In Vitro Einrichtung einer gentechnisch veränderten Murine Kopf- und Halskrebszelllinie mit einem Adeno-assoziierten Virus-Cas9-System
9. Januar 2020
Für das Verständnis von Neoplasie ist die Entwicklung von murinen Modellen mit spezifischen Genen erforderlich, die bei Kopf- und Nackenkrebspatienten mutiert sind. Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vitro-Transformation von primären murinen Zungenzellen unter Verwendung eines adeno-assoziierten Virus-Cas9-Systems vor, um murine HNC-Zelllinien mit spezifischen genomischen Veränderungen zu erzeugen.
Dieses Protokoll ermöglichte die Entwicklung von Kopf- und Halskrebsmodellen mit spezifischer genomischer Operation, was unser Verständnis der Rolle spezifischer Genmutationen im Prozess der Neoplasie erheblich beeinflusste. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Leichtigkeit, mit der die Zelllinie aus praktisch jedem Organ entwickelt werden kann. Demonstrieren das Verfahren wird Manu Prasad ein Grad Student aus meinem Labor sein.
Beginnen Sie mit einer chirurgischen Schere, um die Zunge von einer sechs Wochen alten männlichen oder weiblichen B6-Transgenmaus zu ernten. Verwenden Sie ein Skalpell, um das Gewebe in sehr kleine Fragmente zu zerkleinern und die Stücke in ein 15-Milliliter-Rohr mit 4,5 Milliliter n.R. RUM ohne Serum zu sammeln. Fügen Sie 200 Mikroliter dreifachen Enzymmix in die Röhre und inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten tippen Sie auf die Röhre alle 10 Minuten, um die enzymatische Dissoziation des Gewebes zu verbessern.
Beenden Sie am Ende der Inkubation die Reaktion mit 5%FBS in PBS und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 Mikrometer Maschensieb, um die Zellen von den größeren Gewebefragmenten zu trennen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in drei Millilitern des gesamten Mediums wieder auf. Dann die Zellen in drei Milliliter komplettes Medium pro 16 Millimeter Schale auffüllen.
Übertragen Sie Zellaggregate, die auf dem Filter zurückgehalten werden, auf eine separate 16-Millimeter-Kulturschale und fügen Sie drei Milliliter komplettes Medium hinzu. Halten Sie beide Gerichte im Brutkasten, bis sich verschiedene Zellkolonien bilden. Nach einer Woche Kultur, mikroskopisch untersuchen die primären Zellkulturen auf das Vorhandensein von Fibroblasten Kontamination, Behandlung der Zellen mit 25%Trypsin in 02%EDTA bei 37 Grad Celsius für eine Minute, und entfernen Sie alle Fibroblasten.
Am Tag 10 der Kultur verwenden Sie 25%Trypsin in 02%EDTA für drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen aus der Zellsuspension oder Zellaggregatkulturen zu ernten und zwei mal 10 bis fünf primäre Zellen in zwei Millilitern Medium pro Brunnen in jeden Brunnen der 6-Well-Platte zu sehen. Am nächsten Tag transducieren sie die Zellen mit einem Mal 10 zum 12 viralen Genom pro Milliliter und inkubieren die Zellen im viralen partikelhaltigen Medium für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Kulturüberstandmittel durch zwei Milliliter frisches komplettes Medium pro Brunnen ersetzen und die Zellen an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben.
Nach zwei Wochen Kulturerweiterung, Samen die Zellen für die Validierung und in vivo tumorigenic Experimente. Mit Dem AAV CAS9-Vektor wurden ein mal 10 bis die 12 viralen Genome pro Milliliter Virus bestimmt, um primäre Meth-Zellen mithilfe des protokolls effizient in tumorgene Karten umzuwandeln. Die transduzierten Zellen Express Cre, CAS9 und Green Fluorescent Protein.
Die Injektion von fünf mal 10 in die fünfte primäre AAV-transduzierte Karten in die Zunge, Lippe und Haut von NOD SCID Mäusen, führt zu Tumorbildung bei diesen Tieren im Gegensatz zur Injektion von primärkarten, die keine Tumoren induzieren. Die tumorgene Transformation von primären Zungenepithelzellen kann durch Immunfluoreszenz und Western-Blotting bestätigt werden. Die Genomanalyse durch tiefe Sequenzierung der DNA, die aus den transformierten Zellen isoliert wird, bestätigt die effektive Genbearbeitung und Frameverschiebung der Tumorproteine 53 und APC-Gene durch das AAV CAS9-System.
Darüber hinaus bilden die transformierten Zungenzellen effizient Tumore in wilden Typ C57 schwarz sechs Mäuse. Die immunhistochemische Analyse der neoplastischen Tumorzellen zeigt die zytoplasmatische Expression von E-Cadherin und Keratin 14, beides Epithelgewebemarker. Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens immer daran, dass zu viel Hacken oder zu viel enzymatische Reaktion zu einer verminderten Lebensfähigkeit der Zellen führen, was zu einer verringerten Effizienz der Virustransaktion führt.
Mit diesem Verfahren können die Zelllinien genetisch verändert werden, um Einblicke in das tumorgene und metastasierende Potenzial von Krebszellen aus jedem Gewebe von Interesse zu gewinnen.
