Name: Expression, Reinigung und Liposomenbindung von angehenden Hefe-SNX-BAR-Heterodimeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Lernen Sie die Expression, Reinigung und Liposomenbindung von SNX-BAR-Heterodimeren in Hefe. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Membranremodellierung.

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Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Vergabenummer GM060221 und teilweise vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes unterstützt. gesundheitsamt t32GM007223. R.C. wurde teilweise vom UNC-Charlotte Faculty Research Grants Program unterstützt.

1. Hefe-Stamm-Konstruktion
<ol><li>Beginnen Sie mit TVY614 (pep4x::LEU2 prb1'::hisG prc1'::HIS3)11 als übergeordnete Raufe. Dieser Stamm ist mangelhaft für vakuolare Proteasen, die zum Großteil des Proteinabbaus nach der Zelllyse beitragen, und ermöglicht somit eine sauberere und effizientere Reinigung.</li>
	<li>Designprimer12 und integrieren Tandem Affinitätsreinigung (TAP) Tag am C-Terminus von Atg20 (SNX-BAR ORF 1) mit homologe Rekombination. Verwenden Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um Integrationen zu bestätigen (Abbildung 2).</li>
	<li>Führen Sie einen westlichen Zelllysatfleck mit dem TAP-Tag aus, um die richtige Integration zu bestätigen13. HINWEIS: Wir empfehlen die Ernte von 3 OD (1 OD bei 1 x 107 Zellen) von Zellen für sDS-PAGE und Western Blot Verifikation. Beachten Sie, dass die Integration des TAP-Tags erfolgen sollte, bevor die endogenen Promotoren durch den GAL1-Promoter ersetzt werden, um eine einfachere ÜBERPRÜFUNG des TAP-Tags über Western Blot zu ermöglichen.</li>
	<li>Ersetzen Sie endogene Snx4 (SNX-BAR ORF1) und Atg20 (SNX-BAR ORF 2) Promoter durch nicht markierte GAL1-Promoter mit sequenziellen homologen Rekombinations- und Transformationsschritten jedes einzelnen ORF14.</li>
	<li>Verwenden Sie flankierende Primer außerhalb der Integrationssites, um erfolgreiche Integrationen zu bestätigen (Abbildung 2). Dies führt zu einem Null-Phänotyp der angestrebten SNX-BARs ohne Galaktose im Wachstumsmedium.</li>
</ol>2. Hefeinduktion und SNX-BAR Dimerreinigung
HINWEIS: Hefezellen können auf Standard-YPD (Hefeextrakt, Pepton und 2% Glukose) Agarplatten vermehrt werden, da die Modifikationen chromosomal integriert sind.
<ol><li>Impfen Sie einen großen Tupfer von Zellen in 50 ml Standard-YP (Hefeextrakt und Pepton) Medium mit 2% Raffinose und 0,1% Glukose als Kohlenstoffquelle in einem Kolben mindestens 4x des Volumens der Kultur und wachsen über Nacht in 30 °C Shaker, um eine ordnungsgemäße Belüftung zu ermöglichen. Erwarten Sie, dass das Wachstum in diesem Medium im Vergleich zu Standard-YPD langsamer sein wird.</li>
	<li>Am nächsten Morgen die 50 ml-Präkultur verwenden, um 1 L Standard-YP-Medium mit 2% Raffinose und 0,1% Glukose zu impfen und für 4-5 h in 30 °C Shaker zu wachsen. HINWEIS: Das Volumen der Präkultur, mit der die 1-L-Kultur impfen soll, kann je nach OD600 der Vorkultur angepasst werden. Die OD600 der 1 L-Kultur nach der Impfung sollte etwa 0,2 betragen, um mindestens zwei Verdoppelungen während des 4-5 h-Wachstums zu ermöglichen.<ol>
<li>Verwenden Sie einen verwirrten Fernbachkolben für Das Wachstum, um eine ordnungsgemäße Belüftung zu ermöglichen, ein 2,8 L Volumenkolben ist ausreichend. Weniger Belüftung kann zu einem langsameren Wachstum und einem kleineren Zellpellet bei der Ernte führen.</li>
	</ol></li>
	<li>Überprüfen Sie OD600, um sicherzustellen, dass sich die Kultur nach 4-5 h Wachstum in der Protokollphase (0,5-1) befindet. Je nach Wachstum der Belastung, Anpassungen an der Wachstumszeit, um mindestens zwei Verdoppelungen zu ermöglichen. Auf 2% Galaktose geben und über Nacht in 30 °C Shaker wachsen. HINWEIS: Die OD600 nach dem Wachstum über Nacht kann variieren, aber die Kultur sollte gesättigt sein. Beachten Sie, dass Zellen nicht von 0,1% Glukose entfernt werden müssen, bevor 2% Galaktose für dieses Wachstumsprotokoll hinzukommen. Wir empfehlen die Ernte von 3 OD nicht induzierter und induzierter Zellen in diesem Schritt für SDS-PAGE und Western Blot zur Verifizierung(Abbildung 3A,B, Lane 1-2).</li>
	<li>Erntezellen durch Zentrifugation bei 4500 x g für 15 min. Hier kann ein schwingender Schaufelrotor verwendet werden, der die 1 L-Volumenkultur aufnimmt.</li>
	<li>Das Hefepellet in ein 50 ml konisches Rohr übertragen; ein zweiter Zentrifugationsschritt kann bei Bedarf durchgeführt werden. Das Zellpellet wird in der Regel etwa 10-15 ml Volumen betragen, gemessen durch Graduierungsmarkierungen und kann sofort verwendet oder bei -80 °C gelagert werden.<ol>
<li>Pellet im 15 ml Reinigungspuffer (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol (DTT), Protease-Inhibitor-Cocktail) wieder aufsetzen, um das Endvolumen um 30 ml zu machen.</li>
	</ol></li>
