Name: Ratte Mammary Epithel Cell Transplantation in das interskapulierische weiße Fettpad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Transplantation von Ratten-Mammarepithelzellen in das interskapuläre weiße Fettpolster. Diese etablierte Methode ermöglicht die Untersuchung von Zell-autonomen und Wirtseffekten in der Brustkrebsforschung.

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Diese Arbeit wurde durch den Forschungsfinanzierungsmittel des Hollings Cancer Center es Cancer Center Support P30 CA138313 von den National Institutes of Health (<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">https://www.nih.gov/</a>) und Mittel des Department of Pathology & Laboratory Medicine der Medical University of South Carolina finanziert. Wir danken Marijne Smiths für die Aufzeichnung der Interview-Aussagen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll beschreibt eine Brustepithelzelltransplantationstechnik, die für die Arbeit mit Ratten optimiert ist. Isolierte Epithelorganoide von Spenderratten (3-5 Wochen alt) werden in das interskapulierliche weiße Fettpolster der Empfängerratten (ebenfalls 3-5 Wochen alt) eingepfropft. Die Ergebnisse können nur 4-6 Wochen später interpretiert werden, mit Hilfe der Lichtmikroskopie, um das transplantierte Gewebe zu untersuchen; Allerdings muss vor der Durchführung eines vollständigen Experiments die optimale Zeit z...

