Name: Ratte Mammary Epithel Cell Transplantation in das interskapulierische weiße Fettpad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Transplantation von Ratten-Mammarepithelzellen in das interskapuläre weiße Fettpolster. Diese etablierte Methode ermöglicht die Untersuchung von Zell-autonomen und Wirtseffekten in der Brustkrebsforschung.

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Diese Arbeit wurde durch den Forschungsfinanzierungsmittel des Hollings Cancer Center es Cancer Center Support P30 CA138313 von den National Institutes of Health (<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">https://www.nih.gov/</a>) und Mittel des Department of Pathology & Laboratory Medicine der Medical University of South Carolina finanziert. Wir danken Marijne Smiths für die Aufzeichnung der Interview-Aussagen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll beschreibt eine Brustepithelzelltransplantationstechnik, die für die Arbeit mit Ratten optimiert ist. Isolierte Epithelorganoide von Spenderratten (3-5 Wochen alt) werden in das interskapulierliche weiße Fettpolster der Empfängerratten (ebenfalls 3-5 Wochen alt) eingepfropft. Die Ergebnisse können nur 4-6 Wochen später interpretiert werden, mit Hilfe der Lichtmikroskopie, um das transplantierte Gewebe zu untersuchen; Allerdings muss vor der Durchführung eines vollständigen Experiments die optimale Zeit z...

Postnatale Brustdrüsenentwicklung und duktale Morphogenese sind Prozesse, die weitgehend durch hormonelle Signalisierung zu Beginn der Pubertät beeinflusst werden. Bei Mäusen und Ratten, häufig verwendeten Modellorganismen der Brustdrüsenbiologie, beginnt dieser Prozess etwa 3 Wochen im Alter, wo eine schnelle Proliferation und Differenzierung zur Bildung des reifen Parenchyms führen. Die reife Brustdrüse kann zahlreiche Expansions- und Involutionrunden durchlaufen, eine Eigenschaft, die seit dem frühen20. Jahrhundert untersucht wird. Im Rahmen der Hyperproliferation und der Krebsentwicklung wurden in den 1950er Jahren1Brustdrüsentransplantationstechniken entwickelt und durch die quantitative Methodik verbessert, die Gould et al. 1977 2,3,4beigesteuert haben. Die Verfeinerung der Transplantationstechnik bei Nagetieren hat zu großen Fortschritten beim Verständnis der normalen Brustdrüsenbiologie beigetragen, die immer noch weit verbreitet sind, um die Wirkung verschiedener Behandlungen und genetischer Manipulationen auf normale Brustdrüsenentwicklung und Krankheitszustände zu untersuchen.
Viele Hypothesen wurden erstellt und anschließend mit Brustdrüsentransplantation getestet, zuerst beschrieben von DeOme et al. 19591. Experimente über mehrere Jahrzehnte zeigten die Neigung des duktalen Gewebes, das aus den Spender-Brustdrüsen entnommen wird, um das gesamte Fettpolster5,6,7 wieder zu bevölkern, und zeigten, dass eine kritische Komponente der Entwicklung der Brustdrüse in diesen epithelialer Strukturen liegt. Spätere Studien an Mäusen zeigten, dass eine einzelne Bruststammzelle ein gelöschtes Fettpolster wieder bevölkern kann und zur Entdeckung eines einzigen, gemeinsamen Vorläufers von Basal- und Luminal-Mammaepithelzellen8,9,10beigetragen hat. Im Einklang mit diesen Schlussfolgerungen, Es wurde vorgeschlagen, dass Transplantation erhöht den Pool von Zellen mit Multilineage-Wiederbevölkerung Potenzial als Folge der Plastizität, so dass die transplantierten Zellen eine funktionelle Brustdrüsewachsen 7,10,11,12,13. Wichtig ist, dass der Einsatz von Transplantationstechniken bei Nagetieren die Grenzen von zellkulturinduzierten Anomalien14 überwindet und oft in nur wenigen Wochen Ergebnisse liefert.