	<li>Vor Gebrauch einen Homogenisator 4 °C abkühlen und mit einem Reinigungspuffer ausbessern. Lysezellen mit einem mechanischen Zellstörer oder Homogenisator. Probe in den Homogenisator einladen und bei 20.000-25.000 psi für 2-3 Runden lysieren; Beachten Sie, dass bei der Lysed-Zelle mehr Eingangsdruck erforderlich ist, um 20.000-25.000 psi beizubehalten. Sammeln Sie die Zelle lysieren in einem 50 ml konischen Rohr auf Eis. HINWEIS: Wenn zusätzliche Proben lysiert werden müssen, sollte der Homogenisator gründlich gereinigt und ausgeglichen werden, bevor die nächste Probe geladen wird. Alle Zelllysate auf Eis halten.</li>
	<li>Löschen Sie das Zelllysat sofort bei 35.000 x g für 1 h bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in eine neue Röhre. Beachten Sie, dass die Lipide aus der Zelllyse während der Zentrifugation nach oben schweben und die Reinigung nicht beeinflussen. HINWEIS: Wir empfehlen, 0,5-1% des Lysats und Pellets für SDS-PAGE-Proben einzusparen. In der Regel werden keine größeren Unterschiede beobachtet und ein zusätzlicher westlicher Fleck kann getan werden, um die TAP-Proteinlöslichkeit zu bestätigen(Abbildung 4, Bahnen 1 bzw. 2).</li>
	<li>Equilibrate 300 l IgG-Sepharoseperlen mit Reinigungspuffer. Fügen Sie in die gelöschte Zelle lysieren und inkubieren für 2 h, rotieren bei 4 °C.</li>
	<li>Sammeln Sie Perlen in einer 10 ml Chromatographie-Säule und lassen Sie ungebundenes Lysat durchfließen.</li>
	<li>Waschen Sie Perlen mit 10 ml Waschpuffer (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT), Hinzufügen von 1 ml auf einer Zeit und so dass es vollständig durchfließen. HINWEIS: Wir empfehlen, 2% der gebundenen IgG-Perlen für sDS-PAGE-Proben zu sparen. Typischerweise beobachten wir vier Hauptbänder; zwei SNX-BAR-Proteine und IgG Heavy and Light Chains (Abbildung 4, Lane 3). Wir empfehlen, äquivalente Mengen an "Eluat" und "IgG-Perlen nach TEV" einzusparen, um die TEV-Spaltungseffizienz zu vergleichen.</li>
	<li>Sammeln Sie Perlen und übertragen Sie sie in ein Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie das Gesamtvolumen mit frischem Waschpuffer und 2 l mit 10 mg/ml TEV-Protease auf 500 l l und über Nacht inkubieren und bei 4 °C rotieren.</li>
	<li>Am nächsten Morgen den Überstand mit einer 27 G Nadel vollständig entfernen und die Proteinreinheit um 10% Polyacrylamid SDS-PAGE bewerten(Abbildung 4,Lane 4). HINWEIS: In der Regel erhalten wir 500 l 0,5-1 mg/ml von 95% reinem Heterodimer(Abbildung 4, Lane 4). Zusätzliche Reinigung mit Calmodulin Harz kann auch durchgeführt werden, aber wir sehen in der Regel eine signifikante Verringerung der Ausbeute und empfehlen, hier zu stoppen, wenn Reinheit ist >90%. TEV stört liposome-Bindungstests nicht, obwohl TEV zusätzlich mit Ni-NTA Agarose Perlen15entfernt werden kann.</li>
	<li>Zum Konzentrieren die Probe auf einen 0,5 ml Zentrifugalfilter mit 10 KDa-Cutoff und Zentrifuge nach Herstelleranleitung auf 50 l oder weniger übertragen. Quantifizieren Sie die konzentrierten Proteine mit dem Bradford-Protein-Assay. Bei 4 °C lagern und innerhalb einer Woche verwenden.</li>
</ol>3. Liposomen-Vorbereitung
<ol><li>Kaufen Sie handelsübliche Lipide: Phosphatidylserin (PS), PI3P, Ergosterol, und Phosphatidylcholin (PC). Bei Bedarf in empfohlenem Lösungsmittel wieder aufsetzen, um Lagerlipide herzustellen. HINWEIS: Lipide werden in einem Methanol/Chlorform-Gemisch nach Herstellerempfehlungen resuspendiert. Stellen Sie sicher, dass die Lipidvorräte vor der Verwendung klar und auf Raumtemperatur erwärmt sind. Resuspendierte Lipide können unter Argongas gelagert und mit Wachsfolie (oder gleichwertig) bei -20 °C für 6-12 Monate oder bis zum Verlust der Aktivität versiegelt werden.</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen, das von jedem Lipidbestand benötigt wird, um eine Mischung mit der gewünschten Lipidzusammensetzung zu erzeugen (siehe Tabelle 1). Nehmen wir insgesamt 1 Mol Lipide in der Lipidmischung an.</li>
	<li>Führen Sie diesen Schritt in einer chemischen Rauchhaube aus. Reinigen Sie Glasspritzen, indem Sie ein vollständiges Spritzenvolumen von Chloroform aufstellen und in einem Abfallbehälter entsorgen. Wiederholen Sie dies noch zwei Mal. Verwenden Sie bei der Übertragung von Chloroform nur Glasspritzen oder Pipetten. Ziehen Sie beim Aufstellen von Chloroform langsam am Stopfen, um das Eindringen von Gasblasen in die Spritze zu verhindern.</li>
	<li>Verwenden Sie Glasspritzen, um Stocklipide, wie in einem sauberen Glaskulturrohr berechnet, um eine endgültige Lipidmischung von 1% PI3P, 20% Ergosterol, 30% PS, PC(Tabelle 1) zu übertragen Je nach Lösungsmittel nionenin jedem Lipid kann sich die Mischung nach Zugabe jedes Lipids trüb drehen. HINWEIS: Um die PS-Konzentrationen (0-30%) zu variieren, passen Sie die Volumina entsprechend an und kompensieren Sie sie mit unterschiedlichen PC (Tabelle 1).</li>
