Analyse von viralen SSHHPS der Gruppe IV mit In-vitro- und Silico-Methoden

Wir haben gezeigt, dass virale Genome der Gruppe IV kurze Strecken von Wirtsproteinsequenzen kodieren. Diese Sequenzen können innerhalb der viralen Protease-Spaltungsstellen gefunden werden. Sie werden für die gezielte Zerstörung von Wirtsproteinen verwendet, in der Regel Proteine, die an der Erzeugung der Immunantworten beteiligt sind.

Ein großer Vorteil der Verwendung von Protease-Assays ist, dass es die Komplexität einer Zelle entfernt und zeigt, ob eine virale Protease eine bestimmte Sequenz spalten kann oder nicht. Als wir also Zika SSHHPS-Sequenzen analysierten, fanden wir heraus, dass die Protease Sequenzen in Proteinen schneiden konnte, die an der Erzeugung von Immunreaktionen beteiligt waren, und dass einige dieser Proteine auch Rollen in der Gehirn- und Augenentwicklung spielten. Bei der Durchführung dieser Technik zum ersten Mal, sollte man daran denken, dass, wenn Spaltung nicht beobachtet wird, dass es aufgrund einer Vielzahl von Faktoren wie die Aktivität der Protease sein kann.

Demonstriert wird das Verfahren von Jaimee Compton, einem Techniker aus meinem Labor. Beginnen Sie mit dem Öffnen von Protein BLAST und legen Sie die 20 Aminosäuren um die sissile Bindung und das virale Polyprotein und wählen Sie nicht-redundante Proteinsequenzen aus, und geben Sie dann das zu durchsuchende Wirtsgenom ein. Wählen Sie bei Bedarf PHI-BLAST aus und geben Sie eine Mustersequenz ein, in der eckige Klammern darauf hinweisen, dass sich eine der Aminosäuren innerhalb der Klammern an der Ersatzposition befinden kann, und dann auf BLAST drücken.

Ordnen Sie die BLAST-Treffer basierend auf der Anzahl der aufeinanderfolgenden identischen oder tolerierten Rückstände an, die einer Spaltungs-Standortsequenz entsprechen. Wählen Sie aus der Liste die Proteine aus, die sechs oder mehr identische oder ähnliche Rückstände enthalten, um sie in den Protease-Assays zu analysieren. Konstruieren Sie ein Plasmid, das das Cyanfluoreszenzprotein, bis zu 25 Aminosäuren der Spaltungssequenz und das gelbe fluoreszierende Protein kodiert.

Als nächstes bereiten Sie die CFP- und YFP-Substrate vor, indem Sie vier Vier-Liter-Flaschen mit 25 Millilitern einer Nachtkultur impfen. Schütteln Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius und überwachen Sie das Wachstum stündlich durch UV-Vis-Spektroskopie bei 600 Nanometern. Wenn die Bakterien eine Absorption von etwa einem erreichen, induzieren Sie die Proteinexpression, indem Sie 0,5 Milliliter eines Molaren IPTG zu jedem Kolben hinzufügen, senken Sie dann die Temperatur des Schüttelinkubators auf 17 Grad Celsius und lassen Sie die Expression über Nacht für 17 bis 20 Stunden fortsetzen.

Am nächsten Tag pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 7000 mal g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Entfernen und entsorgen Sie die flüssigen Medien, dann speichern Sie die Pellets bei minus 80 Grad Celsius oder fahren Sie mit der Zelllyse fort. Um die Zellen zu lysieren, bereiten Sie 100 Milliliter Lysepuffer nach Manuskriptrichtungen vor, setzen Sie die Pellets im Puffer wieder auf und übertragen Sie 25 bis 25 Milliliter der Suspension in 50 Milliliter Einwegkonische Rohre.

Legen Sie die Rohre in einen Kunststoffbecher mit Eiswasser und legen Sie dann die Beschallungsspitze in das Rohr ein, so dass die Spitze etwa einen Zentimeter vom Boden des Rohres entfernt ist, und beschallen Sie das Lysat 10 bis 20 Mal, bis es flüssig und verflüssigt wird. Nach der Beschallung das Lysat auf Hochgeschwindigkeitszentrifugenrohre übertragen und bei 20, 500 x g 30 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand in eine saubere Flasche geben und die Pellets entsorgen.

Laden Sie das Lysat auf die Nickelsäule und waschen Sie dann die Säule mit zwei Säulenvolumen des Puffers A, gefolgt von fünf Spaltenvolumen von 20%Puffer B.Die Absorption bei 280 Nanometern nimmt während der Wäsche zu, da die Verunreinigungen aus der Säule entfernt werden. Fahren Sie mit dem Waschen fort, bis A280 zu den Basiswerten zurückkehrt. Dann elute das Protein mit zwei bis drei Spaltenvolumen von 100%Puffer B und sammeln 10 Milliliter Fraktionen, um sicherzustellen, dass die A280 jeder Fraktion zu messen.

Bereiten Sie acht Reaktionen mischungen nach Manuskript Richtungen und Pipette 45 Mikroliter jeder Mischung in die ersten drei Brunnen jeder Reihe einer schwarzen Halbfläche 96-Well-Platte. Richten Sie den Plattenleser für die gleichzeitige Erkennung von Blütenstand bei zwei Wellenlängen mit einer festen Photomultiplier-Rohreinstellung ein. Programmieren Sie die Lesezeit auf 20 bis 30 Minuten mit einem Lese-pro-Minute und wählen Sie die zu lesenden Brunnen aus.

Setzen Sie die Platte in die Maschine ein und starten Sie die Lese, indem Sie die Emissionsverhältnisse im Laufe der Zeit überwachen. Führen Sie einen Endpunkt aus, der die Platte liest, die das ungeschnittene Substrat enthält. Entfernen Sie die Platte und Pipette fünf Mikroliter Enzym in jedem Brunnen.

Man kann die erste Spalte als ungeschnittenes Steuerelement speichern. Lesen Sie dann die Platte 20 bis 30 Minuten lang erneut, um den Plattenleser auf die Ausgabe absoluter Werte einzustellen. Sobald die Auslesung abgeschlossen ist, versiegeln Sie die Platte mit Folie, um Verdunstung zu verhindern, und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur, damit das Enzym das Substrat vollständig schneiden kann.

Entfernen Sie nach 24 Stunden den Film und führen Sie einen Endpunktauslesung der Platte durch. Durchschnittlich die Emissionsverhältnisse und notieren Sie sie als schnitt. Bestätigen Sie die Spaltung des Substrats mit SDS-PAGE.

Laden Sie einen Molekulargewichtsmarker in die erste oder letzte Spur und laden Sie fünf Mikroliter jedes Reaktionsgemisches in eine Spur des Gels, beginnend mit der ungeschnittenen Reaktion. Befestigen Sie die Elektroden des Geltanks an der Stromversorgung und führen Sie die Produkte 60 Minuten lang bei 110 Volt aus. Entfernen Sie das Gel mit einem Risswerkzeug aus der Kassette und tauchen Sie es in fünf bis 10 Milliliter Färbelösung ein.

Nach ein bis 24 Stunden den überschüssigen Fleck entfernen und das Gel in Wasser tauchen. Dann machen Sie ein Bild des Gels mit einem Gel-Imager. Um die Proteinstruktur vorzubereiten, laden Sie die Protein-PDB-Datei in MOE.

Klicken Sie auf Auswählen und Lösungsmittel, und löschen Sie dann das Lösungsmittel. Öffnen Sie das Bedienfeld Struktur pVorbereitung in der oberen Menüleiste Berechnen, und korrigieren Sie automatisch alle Strukturelemente, indem Sie auf Korrigieren klicken. Protonieren Sie die Struktur, indem Sie auf Protonate 3D klicken.

Fügen Sie dem Protein Teilladungen hinzu, indem Sie das Bedienfeld "Teilladungen" öffnen und AMBER 99 auswählen und Wasserstoffe und Einzelpaare nach Bedarf anpassen. Speichern Sie dann die Strukturdatei. Um die Struktur für die Substratpeptide und TRIM14 zu erstellen, öffnen Sie das Protein Builder-Panel, geben Sie die Substratsequenz ein, und wählen Sie Auto Repack aus.