Postnatale Brustdrüsenentwicklung und duktale Morphogenese sind Prozesse, die weitgehend durch hormonelle Signalisierung zu Beginn der Pubertät beeinflusst werden. Bei Mäusen und Ratten, häufig verwendeten Modellorganismen der Brustdrüsenbiologie, beginnt dieser Prozess etwa 3 Wochen im Alter, wo eine schnelle Proliferation und Differenzierung zur Bildung des reifen Parenchyms führen. Die reife Brustdrüse kann zahlreiche Expansions- und Involutionrunden durchlaufen, eine Eigenschaft, die seit dem frühen20. Jahrhundert untersucht wird. Im Rahmen der Hyperproliferation und der Krebsentwicklung wurden in den 1950er Jahren1Brustdrüsentransplantationstechniken entwickelt und durch die quantitative Methodik verbessert, die Gould et al. 1977 2,3,4beigesteuert haben. Die Verfeinerung der Transplantationstechnik bei Nagetieren hat zu großen Fortschritten beim Verständnis der normalen Brustdrüsenbiologie beigetragen, die immer noch weit verbreitet sind, um die Wirkung verschiedener Behandlungen und genetischer Manipulationen auf normale Brustdrüsenentwicklung und Krankheitszustände zu untersuchen.
Viele Hypothesen wurden erstellt und anschließend mit Brustdrüsentransplantation getestet, zuerst beschrieben von DeOme et al. 19591. Experimente über mehrere Jahrzehnte zeigten die Neigung des duktalen Gewebes, das aus den Spender-Brustdrüsen entnommen wird, um das gesamte Fettpolster5,6,7 wieder zu bevölkern, und zeigten, dass eine kritische Komponente der Entwicklung der Brustdrüse in diesen epithelialer Strukturen liegt. Spätere Studien an Mäusen zeigten, dass eine einzelne Bruststammzelle ein gelöschtes Fettpolster wieder bevölkern kann und zur Entdeckung eines einzigen, gemeinsamen Vorläufers von Basal- und Luminal-Mammaepithelzellen8,9,10beigetragen hat. Im Einklang mit diesen Schlussfolgerungen, Es wurde vorgeschlagen, dass Transplantation erhöht den Pool von Zellen mit Multilineage-Wiederbevölkerung Potenzial als Folge der Plastizität, so dass die transplantierten Zellen eine funktionelle Brustdrüsewachsen 7,10,11,12,13. Wichtig ist, dass der Einsatz von Transplantationstechniken bei Nagetieren die Grenzen von zellkulturinduzierten Anomalien14 überwindet und oft in nur wenigen Wochen Ergebnisse liefert.
Während das Verfahren ursprünglich im Zusammenhang mit präneoplastischen Läsionen bei Mäusen beschrieben wurde, wurde es bald auf Ratten ausgeweitet und in Verbindung mit der karzinogenen Behandlung verwendet, um die Multiplizität als Maß für die Krebsanfälligkeit zu etablieren15, aber die Popularität von Transplantationstechniken hat die Entwicklung genetischer Werkzeuge für jede Art verfolgt. Obwohl Mausstudien mit Transplantation viele translationale Befunde beigesteuert haben, ähnelt das Parenchym der Rattenbrustdrüse dem Menschen näher16,17 und bietet deutliche Vorteile für die Untersuchung von Östrogenrezeptor-positivem (ER+) Brustkrebs. Brusttumoren sind in beiden Arten induzierbar, unterscheiden sich jedoch in Bezug auf Hormonempfindlichkeit und Genexpressionsprofile. Ein primärer Unterschied ist, dass Rattenbrusttumoren ausdrücken und von der Funktion der Eierstock- und Hypophysenhormonrezeptoren abhängen, nämlich Östrogen und Progesteron (PR), ähnlich dem Luminal-A-Subtyp des menschlichen Brustkrebses. Tatsächlich wurde die Transplantation von Epithelzellen, wie in diesem Protokoll beschrieben, verwendet, um genetische Varianten zu untersuchen, die an Brustkrebs beteiligt sind, und die zelluläre Autonomie der Wirkungen auf Dieepithelzellen18zu bestimmen.
Neben der Tumorbiologie weist das duktale Epithel der normalen Rattenbrustdrüse eine höhere Verzweigung auf und wird von einer dickeren Stromaschicht flankiert als die Maus. Die Bedeutung der Stroma ist in Brustepitheltransplantationsstudien gut dokumentiert. Das Brustepithel muss mit fettem Stroma und idealerweise seinem eigenen Mesenchym interagieren, um seine charakteristische Morphogenese19,20zu durchlaufen. Das Verpflanzen von Gewebe in eine Empfänger-Brustdrüse bietet eine optimale Umgebung; das Vorhandensein von endogenem Epithel kann jedoch die Ergebnisse beeinträchtigen. Die Vorreinigung der Brustdrüse von endogenem Epithel wird häufig in Maustransplantationstests durchgeführt und erfordert eine chirurgische Exzision des endogenen Brustgewebes und/oder die Entfernung der Brustwarze1,21,22. Obwohl möglich, ist die Vorreinigung des Brustepithels bei nach entwöhnenden Ratten nicht so weit verbreitet, vor allem aufgrund der Unwirksamkeit der Räumung des wachsenden Brustbaums bei nach entwöhnenden Ratten. Da gezeigt wurde, dass Regionen von Fettgewebe an anderer Stelle im Körper das Wachstum des transplantierten Brustepithels21,23,24unterstützen könnten, kann der Prozess der Vorräumung bei Ratten leicht vermieden werden, indem Gewebe in das interscapuläre weiße Fettpolster transplantiert wird.
Die in diesem Papier beschriebene Transplantationsmethode beinhaltet die Injektion von enzymatisch dissoziierten Brustdrüsenorganoiden (Fragmente von Brustduktalepithel und anderen Zelltypen, die morphogenestisch geeignet sind) oder monodispergierten Zellen in das interscapuläre Fettpolster in inzucht, isogenen oder kongenen Stämmen von Laborratten2. Da das interskapuläre Fettpolster normalerweise frei von Brustgewebe ist, bietet es eine geeignete Umgebung für mehrere Transplantationsstellen, ohne dass endogenes Epithel vorgeklärt werden muss. Infolgedessen sind die endogenen, abdominalen Bauch-Leisten-Brustdrüsen des Wirtstiers keiner chirurgischen Manipulation ausgesetzt, entwickeln sich normal und können die Interpretation der Ergebnisse nicht beeinträchtigen. Zusätzlich können die intakten Brustdrüsen zum Vergleich verwendet werden, um Wirts- und Spendereffekte auf die Entwicklung des Brustepithels und die Tumorgenese18,25zu bewerten. Obwohl die Repopulation der Brustdrüse aus einer einzigen Stammzelle für Mäuse verfügbar ist, wurde sie noch nicht für Ratten entwickelt, hauptsächlich aufgrund der fehlenden Verfügbarkeit von Antikörpern zur Auswahl für Bruststammzellen der Ratte25,26,27. Trotzdem kann die Transplantation von monodispersen Epithelzellen der Brust zur Quantifizierung des Wiedervolksungspotenzials erfolgreich durchgeführt werden, und diese Zellen entwickeln sich normal, wenn sie in das entsprechende Gerüst eingepfropft werden2,3,4. Während Organoide für viele Zwecke gut sind, sind monodisperse Zellen für quantitative Anwendungen erforderlich, um beispielsweise die Anzahl der Brustepithelzellen zu bestimmen, die für die Krebsinitiierung nach ionisierender Strahlenbehandlung28 oder zum Vergleich der Merkmale der zytometrischen Zytometrie-Epithelzellpopulationen benötigt werden29.