	<li>Trocknen Sie das Lipidgemisch vorsichtig mit Stickstoffgas, das auf das Lipidgemisch gerichtet ist, in einer kreisförmigen Bewegung, um Lipide gleichmäßig zu trocknen. Verwenden Sie einen niedrigen Gasstrom, um die Lipide an der Unterseite des Glasrohrs während des Trocknungsprozesses zu halten. Wickeln Sie das Glaskulturrohr mit Folie, so dass die Öffnung freigelegt, und weiter im Vakuum für 1 h dehydrieren.</li>
	<li>Fügen Sie 400 l Bindungspuffer (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2) hinzu, um Lipide vollständig zu dehydrieren, um eine endgültige Liposomenkonzentration von 2,5 mM zu erreichen. HINWEIS: Die endgültige Liposomenkonzentration kann durch Zugabe von mehr oder weniger Bindungspuffer eingestellt werden. So kann z. B. ein Bindungspuffer von 200 l hinzugefügt werden, um bei Bedarf eine Liposomenkonzentration von 5 mM zu erzeugen (siehe unten).<ol>
<li>Resuspend Lipide durch Schütteln auf mittlerer Geschwindigkeit auf einem Wirbel bei Raumtemperatur für 30 min. Puffer sollte trübe erscheinen, wie Lipide resuspendiert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspendierte Liposomen in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Ab diesem Zeitpunkt können Kunststoffpipettenspitzen verwendet werden, da Lipide nicht mehr in Chloroform resuspendiert werden. Beachten Sie, dass die Liposomenlösung trüb aussehen sollte.</li>
	<li>Liposomen sieben- bis achtmal einfrieren, indem man das Mikrozentrifugenrohr zuerst in flüssigen Stickstoff, dann in ein 37 °C-Wasserbad taucht. Die Liposomenmischung sollte vor dem Auftauen vollständig gefroren und fest vom Auge erscheinen.</li>
	<li>Führen Sie Schritte mit Chloroform in einer chemischen Rauchhaube durch. Reinigen Sie zwei 1 ml Glasspritzen, indem Sie das gesamte Spritzenvolumen von Chloroform, jeweils dreimal, aufstellen und entsorgen, um Restlipide zu entfernen. Equilibrate jede Glasspritze mit reinem Reinstwasser durch Die Erstellung von zwei Spritzenvolumen, dann mit Bindungspuffer durch Die Erstellung von zwei Spritzenvolumen ausgleichn.</li>
	<li>Montieren Sie den Miniextruder gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Equilibrate eine 200 nm Membran und zwei Teile von Filterstützen (siehe Tabelle der Materialien) durch Untertauchen jeder in Bindungspuffer.</li>
	<li>Sandwich die Membran zwischen den Filterstützen und legen Sie in den Mini-Extruder. Um das Totvolumen im montierten Miniextruder zu reduzieren und sicherzustellen, dass die Baugruppe luftdicht ist, übergeben Sie mit den 1 ml Glasspritzen ein Volumen an Bindungspuffer, das mit dem Volumen der Liposomenmischung vergleichbar ist.</li>
	<li>Verwenden Sie eine der 1 ml Glasspritzen und ziehen Sie die Liposomenmischung. Invertieren Sie das Mikrozentrifugenrohr, um das letzte Liposomengemisch in der Rohrkappe für die Aufnahme in die Glasspritze zu sammeln.</li>
	<li>Extrudieren Sie Liposomen, indem Sie die 200 nm Membran 19-21 Mal durchlaufen. Sammeln Sie extrudierte Liposomen in einem neuen Mikrozentrifugenrohr. HINWEIS: Extrudierte Liposomen sollten vor der Extrusion weniger trübe als Liposomen erscheinen. Liposomen sollten noch am selben Tag verwendet und auf Eis gelagert werden. Die letzte Extrusion sollte Liposomen in die Spritze gegenüber der Spritze legen, in der sie begonnen hat.</li>
</ol>4. SNX-BAR Liposomenbindung und Tubulation
<ol><li>Vorfrei gereinigtes Protein bei 100.000 x g in einer Ultrazentrifuge für 20 min bei 4 °C vor der Durchführung von Liposomenbindungs- und Sedimentationsexperimenten. Entfernen Sie den Überstand und übertragen Sie ihn in ein neues Mikrozentrifugenrohr; stören Sie das Pellet nicht, wenn es eine gibt.</li>
	<li>Um Liposomenbindungs- und Tubulations-Assays durchzuführen, inkubieren Sie 4 'M gereinigte Snx4-Atg20 und 2,5 mM Liposomen in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 'L, wobei das Volumen der hinzugefügten Liposomen variiert. HINWEIS: Im selben Experiment sollte das gleiche Volumen an Liposomen verwendet werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Reaktion bei 30 °C für 30 min. HINWEIS: Wir empfehlen, die Menge von 2,5 mM Liposomen, die jeder Reaktion zugesetzt werden, zu maximieren, indem nicht weniger als 10 L Liposomen verwendet werden, um eine Visualisierung während der Sedimentation zu ermöglichen. Wird bei einer 20-L-Reaktion 10 l mit 2,5 mM Liposomen verwendet, beträgt die Endkonzentration von Liposomen 1,25 mM. Wenn die gereinigten Proteine verdünnt sind und mehr Volumen für 4 M Protein benötigt wird, können die Lipide während des Rehydrierungsschritts in 200 l resuspendiert werden, um die Konzentration von Liposomen zu verdoppeln (siehe Schritt 3.6); Dies erfordert jedoch, die Proteinkonzentration zu kennen, bevor die Liposomen gemacht werden.</li>
	<li>
Visualisieren und quantifizieren Sie die Liposomentubulation.