Während das Verfahren ursprünglich im Zusammenhang mit präneoplastischen Läsionen bei Mäusen beschrieben wurde, wurde es bald auf Ratten ausgeweitet und in Verbindung mit der karzinogenen Behandlung verwendet, um die Multiplizität als Maß für die Krebsanfälligkeit zu etablieren15, aber die Popularität von Transplantationstechniken hat die Entwicklung genetischer Werkzeuge für jede Art verfolgt. Obwohl Mausstudien mit Transplantation viele translationale Befunde beigesteuert haben, ähnelt das Parenchym der Rattenbrustdrüse dem Menschen näher16,17 und bietet deutliche Vorteile für die Untersuchung von Östrogenrezeptor-positivem (ER+) Brustkrebs. Brusttumoren sind in beiden Arten induzierbar, unterscheiden sich jedoch in Bezug auf Hormonempfindlichkeit und Genexpressionsprofile. Ein primärer Unterschied ist, dass Rattenbrusttumoren ausdrücken und von der Funktion der Eierstock- und Hypophysenhormonrezeptoren abhängen, nämlich Östrogen und Progesteron (PR), ähnlich dem Luminal-A-Subtyp des menschlichen Brustkrebses. Tatsächlich wurde die Transplantation von Epithelzellen, wie in diesem Protokoll beschrieben, verwendet, um genetische Varianten zu untersuchen, die an Brustkrebs beteiligt sind, und die zelluläre Autonomie der Wirkungen auf Dieepithelzellen18zu bestimmen.
Neben der Tumorbiologie weist das duktale Epithel der normalen Rattenbrustdrüse eine höhere Verzweigung auf und wird von einer dickeren Stromaschicht flankiert als die Maus. Die Bedeutung der Stroma ist in Brustepitheltransplantationsstudien gut dokumentiert. Das Brustepithel muss mit fettem Stroma und idealerweise seinem eigenen Mesenchym interagieren, um seine charakteristische Morphogenese19,20zu durchlaufen. Das Verpflanzen von Gewebe in eine Empfänger-Brustdrüse bietet eine optimale Umgebung; das Vorhandensein von endogenem Epithel kann jedoch die Ergebnisse beeinträchtigen. Die Vorreinigung der Brustdrüse von endogenem Epithel wird häufig in Maustransplantationstests durchgeführt und erfordert eine chirurgische Exzision des endogenen Brustgewebes und/oder die Entfernung der Brustwarze1,21,22. Obwohl möglich, ist die Vorreinigung des Brustepithels bei nach entwöhnenden Ratten nicht so weit verbreitet, vor allem aufgrund der Unwirksamkeit der Räumung des wachsenden Brustbaums bei nach entwöhnenden Ratten. Da gezeigt wurde, dass Regionen von Fettgewebe an anderer Stelle im Körper das Wachstum des transplantierten Brustepithels21,23,24unterstützen könnten, kann der Prozess der Vorräumung bei Ratten leicht vermieden werden, indem Gewebe in das interscapuläre weiße Fettpolster transplantiert wird.