Bis heute ist das hier beschriebene Verfahren die robusteste Methode zur Durchführung von Brustdrüsentransplantationen bei ratten mit dem übergeordneten Ziel, die Entwicklung der Brustdrüse und die Mechanismen, die der Entwicklung von Brustkrebs zugrunde liegen, zu untersuchen. Häufig sind spender- und/oder Empfängertiere vor, während oder nach der Epitheltransplantation unterschiedlichen Variablen ausgesetzt. Beispiele sind einzelne Genstudien mit chemischer Karzinogenese30, Strahlung28,31,32, genetische Manipulation des Wirts-/Spendergenoms18und hormonelle Manipulation12. Ein großer Vorteil der in diesem Protokoll beschriebenen enzymatischen Dissoziation ist die Möglichkeit, epitheliale Organoide oder monodisperse Zellen für komplementäre Experimente mit Durchflusszytometrie, 3D-Kultur, Genbearbeitung und mehr zu isolieren. Zukünftige Anwendungen dieser Technik werden zusätzliche Manipulationen von Spender- und/oder Wirtsgewebe mit Gentechnik umfassen. Beispielsweise können Spenderzellen ex vivo an jedem ausgewählten genomischen Ort mit dem CRISPR-Cas9-Genbearbeitungssystem genetisch verändert werden. In ähnlicher Weise können Empfängerratten auch genetisch verändert werden, um die Wechselwirkung zwischen spender- und empfängertechnischen genetischen Faktoren zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>0,2 &Mikro; M Spritzenvorsatzfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-715G</td> steril <td>filtrierende Kollagenase-Aufschlussmedien</td></tr><tr><td>1,5 - 2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen (steril)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>mit resuspendierten Zellen und/oder Gehirnhomogenatgemisch</td></tr><tr><td>100 & Mikro; M-Zell-Siebe</td><td>Corning</td><td>431752</td><td>filtrierende Homogenisierung</td></tr> des <tr><td>Gehirns 100 μl gasdichte Spritzen mit 25 Gauge-Nadeln</td><td>Hamilton</td><td>81001 & 90525</td><td>Zur Injektion von Transplantatmischung in Empfängertiere (1 pro Spendergenotyp/-zustand)</td></tr><tr><td>1000 μl Pipettenspitzen + Pipette</td><td></td> <td>-</td> <td>Transfer von Zellen/Gemischen/Gewebe</td></tr><tr><td>15 ml Polypropylen-Röhrchen</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352196</td><td>Lagerung der Gehirn-Homogenat-Mischung oder Zelle : Homogenat-Mischung für die Transplantation</td></tr><tr><td>40 & Mikro; M Zellsiebe</td><td>Corning</td><td>431750</td><td>filtrierende Organoide nach dem Waschen des Zellpellets</td></tr><tr><td>50 mL Polypropylen-Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-6</td><td>für den Kollagenaseverdau von Spender-Brustdrüsengewebe</td></tr><tr><td>60 mm Schalen</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>zum Zerkleinern von Gewebe</td></tr><tr><td>Alaun-Kaliumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>243361/237086</td><td>Färben der Brustdrüse ganze Halterung Objektträger</td></tr><tr><td>Anästhesie-Vaporizer für veterinärmedizinische Zwecke</td><td></td> <td>-</td> <td>befolgen Sie das institutionelle Protokoll</td></tr><tr><td>Beta-Dine oder Jod</td><td></td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Borosilikatglas-Kulturröhrchen für die Homogenisierung</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td>für die Homogenisierung des Gehirns (verwenden Sie ein geeignetes Röhrchen für den Homogenisator)</td></tr> <tr><td>Karmin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6152/1022</td><td>Färbung der Brustdrüse Ganzes Reittier Objektträger</td></tr><tr><td>Zellzählgerät</td><td></td> <td>-</td><td></td> Reinigen</tr> Sie <tr><td>Tierkäfige für die Genesung</td> <td>-</td><td></td> <td>befolgen Sie das institutionelle Protokoll</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 3</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS004183</td><td>enzymatische Verdauung von zerkleinertem Brustdrüsengewebe von Spenderratten</td></tr><tr><td>deionisiertes Wasser</td><td></td> <td>-</td> <td>für chemische Lösungen</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320033</td><td>zum Zerkleinern von Gewebe, Kollagenase-Aufschlussmedien und resuspendierende Epithelzellgemische</td></tr><tr><td>EDTA</td> <td>-</td><td></td> <td>Monodispersionsgemisch</td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705/2701</td><td>Fixiermittel für Brust-Whole-Mount-Objektträger, Waschen von Whole-Mount-Objektträgern, Reinigung von chirurgischen Inzisionsstellen (verdünnt)</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyklone-Inaktivierungslösung</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gaze</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Eisessigsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td>zur Verwendung als Fixiermittel für Mamma-Whole-Mount-Objektträger (1:4 Eisessigsäure in 100 % Ethanol)</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>-</td><td>Monodispersionsmischung</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td></td> <td>-</td> <td>befolgen Sie das institutionelle Protokoll</td></tr><tr><td>Eiskübel (x2)</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Inkubator mit orbitaler Rotation</td><td></td> <td>-</td> <td>müssen in der Lage sein, 37° zu halten; C, Schütteln bei 220-225 U/min (für die Kollagenaseverdauung von Brustgewebe)</td></tr><tr><td>Isofluran-Anästhesie</td><td></td> <td>-</td> <td>befolgen Sie das institutionelle Protokoll</td></tr><tr><td>Lichtmikroskop oder Digitalkamera</td><td></td> <td>-</td> <td>Visualisierung des gesamten montierten Brustepithels und/oder Aufnahme von Bildern</td></tr><tr><td>Mechanischer Homogenisator</td><td>Fisher Scientific-TissueGeizhals</td><td></td> <td>oder alternative Modelle</td></tr><tr><td>Mineralöl, rein</td><td>Sigma-Aldrich/ ACROS Organics</td><td>8042-47-5</td><td>Langzeitlagerung von gereinigten ganzen Halterungen der Brustdrüse</td></tr><tr><td>Sauerstofftanks für den Anästhesieverdampfer</td><td></td> <td>-</td> <td>befolgen Sie das institutionelle Protokoll</td></tr><tr><td>Papiertücher oder empfindliche Arbeitstücher</td><td></td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Positiv geladene Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>P4981-001</td><td>Brustdrüsengewebe ganze Halterungen</td></tr><tr><td>Postoperativ Analgetikum</td><td></td> <td>-</td> <td>Institutionelles Protokoll</td></tr><tr><td>Waage</td><td></td><td></td><td>Körpergewichtsmessungen von Tieren, richtige Dosierung von Schmerzmitteln</td></tr><tr><td>Rasierer</td><td></td> <td>-</td> <td>elektrische Schermaschinen oder andere</td></tr><tr><td>Färbegläser</td> <td>-</td><td></td> <td>mindestens 1 pro chemischer Wäsche, Größe entsprechend der Anzahl der Objektträger, Glas bevorzugt</td></tr><tr><td>Sterile Feldabdeckungen</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td>zur Verwendung während der</td></tr><tr><td>Transplantation Sterile Scheren und Pinzetten x3 (autoklaviert)</td> <td>-</td><td></td> <td>autoklavierte chirurgische Instrumente für Spender und Empfänger</td></tr><tr><td>Spritzen: 5 ml (oder mehr)</td> <td>-</td> <td>für die sterile Filtration von Kollagenase-Aufschlussmedien</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Trypsin-Worthington-Monodispersionsgemisch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abfallsammelbehälter für Flüssigkeiten (gegossen oder aspiriert)</td> -<td> </td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Wundclip-Applizierer, Clips und Entfernungswerkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td>Schließen des Hautschnitts über dem interscapularen weißen Pad-Pad</td></tr><tr><td>Xylole</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Reinigung der Brustdrüse ganze Halterungsobjektträger nach dem Färben</td></tr></tbody></table>