	<ol>
<li>Verarbeiten Sie Liposomenbindungsreaktionen sofort für die Elektronenmikroskopie-Analyse. Punktproben auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfernetzgitter und negativer Fleck mit 1% Uranylacetat (Abbildung 5B)16.</li>
		<li>Analysieren Sie Proben auf einem Transmissionselektronenmikroskop (200 kV).</li>
		<li>Verwenden Sie Bildanalyse-Software, um den Tubulidurchmesser zu messen und zu quantifizieren. Um den Tubulidurchmesser eines einzelnen Tubuli genau zu quantifizieren, nehmen Sie drei Durchmessermessungen entlang der Länge eines Tubuli und des Durchschnitts (Abbildung 5B). HINWEIS: Zur Ermittlung der statistischen Signifikanz wurde eine zweiseitige Varianzanalyse verwendet (Abbildung 5E). Uranlacetat ist sowohl radioaktiv als auch toxisch. Für diesen Schritt ist eine ordnungsgemäße Laborsicherheitszertifizierung erforderlich.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Liposomenbindung und Sedimentation.
	<ol>
<li>Übertragen Sie die Reaktion (20 l, ab Schritt 4.3) auf ein Polycarbonatzentrifugenrohr und drehen Sie mit einem kompatiblen Rotor bei 100.000 x g in einer Ultrazentrifuge 20 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und übertragen Sie ihn in ein neues Mikrozentrifugenrohr. Beachten Sie, dass das Pellet intakt bleiben sollte.</li>
		<li>Setzen Sie das Pellet in SDS-PAGE 40 L Probenpuffer wieder auf und übertragen Sie es in ein neues Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie dem Überstand 20 L Probenpuffer hinzu. Belasten Sie äquivalente Mengen an Pellet und Überstand in einem 10% Polyacrylamid SDS-PAGE Gel und führen Sie Coomassie Färbung durch, um SNX-BARs, die an Liposomen gebunden sind, zu visualisieren (Abbildung 5A).</li>
		<li>Um die Menge des SNX-BAR-Komplexes in der Pelletfraktion zu quantifizieren, quantifizieren Sie Bandintensitäten mittels Densitometrie und quantifizieren Sie den Anteil der SNX-BAR-Proteine in der Pelletfraktion. HINWEIS: Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde eine zweiseitige Varianzanalyse verwendet (Abbildung 5C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier zeigen wir einen optimierten Workflow zur Reinigung von SNX-BAR-Dimeren in Hefe und zwei Assays zur Bewertung ihrer biophysikalischen Eigenschaften auf synthetischen Liposomen. Der Hauptvorteil gegenüber der typischen rekombinanten Proteinexpression in Escherichia coli oder anderen Systemen ist die Fähigkeit, SNX-BAR-Proteine in einem nativen Wirt gleichmäßig auszudrücken und so die Toxizitäts- und Unlöslichkeitsprobleme zu vermeiden, die bei der Reinigung von SNX-BARs in anderen Systemen auftreten. Bemerke...