Legen Sie als Nächstes Geometrie als Erweitert fest und klicken Sie auf Build. Minimieren Sie schließlich die Struktur und speichern Sie sie als PDB-Datei. Docken Sie die Substratpeptide mit der PyRx AudoDock 4.2 Software an VEEV-nsP2 an.

Laden Sie das Protein, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Namen, und wählen Sie Makromolekül erstellen aus, um die PDBQT-Dockingdatei vorzubereiten. Dann laden Sie das Substratmolekül und wählen Sie Ligand machen, um die Ligandendocking-Datei vorzubereiten. Starten Sie den AutoDock-Assistenten auf dem Docking-Panel unten und wählen Sie die vorbereiteten Liganden- und Proteindateien aus.

Definieren Sie die Proteinbindungstasche, indem Sie die Rasterdimension manuell anpassen und dann AuotGrid ausführen. Führen Sie als Nächstes AutoDock aus, und wählen Sie die Lamarckian genetische Algorithmusmethode aus. Klicken Sie auf Docking-Parameter und legen Sie die Anzahl der GA-Läufe auf 50 fest, und klicken Sie dann auf Vorwärts, um den Docking-Lauf zu starten.

Wenn AutoDock abgeschlossen ist, öffnen Sie das Bedienfeld Ergebnisse analysieren, und überprüfen Sie alle vorhergesagten Bindungsposen. Wählen Sie das beste Modell mit der niedrigsten vorhergesagten Bindungsenergie und vernünftigen Bindungswechselwirkungen zwischen cis-477 und Substrat auf der Spaltungsstelle aus und speichern Sie es dann als PDB-Datei für weitere MD-Simulationen. Nach dem Lesen der Bindungsposen mit AutoDock ist es wichtig, eine Post-Docking-Analyse durchzuführen, um das plausible Bindungsmodell für die Verfeinerung mit MD-Simulationen zu identifizieren.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um kurze Abschnitte homologe Wirt-Pathogen-Proteinsequenzen oder SSHHPS im Zika-Virus ns2B/3 Protease zu finden. Vier Wirtsproteinziele wurden identifiziert. FOXGS, SFRP1, eine Gsalpha-Untereinheit aus einer retinalen cDNA-Bibliothek, und die NT5M mitochondriale 5'3'nukleotidase.

Sequenzausrichtungen der SSHHPS erlaubten artspezifische Unterschiede in den Spalt-Standortsequenzen. Die SFRP1-Sequenz war bei Menschen und Hühnern identisch, was bemerkenswert ist, da das Zika-Virus Sterblichkeit und Mikrozephalie in Hühnerembryonen auslösen kann. Der kontinuierliche Assay wurde verwendet, um stetige Zustand kinetische Parameter und Hemmungskonstanten für die viralen Polyproteinsequenzen zu messen und der diskontinuierliche Assay wurde verwendet, um qualitative Spaltungsinformationen zu erhalten, wie z. B. Die Spaltung einer bestimmten Sequenz oder die Hemmung der Protease durch verschiedene Verbindungen.

Ein Modell der venezolanischen Pferdeenzephalitis nsP1-nsP2 Kreuzung wurde mit Silico-Methoden gemacht. Bei der nsP2-Protease führte die Verlängerung der Substratsequenz und die Verringerung der Ionenstärke des Puffers zu einer signifikanten Verringerung der Michaelis-Konstante der Spaltung einer Semliki Forest Virussequenz. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Steuerelemente auszuführen.

Substrate, die die viralen Proteasespaltungs-Standortsequenzen enthalten, sollten getestet werden, bevor die SSHHPS-Sequenzanalyse fortgesetzt wird. Wenn die Spaltung eines Wirtsproteins beobachtet wird, sollten Folgeexperimente durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass dieses Wirtsprotein die Virusreplikation beeinflusst. Dies kann durch Überexpression oder Silencing des Proteins erfolgen und dann die Auswirkungen auf die Virusreplikation untersucht werden.

Gruppe IV enthält eine große Anzahl neuer und neu auftretender Krankheitserreger. Die SSHHPS-Sequenzen verknüpfen bestimmte Wirtsproteine und -wege sehr vorhersehbar mit den viralen Proteasen.