellzellen beschrieben, d.h. extrazelluläre Matrix (ECM) und ECM-freie 2D- und 3D-Kulturumgebungen. Diese Techniken haben mehrere Forschungsanwendungen und sind besonders nützlich für das Studium der Hodenentwicklung und Physiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Wir präsentieren ein Protokoll zur Entwicklung epithelialer Organoidkulturen ausgehend vom menschlichen Zahn. Die Organoide sind robust expandierbar und rekapitulieren die epithelialen Stammzellen des Zahnes, einschließlich ihrer Ameloblasten-Differenzierungskapazität. Das einzigartige Organoidmodell bietet ein vielversprechendes Werkzeug, um die Biologie der menschlichen Zahnmedizin (Stammzelle) mit Perspektiven für zahnregenerative Ansätze zu untersuchen.

Etablierung von Organoiden aus dem menschlichen Zahn als mächtiges Werkzeug für die mechanistische Forschung und regenerative Therapie

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von Endometrium-Epithel-Organoiden der Maus für die Genexpression und histologische Analysen.

Etablierung von 3D-Endometrium-Organoiden aus der Gebärmutter der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von schnellen und reproduzierbaren endodermalen Leberorganoiden (eHEPOs). Mit diesem Protokoll können eHEPOs innerhalb von 2 Wochen hergestellt werden und langfristig (mehr als 1 Jahr) expandieren, ohne ihre Differenzierung und Funktionalität zu verlieren.

Erzeugung von funktionellen endodermalen Leberorganoiden

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung dreidimensionaler (3D) Gewebeorganoide aus primären humanen Zellen des Oberflächenepithels der Eierstöcke (hOSE). Das Protokoll umfasst die Isolierung von hOSE aus frisch entnommenen Eierstöcken, die zelluläre Expansion des hOSE, Kryokonservierungs- und Auftauverfahren und die Ableitung von Organoiden. Immunfluoreszenz, quantitative Analyse und die Präsentation des Nutzens als Screening-Plattform sind enthalten.

Organoide des menschlichen Oberflächenepithels der Eierstöcke als Plattform zur Untersuchung der Geweberegeneration

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von endometriumen epithelialen Stammzellen (reESCs) von Ratten vor, um endometriale Organoide von Ratten zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht In-vitro-Studien von Endometriumerkrankungen und ermöglicht die Genom-Editierung und andere zelluläre Manipulationen.

Generierung und Charakterisierung von Organoiden der Gebärmutter von Ratten aus endometrialen epithelialen Stammzellen der Ratte

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Etablierung und genetischer Manipulation menschlicher zervikaler Organoide.

Entstehung und genetische Manipulation menschlicher zervikaler Organoide

Dieses Protokoll beschreibt eine definierte, hydrogelbasierte Methode zur Erzeugung menschlicher Brustorganoide, die zentrale Merkmale der Mammarienmorphogenese in einem kontrollierten dreidimensionalen Kultursystem nachbilden.

Eine definierte hydrogelbasierte Methode zur Erzeugung dreidimensionaler menschlicher Brustorganoide, die die Mammarienmorphogenese rekapitulieren

Die Modellierung der menschlichen Gehirnentwicklung wurde aufgrund der beispiellosen Komplexität des neuronalen Epithelgewebes behindert. In dieser Arbeit wird eine Methode zur robusten Generierung von Hirnorganoiden beschrieben, um frühe Ereignisse der menschlichen Gehirnentwicklung abzugrenzen und Mikrozephalie in vitro zu modellieren.

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

Erfahren Sie die Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden aus epithelialen und stromalen Zellen. Diese Methode ermöglicht physiologische Studien zu hormonellen Reaktionen und Krankheitsmechanismen außerhalb des Körpers.

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

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