Membrangebundene Organellen wie die Plasmamembran, das endoplasmatische Retikulum, das Golgi-Gerät, Dassosom (Hefe-Vakuole) und endosom bilden das Endomembransystem der eukaryotischen Zelle. Die meisten Organellen haben die Fähigkeit, Material mit anderen Organellen durch Vesikeltransportträger zu kommunizieren und auszutauschen. Wie die Zelle die Verpackung und Bildung von Vesikeltransportträgern innerhalb des Endomembransystems koordiniert, ist nicht genau bekannt. Es ist jedoch bekannt, dass die Proteine und Lipide, die einen Großteil des Endomembransystems ausmachen, aus der Internalisierung endozytärer Vesikel aus der Plasmamembran (PM) stammen. Das Endosom ist die primäre Akzeptor-Organelle für diese Vesikel und besteht aus mehreren miteinander verbundenen Sätzen von röhrenförmigen Organellen. Die Hauptfunktion des Endosomes besteht darin, die Nährstofferfassung zu erleichtern, den Protein- und Lipidumsatz zu regulieren, vor Krankheitserregerinfektionen zu schützen und als primäre Wiederauffüllungsquelle für Lipide für die Plasmamembran zu dienen. Da das Endosom den Großteil der Ladungsproteine und Lipide aus der Plasmamembran erhält, fungiert es als Sortierraum, indem es Ladungen in röhrenförmige endosomale Transportträger (ETCs) isoliert. Alle Proteine, die nicht in ETCs sequestriert werden, müssen über das endolysosomale System abgebaut werden. Die Dysregulation der Ladungsortierung in ETCs kann zum Verlust der Nährstoffaufnahme, des Proteinumsatzes oder der Lipidhomöostase führen, was zu zahlreichen stoffwechsel-, Entwicklungs- und neurologischenStörungen1,2führt. Trotz der zentralen Rolle der ETCs beim Endosome ist jedoch der zugrunde liegende Mechanismus, wie das Endosom selektiv die Verpackung einer Vielzahl heterogener Ladungen in Röhrenträger koordinieren kann, nicht bekannt.
Die Sertiernexin-Familie (SNX) ist eine evolutionär konservierte Klasse von Proteinen, die für viele Vesikeltransportreaktionen in der Zelle3,4,5kritisch sind. Sortiernvonnexine werden an die Endosome-Membran rekrutiert und helfen bei der Ladungsaufnahme über ihre charakteristische Phox-Homologie(PX)-Domäne, die Phosphatidylinositol-3-Monophosphat (PtdIns(3)P bindet, ein Lipid, das an der Endosome-Membran angereichert ist. Säugetiere kodieren 33 SNX-Proteine, die je nach Vorhandensein andererDomänenweiter in mehrere Unterfamilien unterteilt werden können. Vor allem die SNX-BAR-Unterfamilie ist die größte Unterfamilie, die aus zwölf menschlichen Unterfamilien besteht, während in der aufkeimenden Hefe Saccharomyces cerevisiaedie Unterfamilie auf nur sieben SNX-BARs reduziert wird. SNX-BAR-Proteine haben sowohl eine PX-Domäne als auch eine Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR)-Domäne, die Lipidreservoirs auslöst, um positive Krümmungsmembranen zu binden. Folglich hat die SNX-BAR-Familie eine natürliche Affinität zum Endosom und kann die ETC-Bildung über ihre Membran-Remodellierungsfähigkeiten vermitteln. In vitro können die Remodellierungseigenschaften von SNX-BARs durch Zugabe von gereinigten SNX-BARs zu synthetischen Liposomen induziert werden und die anschließende Bildung schmaler, beschichteter Tubuli kann durch Elektronenmikroskopie visualisiert werden. Mit diesen Methoden haben die Forscher festgestellt, dass sowohl die Oligomerisierungskonzentration als auch die Verengungsfestigkeit in der SNX-BAR-Familie zu variieren scheinen, was darauf hindeutet, dass sie sowohl bei der Bildung als auch bei der Sission von ETCs helfen könnten.
Die SNX-BARs können weiter nach ihren exklusiven Dimerisierungseigenschaften klassifiziert werden. In-vitro-Bindungstests und Strukturstudien haben gezeigt, dass SNX-BAR-Proteine nur spezifische Homodimere oder Heterodimere bilden können. Daher könnte grundsätzlich jedes potentielle SNX-BAR Dimer-Oligomer einen Tubulenmantel für einen ladungsspezifischen Handelsweg liefern und ebenso kann die eingeschränkte Oligomerisierung der anderen SNX-BAR-Protomere auch unterschiedliche Exportwege definieren. Aufgrund der großen Anzahl von SNX-BARs und der Vielfalt innerhalb der SNX-Familie ist eine Einzige-Sortierung nexin-one-Frachthypothese jedoch höchst unwahrscheinlich. Stattdessen ist eine koordinierte Anstrengung mit einer Vielzahl von Faktoren wie SNX-BARs, Fracht, Lipidspezifität und anderen Abhängigkeiten wahrscheinlicher. Ebenso ergaben neuere Studien der Hefe-SNX4-Familie Hinweise auf zusätzliche Lipidspezifität, über PtdIns(3)P hinaus, um Endosome-Transportträger zu potenzieren6. In dieser Studie wurde SNX-BAR Homodimer Mvp1-Mvp1 von Bakterien gereinigt und native Heterodimere Snx4-Atg20 und Vps5-Vps17 wurden in hoher Ausbeute aus Hefe exprimiert und gereinigt, während nur Snx4-Atg20 gefunden wurde, um phosphatidylserin (PS) bevorzugt zu binden und in Liposomenbindungsstudien schmale röhrenartige Strukturen zu bilden6. Während andere auf diesem Gebiet wichtige Eigenschaften der SNX-BARs mit rekombinant gereinigten SNX-BAR-Homodimeren von Bakterien aufgedeckt haben, hat die Toxizität, die mit der Exzessierung von SNX-BAR-Heterodimeren in ähnlichen Systemen verbunden ist, ihre native Charakterisierung7,8,9,10behindert. Daher müssen Forscher ohne ein zuverlässiges System, um rekombinant eduzierte native Heterodimere zu erhalten, auf diese Untersuchungslinien