Die in diesem Papier beschriebene Transplantationsmethode beinhaltet die Injektion von enzymatisch dissoziierten Brustdrüsenorganoiden (Fragmente von Brustduktalepithel und anderen Zelltypen, die morphogenestisch geeignet sind) oder monodispergierten Zellen in das interscapuläre Fettpolster in inzucht, isogenen oder kongenen Stämmen von Laborratten2. Da das interskapuläre Fettpolster normalerweise frei von Brustgewebe ist, bietet es eine geeignete Umgebung für mehrere Transplantationsstellen, ohne dass endogenes Epithel vorgeklärt werden muss. Infolgedessen sind die endogenen, abdominalen Bauch-Leisten-Brustdrüsen des Wirtstiers keiner chirurgischen Manipulation ausgesetzt, entwickeln sich normal und können die Interpretation der Ergebnisse nicht beeinträchtigen. Zusätzlich können die intakten Brustdrüsen zum Vergleich verwendet werden, um Wirts- und Spendereffekte auf die Entwicklung des Brustepithels und die Tumorgenese18,25zu bewerten. Obwohl die Repopulation der Brustdrüse aus einer einzigen Stammzelle für Mäuse verfügbar ist, wurde sie noch nicht für Ratten entwickelt, hauptsächlich aufgrund der fehlenden Verfügbarkeit von Antikörpern zur Auswahl für Bruststammzellen der Ratte25,26,27. Trotzdem kann die Transplantation von monodispersen Epithelzellen der Brust zur Quantifizierung des Wiedervolksungspotenzials erfolgreich durchgeführt werden, und diese Zellen entwickeln sich normal, wenn sie in das entsprechende Gerüst eingepfropft werden2,3,4. Während Organoide für viele Zwecke gut sind, sind monodisperse Zellen für quantitative Anwendungen erforderlich, um beispielsweise die Anzahl der Brustepithelzellen zu bestimmen, die für die Krebsinitiierung nach ionisierender Strahlenbehandlung28 oder zum Vergleich der Merkmale der zytometrischen Zytometrie-Epithelzellpopulationen benötigt werden29.
Bis heute ist das hier beschriebene Verfahren die robusteste Methode zur Durchführung von Brustdrüsentransplantationen bei ratten mit dem übergeordneten Ziel, die Entwicklung der Brustdrüse und die Mechanismen, die der Entwicklung von Brustkrebs zugrunde liegen, zu untersuchen. Häufig sind spender- und/oder Empfängertiere vor, während oder nach der Epitheltransplantation unterschiedlichen Variablen ausgesetzt. Beispiele sind einzelne Genstudien mit chemischer Karzinogenese30, Strahlung28,31,32, genetische Manipulation des Wirts-/Spendergenoms18und hormonelle Manipulation12. Ein großer Vorteil der in diesem Protokoll beschriebenen enzymatischen Dissoziation ist die Möglichkeit, epitheliale Organoide oder monodisperse Zellen für komplementäre Experimente mit Durchflusszytometrie, 3D-Kultur, Genbearbeitung und mehr zu isolieren. Zukünftige Anwendungen dieser Technik werden zusätzliche Manipulationen von Spender- und/oder Wirtsgewebe mit Gentechnik umfassen. Beispielsweise können Spenderzellen ex vivo an jedem ausgewählten genomischen Ort mit dem CRISPR-Cas9-Genbearbeitungssystem genetisch verändert werden. In ähnlicher Weise können Empfängerratten auch genetisch verändert werden, um die Wechselwirkung zwischen spender- und empfängertechnischen genetischen Faktoren zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>0,2 &Mikro; M Spritzenvorsatzfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-715G</td> steril <td>filtrierende Kollagenase-Aufschlussmedien</td></tr><tr><td>1,5 - 2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen (steril)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>mit resuspendierten Zellen und/oder Gehirnhomogenatgemisch</td></tr><tr><td>100 & Mikro; M-Zell-Siebe</td><td>Corning</td><td>431752</td><td>filtrierende Homogenisierung</td></tr> des <tr><td>Gehirns 100 μl gasdichte Spritzen mit 25 Gauge-Nadeln</td><td>Hamilton</td><td>81001 & 90525</td><td>Zur Injektion von Transplantatmischung in Empfängertiere (1 pro Spendergenotyp/-zustand)</td></tr><tr><td>1000 μl Pipettenspitzen + Pipette</td><td></td> <td>-</td> <td>Transfer von Zellen/Gemischen/Gewebe</td></tr><tr><td>15 ml Polypropylen-Röhrchen</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352196</td><td>Lagerung