ratte mammary epithel cell transplantation in das interskapulierische weiße fettpad

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Bereits in den 1970er Jahren haben Forscher erfolgreich Epithelzellen der Brust in das interscapuläre weiße Fettpolster von Ratten transplantiert. Das Grafting-Mammaepithel mit Transplantationstechniken nutzt die hormonelle Umgebung des jugendlichen Nagetierwirts. Diese Studien sind ideal geeignet, um die Auswirkungen verschiedener biologischer Manipulationen auf die Entwicklung der Brustdrüse zu untersuchen und viele Aspekte der Brustdrüsenbiologie zu sezieren. Ein häufiges, aber einschränkendes Merkmal ist, dass transplantierte Epithelzellen stark von der umgebenden Stroma beeinflusst und durch endogenes Epithel übertroffen werden; Um natives Brustgewebe zu nutzen, muss das abdominale weiße Fettpolster vor der Transplantation gelöscht werden, um das Brustepithel zu entfernen. Ein großes Hindernis bei der Verwendung des Rattenmodellorganismus ist, dass die Beseitigung des sich entwickelnden Brustbaums bei nachentwöhnten Ratten nicht effizient ist. Bei der Transplantation in drüsenfreie Fettpolster können Spenderepithelzellen das gelöschte Wirtsfettpad wieder bevölkern und eine funktionelle Brustdrüse bilden. Das interskapulierliche Fettpolster ist ein alternativer Ort für diese Transplantate. Ein großer Vorteil ist, dass es an duktalen Strukturen fehlt, aber die normale Stroma liefert, die notwendig ist, um epitheliale Auswüchse zu fördern und in der Ratte leicht zugänglich ist. Ein weiterer großer Vorteil dieser Technik ist, dass sie minimal invasiv ist, weil sie die Notwendigkeit eliminiert, den wachsenden endogene Brustbaum zu kauterisieren und zu entfernen. Darüber hinaus enthält das interskapulierliche Fettpad ein mediales Blutgefäß, das verwendet werden kann, um Standorte für die Transplantation zu trennen. Da die endogenen Drüsen intakt bleiben, kann diese Technik auch für Studien verwendet werden, die die endogene Brustdrüse mit der transplantierten Drüse vergleichen. Dieses Papier beschreibt die Methode der Brustepithelzelltransplantation in das interscapuläre weiße Fettpolster von Ratten.