verzichten. In Abbildung 1präsentieren wir einen vierteiligen Workflow zu 1) konstruieren einen Hefestamm, der SNX-BAR-Heterodimere zur Tandemaffinitätsreinigung überexprimiert, 2) native SNX-BAR-Heterodimere ausdrücken und reinigen, 3) unilamellare synthetische Liposomen vorbereiten und 4) einen Liposomentubulations- oder Sedimentations-Assay einrichten, der ein wichtiges Werkzeug für Forscher darstellt, um den wachsenden Katalog von Nexinen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m PC-Membranen</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Poly-Prep Chromatographiesäule (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>27 G Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Zentrifugalfilter mit 10K Cutoff</td><td>Amicon</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenisator</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td></td></tr><tr><td>BCA Assay</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Optima MAX-XP Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Schar</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPS</td><td>Avanti</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol (Sigma)</td><td>Sigma</td><td>47130-U</td><td></td></tr><tr><td>Extruder Set mit Block 0.2 &mu; L/1 mL</td><td>Avanti</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>FEI Tecnai F20 Transmissionselektronenmikroskop (200 kV)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glaskulturröhrchen</td><td>VWR</td><td>47729-570</td><td></td></tr><tr><td>IgG-Sepharosekügelchen (GE Healthcare)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikrolter-Glasspritzen</td><td>Hamilton</td><td>7637-01</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Excella E25</td><td>Eppendorf</td><td>M1353-0000</td><td>oder gleichwertig Schütteln 30 & Grad; C</td></tr><tr><td>Ni-NTA Magnetische Agarose-Perlen</td><td>Pierce</td><td>78605</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-076</td><td></td></tr><tr><td>PI3P</td><td>Echelon</td><td>P-3016</td><td>oder gleichwertige Echelon-Flaschenbaugruppe</td></tr> aus <tr><td>Polycarbonat</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100 mit festem Winkel Rotor</td><td>Beckman Schar</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>Typ 45 Ti Rotor</td><td>Beckman Schar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuumexsikkator, Boden und Deckel mit Steckdosenventil</td><td>VWR</td><td>75871-436</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumpumpe Alcatel (Pascal 2005 C1)</td><td>A& J Vacuum</td><td>PN07050</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mit Schaumstoffhalter</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr><tr><td>VWR KIT MICROTUBE</td><td>VWR</td><td>12620-880</td><td></td></tr></tbody></table>

expression, reinigung und liposomenbindung von angehenden hefe-snx-bar-heterodimeren

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

SNX-BAR-Proteine sind eine evolutionär konservierte Klasse von Membran-Remodeling-Proteinen, die eine Schlüsselrolle bei der Sortierung und dem Handel mit Proteinen und Lipiden während der Endozytose, der Sortierung innerhalb des endosomalen Systems und der Autophagie spielen. Zentral für die SNX-BAR-Proteinfunktion ist die Fähigkeit, Homodimere oder Heterodimere zu bilden, die Membranen mit hochkonservierten Phox-Homologie-Domänen (PX) und BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) binden. Darüber hinaus kann die Oligomerisierung von SNX-BAR-Dimern auf Membranen die Bildung von Membrantubuli und Vesikeln auslösen, und diese Aktivität wird angenommen, dass sie ihre Funktionen als Mantelproteine für Endosomen-abgeleitete Transportträger widerspiegelt. Forscher haben lange In-vitro-Bindungsstudien mit rekombinanten SNX-BAR-Proteinen an synthetischen Liposomen oder riesigen Unilamellar-Vesikeln (GUVs) verwendet, um die genaue Zusammensetzung von Lipiden zu enthüllen, die für die Remodellierung der Membran erforderlich sind, und so ihren Wirkmechanismus zu offenbaren. Aufgrund technischer Herausforderungen mit dualen Expressionssystemen, der Toxizität der SNX-BAR-Proteinexpression in Bakterien und der schlechten Löslichkeit einzelner SNX-BAR-Proteine haben die meisten Bisherigen Studien SNX-BAR-Homodimere untersucht, einschließlich nicht-physiologischer Dicher, die sich während der Expression in Bakterien bilden. Kürzlich haben wir ein Protokoll optimiert, um die großen Mängel eines typischen bakteriellen Expressionssystems zu überwinden. Anhand dieses Workflows zeigen wir, wie man große Mengen von SNX-BAR Heterodimeren erfolgreich ausdrückt und reinigt und wie man sie auf synthetischen Liposomen für Bindungs- und Tubulationstests rekonstituiert.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur reproduzierbaren und robusten Herstellung von endogenen Hefe-SNX-BAR-Komplexen, die für nachgeschaltete Membran-Remodellierungstests verwendet werden können (Abbildung 1). Die Konstruktion des Hefestamms, der zur Reinigung verwendet wird, nutzt die Effizienz der homologen Rekombination in angehender Hefe und ermöglicht Modifikationen an der genomischen Loci der gezielten SNX-BARs (Abbildung 2<...

Hier stellen wir einen Workflow für die Expression, Reinigung und Liposomenbindung von SNX-BAR Heterodimeren in Hefe vor.