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Übersicht
Dieses Protokoll ermöglicht die Entwicklung von Modellen für Kopf- und Halskrebs mit spezifischen genomischen Veränderungen und verbessert so das Verständnis von Genmutationen bei Neoplasien. Die Technik erlaubt die einfache Erzeugung von Zelllinien aus verschiedenen Organen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Onkologie
- Genetik
Hintergrund
- Murine Modelle sind unerlässlich für die Erforschung von Kopf- und Halskrebs.
- Bestimmte Genmutationen spielen eine entscheidende Rolle bei der Neoplasie.
- Aktuelle Methoden zur Entwicklung von Krebsmodellen können komplex sein.
- Dieses Protokoll vereinfacht den Prozess der Erstellung von Zelllinien.
Zweck der Studie
- Entwicklung muriner Kopf- und Halskrebszelllinien.
- Untersuchung der Auswirkungen spezifischer genomischer Veränderungen.
- Bereitstellung eines einfachen Protokolls für Forschende.
Verwendete Methoden
- Gewinnung von Zungengewebe aus B6-transgenen Mäusen.
- Zerkleinern des Gewebes in kleine Fragmente.
- Verwendung eines Dreienzymgemischs für die enzymatische Dissoziation.
- Inkubation der Proben bei 37 Grad Celsius.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Transformation primärer muriner Zungenzellen.
- Erzeugung von Zelllinien mit spezifischen genomischen Veränderungen.
- Verbessertes Verständnis von Genmutationen bei Neoplasien.
- Nachgewiesene Benutzerfreundlichkeit für Forschende.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Erstellung von Krebsmodellen.
- Es erleichtert die Forschung zur Rolle von Genmutationen bei Krebs.
- Dieser Ansatz kann für verschiedene Organgewebe angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Genetisch veränderte murine Kopf- und Halskrebszelllinien, die mittels AAV-Cas9 erzeugt wurden, ermöglichen eine präzise Modellierung onkogener Mutationen und unterstützen eine robuste Zielvalidierung sowie eine mechanistische Entlastung von Risiken in der frühen Entdeckung. Dieser Ansatz erhöht das Vorhersagevertrauen hinsichtlich des tumorigenen Potenzials und fördert die translationale Kontinuität von in-vitro-Systemen zu in-vivo-Modellen. Die Reproduzierbarkeit und Anpassungsfähigkeit dieser Methode über verschiedene Gewebe hinweg positioniert sie als strategisches Asset für die Weiterentwicklung onkologischer Portfoliovorhaben.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung onkogener Treiber und des Verlusts von Tumorsuppressoren in einem kontrollierten genetischen Hintergrund.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Kandidatenzielen durch gezielte Einführung von Mutationen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem menschenrelevante Mutationen in murinen Zellen modelliert werden.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit für die tumorogene Transformation und die Analyse von Signalwegen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet validierte, genetisch definierte Zelllinien für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening.
- Gewährleistet Reproduzierbarkeit und Standardisierung bei der Assay-Entwicklung unter Verwendung isogener Hintergründe.
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung phänotypischer Veränderungen nach genetischer Modifikation.
- Unterstützt die skalierbare Erzeugung krankheitsrelevanter Modelle für Hochdurchsatz-Workflows.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimmt in vitro gewonnene Ergebnisse mit der in vivo-Tumorigenität in syngenen Mausmodellen ab.
- Ermöglicht die Kontinuität von der genetischen Entdeckung bis hin zu präklinischen Wirksamkeits- und Biomarker-Studien.
- Verringert das translatorische Risiko, indem menschliche Krebsmutationen in murinen Systemen nachgebildet werden.
- Unterstützt die Bewertung therapeutischer Ansprechraten und Resistenzmechanismen in modifizierten Modellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode verbindet die frühe Entdeckung, die Identifizierung von Leitstrukturen und die präklinische Validierung, indem sie die schnelle Erzeugung genetisch definierter Krebsmodelle ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie Ermöglicht die Überprüfung von Hypothesen und die Aufklärung von Signalwegen durch gezielte Genomeditierung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, mutationspezifische Zelllinien für die Bereitschaft zur Assaydurchführung und quantitative Auswertung.
- Analytik: Bietet molekulare und phänotypische Messgrößen für die vergleichende Analyse von modifizierten und wildtypischen Zellen.
- Translationale Forschung Verbindet die genetische Manipulation in vitro mit der Tumorbildung in vivo und der Biomarker-Korrelation.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine Plattform zur Erzeugung vielfältiger Krebsmodelle über verschiedene Gewebetypen und genetische Hintergründe hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Modellerstellung und verbessert die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen F&E-Teams.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffiziente Portfoliofortschritte.
- Portfolio-Impact: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung onkologischer Assets.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur primärer Zellen, viraler Transduktion und Genom-Editierung.
- Benötigt Zugang zu Infrastruktur für die Herstellung von AAV, molekulare Validierung und in-vivo-Tumorigenitätstests.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg, um Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten.
- Anpassbar an verschiedene Gewebetypen, hängt jedoch von gewebespezifischen Protokollen und der Zellviabilität ab.
- Die Effizienz und Viabilität können durch Parameter der Gewebeaufbereitung und enzymatischen Dissoziation beeinträchtigt werden.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Primary Cell Isolation and Culture
2:35
Adeno-Associated Virus (AAV) Primary Cell Transduction
3:37
Results: Representative In Vitro Transformation of Primary Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) and Tongue Epithelial Cells Using the AAV-Cas9 System
5:10
Conclusion