der Gehirn-Homogenat-Mischung oder Zelle : Homogenat-Mischung für die Transplantation</td></tr><tr><td>40 & Mikro; M Zellsiebe</td><td>Corning</td><td>431750</td><td>filtrierende Organoide nach dem Waschen des Zellpellets</td></tr><tr><td>50 mL Polypropylen-Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-6</td><td>für den Kollagenaseverdau von Spender-Brustdrüsengewebe</td></tr><tr><td>60 mm Schalen</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>zum Zerkleinern von Gewebe</td></tr><tr><td>Alaun-Kaliumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>243361/237086</td><td>Färben der Brustdrüse ganze Halterung Objektträger</td></tr><tr><td>Anästhesie-Vaporizer für veterinärmedizinische Zwecke</td><td></td> <td>-</td> <td>befolgen Sie das institutionelle Protokoll</td></tr><tr><td>Beta-Dine oder Jod</td><td></td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Borosilikatglas-Kulturröhrchen für die Homogenisierung</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td>für die Homogenisierung des Gehirns (verwenden Sie ein geeignetes Röhrchen für den Homogenisator)</td></tr> <tr><td>Karmin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6152/1022</td><td>Färbung der Brustdrüse Ganzes Reittier Objektträger</td></tr><tr><td>Zellzählgerät</td><td></td> <td>-</td><td></td> Reinigen</tr> Sie <tr><td>Tierkäfige für die Genesung</td> <td>-</td><td></td> <td>befolgen Sie das institutionelle Protokoll</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 3</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS004183</td><td>enzymatische Verdauung von zerkleinertem Brustdrüsengewebe von Spenderratten</td></tr><tr><td>deionisiertes Wasser</td><td></td> <td>-</td> <td>für chemische Lösungen</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320033</td><td>zum Zerkleinern von Gewebe, Kollagenase-Aufschlussmedien und resuspendierende Epithelzellgemische</td></tr><tr><td>EDTA</td> <td>-</td><td></td> <td>Monodispersionsgemisch</td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705/2701</td><td>Fixiermittel für Brust-Whole-Mount-Objektträger, Waschen von Whole-Mount-Objektträgern, Reinigung von chirurgischen Inzisionsstellen (verdünnt)</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyklone-Inaktivierungslösung</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gaze</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Eisessigsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>zur Verwendung als Fixiermittel für Mamma-Whole-Mount-Objektträger (1:4 Eisessigsäure in 100 % Ethanol)</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>-</td><td>Monodispersionsmischung</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td></td> <td>-</td> <td>befolgen Sie das institutionelle Protokoll</td></tr><tr><td>Eiskübel (x2)</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Inkubator mit orbitaler Rotation</td><td></td> <td>-</td> <td>müssen in der Lage sein, 37° zu halten; C, Schütteln bei 220-225 U/min (für die Kollagenaseverdauung von Brustgewebe)</td></tr><tr><td>Isofluran-Anästhesie</td><td></td> <td>-</td> <td>befolgen Sie das institutionelle Protokoll</td></tr><tr><td>Lichtmikroskop oder Digitalkamera</td><td></td> <td>-</td> <td>Visualisierung des gesamten montierten Brustepithels und/oder Aufnahme von Bildern</td></tr><tr><td>Mechanischer Homogenisator</td><td>Fisher Scientific-TissueGeizhals</td><td></td> <td>oder alternative Modelle</td></tr><tr><td>Mineralöl, rein</td><td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td><td>8042-47-5</td><td>Langzeitlagerung von gereinigten ganzen Halterungen der Brustdrüse</td></tr><tr><td>Sauerstofftanks für den Anästhesieverdampfer</td><td></td> <td>-</td> <td>befolgen Sie das institutionelle Protokoll</td></tr><tr><td>Papiertücher oder empfindliche Arbeitstücher</td><td></td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Positiv geladene Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>P4981-001</td><td>Brustdrüsengewebe ganze Halterungen</td></tr><tr><td>Postoperativ Analgetikum</td><td></td> <td>-</td> <td>Institutionelles Protokoll</td></tr><tr><td>Waage</td><td></td><td></td><td>Körpergewichtsmessungen von Tieren, richtige Dosierung von Schmerzmitteln</td></tr><tr><td>Rasierer</td><td></td> <td>-</td> <td>elektrische Schermaschinen oder andere</td></tr><tr><td>Färbegläser</td> <td>-</td><td></td> <td>mindestens 1 pro chemischer Wäsche, Größe entsprechend der Anzahl der Objektträger, Glas bevorzugt</td></tr><tr><td>Sterile Feldabdeckungen</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td>zur Verwendung während der</td></tr><tr><td>Transplantation Sterile Scheren und Pinzetten x3 (autoklaviert)</td> <td>-</td><td></td> <td>autoklavierte chirurgische Instrumente für Spender und Empfänger</td></tr><tr><td>Spritzen: 5 ml (oder mehr)</td> <td>-</td> <td>für die sterile Filtration von Kollagenase-Aufschlussmedien</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Trypsin-Worthington-Monodispersionsgemisch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abfallsammelbehälter für Flüssigkeiten (gegossen oder aspiriert)</td> -<td> </td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Wundclip-Applizierer, Clips und Entfernungswerkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td>Schließen des Hautschnitts über dem interscapularen weißen Pad-Pad</td></tr><tr><td>Xylole</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Reinigung der Brustdrüse ganze Halterungsobjektträger nach dem Färben</td></tr></tbody></table>

ratte mammary epithel cell transplantation in das interskapulierische weiße fettpad

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Bereits in den 1970er Jahren haben Forscher erfolgreich Epithelzellen der Brust in das interscapuläre weiße Fettpolster von Ratten transplantiert. Das Grafting-Mammaepithel mit Transplantationstechniken nutzt die hormonelle Umgebung des jugendlichen Nagetierwirts. Diese Studien sind ideal geeignet, um die Auswirkungen verschiedener biologischer Manipulationen auf die Entwicklung der Brustdrüse zu untersuchen und viele Aspekte der Brustdrüsenbiologie zu sezieren. Ein häufiges, aber einschränkendes Merkmal ist, dass transplantierte Epithelzellen stark von der umgebenden Stroma beeinflusst und durch endogenes Epithel übertroffen werden; Um natives Brustgewebe zu nutzen, muss das abdominale weiße Fettpolster vor der Transplantation gelöscht werden, um das Brustepithel zu entfernen. Ein großes Hindernis bei der Verwendung des Rattenmodellorganismus ist, dass die Beseitigung des sich entwickelnden Brustbaums bei nachentwöhnten Ratten nicht effizient ist. Bei der Transplantation in drüsenfreie Fettpolster können Spenderepithelzellen das gelöschte Wirtsfettpad wieder bevölkern und eine funktionelle Brustdrüse bilden. Das interskapulierliche Fettpolster ist ein alternativer Ort für diese Transplantate. Ein großer Vorteil ist, dass es an duktalen Strukturen fehlt, aber die normale Stroma liefert, die notwendig ist, um epitheliale Auswüchse zu fördern und in der Ratte leicht zugänglich ist. Ein weiterer großer Vorteil dieser Technik ist, dass sie minimal invasiv ist, weil sie die Notwendigkeit eliminiert, den wachsenden endogene Brustbaum zu kauterisieren und zu entfernen. Darüber hinaus enthält das interskapulierliche Fettpad ein mediales Blutgefäß, das verwendet werden kann, um Standorte für die Transplantation zu trennen. Da die endogenen Drüsen intakt bleiben, kann diese Technik auch für Studien verwendet werden, die die endogene Brustdrüse mit der transplantierten Drüse vergleichen. Dieses Papier beschreibt die Methode der Brustepithelzelltransplantation in das interscapuläre weiße Fettpolster von Ratten.

Spender und Empfänger Brustdrüsen Die Schritte zur Isolierung und Vorbereitung von Ratten-Mamma-Epithelzellen für die Transplantation sind in Abbildung 1Adargestellt. Im Alter von 4 Wochen hat die endogene Brustdrüse der Spenderratte mit der Reifung begonnen und Epithel kann auf ganzen montierten Dias visualisiert werden, die mit Alumcarmine gefärbt sind (Abbildung 1</stron...