Expression, Reinigung und Liposomenbindung von angehenden Hefe-SNX-BAR-Heterodimeren

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BARs sind Membran-Remodeling-Proteine, die eine Schlüsselrolle bei menschlichen Krankheiten spielen. Mit unseren Methoden können wir ihre präzisen biophysikalischen Eigenschaften bestimmen, um die Lipidbindung und den Membranumbau zu erleichtern. Die Reinigung der SNB-BAR-Proteine aus Hefezellen ermöglicht den Erwerb nativer Homo- und Hetero-SNX-BAR-Dimere bei gleichzeitiger Minimierung der Toxizität und Unlöslichkeit, die häufig bei nicht nativen Expressionssystemen auftritt.Unsere Methoden können verwendet werden, um die Lipidspezifitäten aller Hefe-SNX-BARs zu verstehen oder rekombinante SNX-BAR-Proteine aus jedem anderen Organismus zu produzieren. Eine korrekte Extruderbaugruppe ist unerlässlich, um Liposomenverlust während des Extrusionsprozesses zu verhindern. Für Anfänger oder Neulinge im Bereich wird die visuelle Beobachtung der kritischsten Schritte Ihre Erfolgsaussichten erheblich verbessern.Beginnen Sie mit der Impfung eines großen Tupfers von Hefezellen in einen Kolben mindestens viermal so viel wie das Volumen der Kultur mit 50 MilliliterN Standard-YP-Medium mit 2%Raffinose und 0,1% Glukose als Kohlenstoffquelle ergänzt und wachsen die Kultur über Nacht in einem 30 Grad Celsius Shaker. Am nächsten Morgen impfen Sie die 50-Milliliter-Vorkultur in einem Liter Standard-YP-Medium mit 2%raffinose und 0,1% Glukose in einem 2,8 Liter Volumen verblüfft fernbach Kolben für eine vier- bis fünfstündige Kultur im Schüttel-Inkubator. Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,2 erreicht, fügen Sie Galaktose zu einer Endkonzentration von 2% zu den Zellen für eine Nachtkultur im Schüttelinkubator hinzu.Am nächsten Morgen ernten Zellen durch Zentrifugation und übertragen sie das Hefepellet in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Setzen Sie das Pellet in 15 MilliliterReinigungspuffer auf, um ein Endvolumen von etwa 30 Millilitern zu erreichen, und laden Sie die Zellsuspension auf einen homogenisator, gekühlt auf vier Grad Celsius. Lyse die Proben bei 20 bis 25, 000 Pfund pro Quadratzoll für zwei bis drei Runden und übertragen Sie das Lysat in eine neue 50 Milliliter konische Röhre auf Eis.Löschen Sie das Zelllysat sofort durch Zentrifugation und übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Rohr. Als nächstes gleicht man 300 Mikroliter IgG Sepharose Perlen mit drei Resuspensionen im Reinigungspuffer aus, bevor die Perlen für eine zweistündige Inkubation mit vier Grad Celsius in das gereinigte Zelllysat eingebracht werden. Am Ende der Inkubation fügen Sie die Perlen zu einer 10-Milliliter-Chromatographiesäule hinzu und lassen Sie das ungebundene Lysat durchfließen.Waschen Sie die Perlen 10 Mal mit einem Milliliter Waschpuffer pro Wäsche, so dass jede Wäsche vollständig durchfließen kann, bevor sie das nächste Volumen hinzufügt. Nach der letzten Wäsche verwenden Sie eine Pipette und einen frischen Puffer, um die Perlen in ein Mikrozentrifugenrohr zu übertragen. Bringen Sie das Gesamtvolumen der Perlen auf 500 Mikroliter mit frischem Waschpuffer und entfernen Sie die Perlen aus dem Lysat mit zwei Mikrolitern von 10 Milligramm pro Milliliter TEV Protease für eine nächtliche Inkubation mit Rotation bei vier Grad Celsius.Verwenden Sie am nächsten Morgen eine 27-Spur-Nadel, um den Überstand vollständig zu entfernen und die Proteinreinheit um 10% Polyacrylamid-SDS-Seite zu bewerten. Dann quantifizieren Sie die konzentrierten Proteine mit dem Bradford-Protein-Assay nach Standardprotokollen und speichern Sie das Protein bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius. Um die Liposomen vorzubereiten, verwenden Sie Glasspritzen, um Stocklipide in ein sauberes Glaskulturrohr zu übertragen, um eine endgültige Lipidmischung von 1%Phosphatidylinositol-3-Phosphat, 20%Ergosterol, 30%Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin, wie in der Tabelle beschrieben, zu erreichen.Je nach Lösungsmittel nionenin jedem Lipid kann sich das Gemisch bei Zugabe jedes Lipids trüb drehen. Trocknen Sie die Lipidmischungen vorsichtig aus, indem Sie strömungsarmes Stickstoffgas in einer kreisförmigen Bewegung auf die Gemischs lenken, um die Lipide am Boden des Glasrohres gleichmäßig zu behandeln. Dann wickeln Sie das Glaskulturrohr mit Folie, die die Öffnung freigelegt lässt und die Lipide eine Stunde lang in einem Vakuum weiter dehydrieren.Am Ende der Inkubation 400 Mikroliter Bindungspuffer in jede Durchstechflasche geben, um die Lipide bei einer endgültigen Liposomenkonzentration von 2,5 Millimolar vollständig zu rehydrieren, bevor die Lipide bei mittlerer Geschwindigkeit auf einem Wirbel bei Raumtemperatur 30 Minuten wieder aufgesetzt werden. Der Puffer sollte trüb werden, wenn die Lipide resuspendiert werden. Die resuspendierten Liposomen