Spender und Empfänger Brustdrüsen Die Schritte zur Isolierung und Vorbereitung von Ratten-Mamma-Epithelzellen für die Transplantation sind in Abbildung 1Adargestellt. Im Alter von 4 Wochen hat die endogene Brustdrüse der Spenderratte mit der Reifung begonnen und Epithel kann auf ganzen montierten Dias visualisiert werden, die mit Alumcarmine gefärbt sind (Abbildung 1</stron...

Dieser Artikel beschreibt eine Transplantationsmethode, um Spenderratten-Epithelzellen in das interskapulierliche weiße Fettpolster von Empfängertieren zu transplantieren. Diese Methode kann verwendet werden, um wirtliche und/oder Spendereffekte auf die Entwicklung von Brustepithel zu untersuchen und eliminiert die Notwendigkeit einer Vorabklärung, wodurch die Nützlichkeit dieser Technik erweitert wird.

Ratte Mammary Epithel Cell Transplantation in das interskapulierische weiße Fettpad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Dieses Protokoll wird seit über 40 Jahren verwendet und bleibt die einzige zuverlässige Methode für Brustzelltransplantationstests bei Ratten. Diese Methode ist weit verbreitet, um Brustzellen autonom versus Wirt Effekte in der Brustkrebsanfälligkeit Forschung zu verhören. Durch die Transplantation in das interskapulierliche Fettpolster umgeht diese Methode die Beseitigung des endogene Membranepithels, das bei Ratten nicht wirksam ist.Die Methode ist daher weniger invasiv und die endogenen Brustdrüsen können als interne Kontrolle verwendet werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie eine eingeschläferte weibliche Ratte auf den Rücken und sichern Sie sie mit Stiften. Sprühen Sie die gesamte ventrale Oberfläche mit 70% Ethanol.Machen Sie einen sagittalen Y-förmigen Schnitt, der den Zugang zu Brustdrüsen der Brust, der Bauch und der Leistenmuskibe ermöglicht. Verwenden Sie eine Schere, um das gesamte Brustdrüsengewebe von der Spenderratte zu sezieren und alle sichtbaren Lymphknoten zu entfernen. Als nächstes verwenden Sie Zangen, um das Brustgewebe zu extrahieren.Legen Sie es in eine beschriftete 60-Millimeter-Schale mit 500 Mikroliters serumfreiem DMEM F12-Medium und halten Si

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Research

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Dieser Artikel veranschaulicht das Verfahren, nach DeOme KB...

Brustepithelzellen Transplantation

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