Dieser Artikel beschreibt eine Transplantationsmethode, um Spenderratten-Epithelzellen in das interskapulierliche weiße Fettpolster von Empfängertieren zu transplantieren. Diese Methode kann verwendet werden, um wirtliche und/oder Spendereffekte auf die Entwicklung von Brustepithel zu untersuchen und eliminiert die Notwendigkeit einer Vorabklärung, wodurch die Nützlichkeit dieser Technik erweitert wird.

Ratte Mammary Epithel Cell Transplantation in das interskapulierische weiße Fettpad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Dieses Protokoll wird seit über 40 Jahren verwendet und bleibt die einzige zuverlässige Methode für Brustzelltransplantationstests bei Ratten. Diese Methode ist weit verbreitet, um Brustzellen autonom versus Wirt Effekte in der Brustkrebsanfälligkeit Forschung zu verhören. Durch die Transplantation in das interskapulierliche Fettpolster umgeht diese Methode die Beseitigung des endogene Membranepithels, das bei Ratten nicht wirksam ist.Die Methode ist daher weniger invasiv und die endogenen Brustdrüsen können als interne Kontrolle verwendet werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie eine eingeschläferte weibliche Ratte auf den Rücken und sichern Sie sie mit Stiften. Sprühen Sie die gesamte ventrale Oberfläche mit 70% Ethanol.Machen Sie einen sagittalen Y-förmigen Schnitt, der den Zugang zu Brustdrüsen der Brust, der Bauch und der Leistenmuskibe ermöglicht. Verwenden Sie eine Schere, um das gesamte Brustdrüsengewebe von der Spenderratte zu sezieren und alle sichtbaren Lymphknoten zu entfernen. Als nächstes verwenden Sie Zangen, um das Brustgewebe zu extrahieren.Legen Sie es in eine beschriftete 60-Millimeter-Schale mit 500 Mikroliters serumfreiem DMEM F12-Medium und halten Sie es auf Eis. Dann verwenden Sie eine Schere, um das Brustgewebe fein zu zerkleinern. Drehen Sie zunächst den Körper des Spendertiers vorsichtig um, um ihn in eine anfällige Position zu bringen und mit Stiften zu befesten.Den Kopf und den oberen Rücken mit 70% Ethanol besprühen. Suchen Sie die Basis des Schädels und machen Sie einen Schnitt unter den okzipitalen Kondylen, setzen Sie scharfe Scheren unter die Haut und schneiden Sie die Haut weg vom Schädel einschließlich der Seiten des Kopfes. Als nächstes verwenden Sie Knochenschneider oder starke Schere, um den Schädel entlang der Mittellinie von der okzipitalen zu frontalen Knochen zu schneiden, während Sie sicherstellen, dass die Klinge so oberflächlich wie möglich und nach oben gewinkelt, um die Zerstörung des darunter liegenden Hirngewebes zu verhindern.Verwenden Sie Rongeurs oder starke Zangen, um den Knochen zu schälen. Setzen Sie das Werkzeug seitlich in das Kleinhirn ein, um den Knochen auf beiden Seiten zu brechen. Trennen Sie die Verbindungen zu den Meninges, indem Sie den Gehörgang vollständig freilegen.Verwenden Sie gekrümmte feinspitzen Zangen, um das Gehirn aus dem Schädel zu heben und sein Gewicht aufzuzeichnen. Verwenden Sie einen Neuanfang der Versorgung für zusätzliche Spendergehirne. Übertragen Sie es sofort in ein 15-Milliliter-Rohr, das eine gleiche Menge an Medien enthält, die auf Eis gespeichert sind.Homogenisieren Sie das Gehirn für 10 bis 15 Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit. Dann filtern Sie das Homogenat, um große Stücke zu entfernen. Bewahren Sie die Flüssigkeit auf Eis auf, bis sie benötigt wird.Schneiden Sie zunächst einen Zentimeter vom Ende einer 1.000 Mikroliter-Pipettenspitze ab und legen Sie sie manuell auf den Pipetten. Verwenden Sie eine geschnittene