in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen und die Rohre in flüssigem Stickstoff einfrieren, gefolgt vom Sieben- bis Achtfachen Auftauen in einem 37 Grad Celsius Wasserbad.Reinigen Sie in einer chemischen Rauchhaube zwei Ein-Milliliter-Glasspritzen mit einem vollen Chloroformvolumen dreimal pro Spritze, um Restlipide zu entfernen und jede Spritze mit zwei Volumen Reinstwasser und zwei Volumen Bindungspuffer auszustatten. Montieren Sie einen Mini-Extruder gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Dann tauchen Sie zwei Teile filterträger in einer 200 Nanometer Membran in Bindungspuffer.Es ist wichtig, den Mini-Extruder so zu montieren, dass er vollständig luftdicht ist. Und eine gute Möglichkeit, auf Lecks zu überprüfen, ist Puffer durch das Gerät zu übergeben. Sandwich die Membran zwischen den Filterstützen und legen Sie die Membran in den Mini-Extruder.Mit einer der gleichförmigen Ein-Milliliter-Spritzen, übergeben Sie ein Volumen von Bindungspuffer ähnlich dem Volumen der Liposomenmischung durch den Mini-Extruder und verwenden Sie die andere Spritze, um die Liposomenmischung invertieren das Mikrozentrifugenrohr fallen zu lassen, um die letzten Liposomen in die Rohrkappe für ihre Sammlung zu sammeln. Dann extrudieren Sie die Liposomen 19 bis 21 Mal durch die 200-Nanometer-Membran und sammeln Sie die extrudierten Liposomen in ein neues Mikrozentrifugenrohr. Vor der Durchführung der SNX-BAR Liposomenbindungs- und Tubulationstests sollten Sie das gereinigte Protein durch Ultrazentrifugation vorklären und das Überstand in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen, ohne das Pellet zu stören.Als nächstes inkubieren Sie vier Mikromolar von gereinigtem SNX4-ATG20 und 2,5 Millimolar Liposomen in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 Mikrolitern für eine 30-minütige Inkubation bei 30 Grad Celsius. Um die Liposomentubulation am Ende der Inkubation zu visualisieren und zu quantifizieren, erkennen Sie die Proben sofort auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfernetzgitter und negativem Fleck mit 1%uranylacetat. Analysieren Sie dann die Proben auf einem Transmissionselektronenmikroskop mit 200 Kilovolt.Zur Liposomenbindung und Sedimentation 20 Mikroliter der Reaktion auf ein Polycarbonatzentrifugenrohr übertragen und die Probe mit einem kompatiblen Router in einer Ultrazentrifuge drehen. Am Ende der Zentrifugation den Überstand vorsichtig auf ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen und das Pellet in 40 MikroliterS SDS-Seitenprobenpuffer wieder aufhängen. Übertragen Sie die Pelletsuspension in ein neues Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie dem Überstand 20 Mikroliter Probenpuffer hinzu.Dann laden Sie gleichwertige Probenvolumina von Pellet und Überstand auf ein 10%Polyacrylamid SDS Seitengel und führen Sie Coomassie Färbung durch, um die an die Liposomen gebundenen SNX-BARs zu visualisieren. Um die korrekte Induktion der SNX-BAR-Expression zu überprüfen, kann ein westlicher Fleck gegen das Tandem-Affinitätsreinigungs-Tag verwendet werden, da der Proteingehalt der SNX-BARs nicht über Coomassie-Färbung nachgewiesen werden kann. Nach der Reinigung des SNX-BAR Heterodimers sollten die Bänder der beiden SNX-BARs in einem eins-zu-eins stoichiometrischen Verhältnis erscheinen und es sollte wenig bis gar keine kontaminierenden Bänder geben.In dieser repräsentativen Analyse wurden SNX-BAR-Heterodimere exprimiert, gereinigt und an synthetische Liposomen gebunden, wie gezeigt. Beachten Sie, dass MVP1 Homodimere bildete und wie erwartet in Bakterien exprimiert wurde. SNX-BAR-Bindung an unterschiedliche Liposomenzusammensetzungen könnte durch Densitometrie quantifiziert werden, um die Wirkung von Phosphatidylserin beispielsweise auf die Liposomenbindung zu bewerten.Die Elektronenmikroskopie-Bildgebung ermöglicht die Messung von SNX4-ATG20-Liposomen-Tubuli mit den meisten Tubuli, die typischerweise Durchmesser zwischen 14 und 26 Nanometern besitzen. Beachten Sie, dass gereinigte SNX-BARs mit Frachterfassungskomplexen auf Liposomen rekonstituiert werden können, um zu verstehen, wie vollständige Baugruppen den Membranumbau beeinflussen können. Beim Vergleich der Bindung verschiedener Kombinationen von gereinigten SNX-BAR-Dimern an synthetische Liposomen, die aus verschiedenen Lipiden bestehen, wurden SNX-BAR-Proteine mit unterschiedlichen Lipidbindungspräferenzen gefunden.Arbeiten Sie immer in einer Haube beim Umgang mit Chloroform und achten Sie darauf, die richtige PSA zu tragen, wenn Sie mit Scharfen oder Glasmaterial umgehen.

expression-purification-liposome-binding-budding-yeast-snx-bar

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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Expression, Reinigung und Liposomenbindung von angehenden Hefe-SNX-BAR-Heterodimeren

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