Pipettenspitze, um das gehackte Spendergewebe von jeder 60-Millimeter-Schale in das Kollagenase-Verdauungsrohr zu übertragen. Mischen Sie das gehackte Gewebe vorsichtig, indem Sie es ein- bis zweimal nach oben und unten pfeifen.Dann sichern Sie die Proben in einer horizontalen Position im Schüttelinkubator. Lassen Sie die Proben für 1,5 bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius verdauen, während Sie mit einer Geschwindigkeit zwischen 200 und 220 RPM schütteln. Wenn das Spender-Brustdrüsengewebe vollständig verdaut ist, zentrifugieren Sie die Suspension bei 1, 200 mal g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.Nachdem sichergestellt ist, dass sich ein Pellet gebildet hat, verwenden Sie eine Pipette, um die Fettschicht zu entfernen oder den Überstand vorsichtig abzugießen. Das Pellet in 10 Millilitern frischer DMEM F12-Medien vorsichtig wieder aufhängen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Zellen gründlich zu waschen.Bereiten Sie für jedes Spendertier eine 50-Milliliter-Röhre mit einem 40-Mikrometer-Sieb vor. Das Sieb mit mindestens einem Milliliter DMEM F12-Medien vorbefeuchten. Verwenden Sie dann eine Pipette, um die Zellsuspension durch den Filter zu leiten, um duktale Fragmente oder Organoide zu sammeln.Bei Organoiden bleiben nur die Zellen, die im Filter verbleiben. Invertieren Sie das Zellsieb über eine neue 50 Milliliter Tube und spülen Sie mit jedem Volumen von sterilen Medien erforderlich, um alle Zellen zu sammeln. Danach pellet die Zellen noch einmal und resuspendieren in einem kleinen Volumen von Medien zum Zählen.Bereiten Sie einzelne Chargen von Spendermaterial für alle Transplantationsempfänger vor, indem Sie gleiche Volumina der Zellsuspension mit 50% Gehirnhomogenat für jeden Ort der Transplantation kombinieren. Identifizieren Sie zunächst die Basis des Schädels und den Beginn der Wirbelsäule auf einem Empfängertier. Etwa ein Drittel des Weges nach unten die Wirbelsäule, rasieren Eine drei Zentimeter mal zwei Zentimeter Fläche auf dem oberen brustförmigen Teil des Rückens.Als nächstes bereiten Sie das sterile Feld vor, das für die Operation verwendet wird, und arrangieren Alle benötigten Vorräte. Spülen Sie die Hamilton-Spritzen mit sterilen DMEM F12-Medien, um den Verlust von Zellen zu verhindern. Legen Sie das gesamte Volumen des Spendermaterials für jede Bedingung in eine separate Spritze.Nachdem die Spritze voll beladen ist, invertieren Sie sie und drücken Sie den Kolben leicht, um Luftblasen an der Spitze der Nadel zu entfernen. Halten Sie die Spritze während des gesamten Verfahrens auf Eis. Stellen Sie sicher, dass das Tier mit einer festen Zehenprise nicht auf tiefe Reize reagiert.Verwenden Sie dann eine scharfe chirurgische Klinge, um einen kleinen zwischensakulären Schnitt zu machen. Suchen Sie das mediale Blutgefäß zur Orientierung und verwenden Sie Zangen, um die Haut auf einer Seite des Schnitts zu heben. Halten Sie die Haut vom Fettpolster weg und vermeiden Sie das darunter liegende braune Fett, während die Transplantation durchgeführt wird.Als nächstes legen Sie die Nadel in die Transplantatstelle ein. Spritzen Sie vorsichtig 40 Mikroliter der Zellmischung in das interscapuläre weiße Fettpolstergewebe. Entfernen Sie die Nadel langsam.Halten Sie das Gewebe an Ort und Stelle und lassen Sie die transplantierten Zellen für drei bis fünf Sekunden zu begleichen. Wiederholen Sie das gesamte Injektionsverfahren, wie zuvor am zweiten Ort der Transplantation beschrieben. Danach die chirurgische Wunde mit Wundclips oder Nähten schließen und dann die Anästhesie abbrechen.Nachdem Sie das Tier geopfert haben, bereiten Sie es für die Zerlegung vor. Identifizieren Sie das mediale Blutgefäß, das die Transplantatstellen im interscapularen Fettpolster trennt. Verbrauchen Sie das gesamte Pad als ein einzelnes Stück Gewebe.Legen Sie das Gewebe auf einem positiv geladenen Mikroskopschlitten für die gesamte Halterung. Legen Sie die Dias in 70% Ethanol für sieben bis zehn Tage, um das Gewebe zu entfetten. Dann bereiten Sie den Alum-Karmin-Färbung vor und verarbeiten Sie die Dias, wenn das Gewebe ausreichend undurchsichtig ist.Wenn die Verarbeitung abgeschlossen ist und das Gewebe auf dem Dia gelöscht ist, verwenden Sie low-power light mikroskopoder hochauflösende digitale Fotografie, um Bilder der Dias für die Analyse zu erfassen. In dieser Studie werden Brustepithelzellen mit einer Technik transplantiert, die für die Arbeit mit Ratten optimiert ist, bei der die isolierten Epithelorganoide der Samenratten in das interskapulierweiße Fettpolster der Empfängerratten eingepfropft werden. Die Anwesenheit, Abwesenheit oder Fülle von Epithel kann bewertet werden, um den Erfolg des Experiments sowie die Autonomie von Effekten im Zusammenhang mit experimentellen Variablen zu bestimmen.Ein gegenseitiges Transplantationsexperiment, bei dem jeder Faktor zwei Ebenen wie Wildtyp versus Knockout hat, erstellt vier Transplantationsgruppen für Hypothesentests. Das repräsentative gesamte montierte interskapulare Fettpolster, das hier gezeigt wird, enthält ein positives epitheliale Auswuchs an beiden Transplantationsstandorten. Bei der Analyse der Dias kann der Mangel an Epithel im interskapulären Fettpolster über viele Proben auf ein technisches Problem mit dem Verfahren hinweisen und sollte als negatives Ergebnis behandelt werden.Spenderepithelial-Auswuchs kann auch mit der endogenen Brustdrüse verglichen werden und kann zusätzliche Schlussfolgerungen erleichtern. Im hier gezeigten Beispiel deuteten die Ergebnisse der gegenseitigen Transplantation mit Wildtyp und CDKN1B-Knockout-Ratten auf autonome Wirkungen der Nicht-Mamma-Zelle auf die Entwicklung der Brustdrüse hin. Denken Sie daran, Spender Epithelzellen und Organoide müssen sorgfältig vorbereitet und am Leben gehalten werden, bis in das Empfängertier injiziert.Es ist unerlässlich, vorauszuplanen und das Verfahren sorgfältig und ohne Unterbrechungen durchzuführen. Primäre Karzinogenese-Assays können nach der Transplantation durchgeführt werden, um die Autonomie der Brustzellen in der Ätiologie oder Behandlung von Brustkrebs abzuhören. Die Genbearbeitung kann auch in den Gentechnischveränderten der Spenderzellen oder der Empfängerratte integriert werden.Als einzige Methode zur Durchführung von Brustepithelzelltransplantationen bei Ratten erleichtert dieses Verfahren die Entwicklung der Brustdrüse sowie Karzinogenesestudien. Diese Technik ist besonders wichtig für die Erforschung von Wechselwirkungen zwischen Brustkrebszellen und/oder Brustepithelzellen mit der Wirtsmikroumgebung. Es ermöglicht Studien in der Entwicklung der Brustdrüse sowie der Brustkrebsforschung.Diejenigen, die diese Technik zum ersten Mal versuchen, sollten Spenderzellpräparate optimieren, um maximale Zellausbeute und Lebensfähigkeit zu gewährleisten, dann kleine Pilotversuche durchführen, um chirurgische Eingriffe zu praktizieren und Zellnummern zu bestimmen, um zu injizieren, und auch die für Experimente erforderlichen postoperativen Inkubationszeiten bestimmen.

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