In Vitro-Bewertung der Herzfunktion mit gehäuteten Kardiomyozyten

Diese Technik ermöglicht die Klärung der Pathophysiologie von Herzerkrankungen durch die Untersuchung der Korrelation zwischen in vitro und in vivo Parametern in Tiermodellen und beim Menschen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Funktion tiefer Myofilamente mit sehr kleinen Biopsien oder Proben ermöglicht, die gefroren gelagert wurden. Diese Technik ermöglicht es, in vitro die Auswirkungen therapeutischer Eingriffe auf Myofilamente zu beurteilen.

Bevor Sie ein Experiment versuchen, ist es ratsam, die Kardiomyozytenextraktion einige Male zu üben, um zu lernen, wie man die Kardiomyozyten mit guter Größe, Streifenbildung und Form auswählt, klebt und aktiviert. Stellen Sie vor Beginn des Vorgangs die Temperatur des Prüfgeräts in der Kammer auf 15 Grad Celsius ein und schalten Sie den Kraftaufnehmer und den Motor ein. Tauen Sie drei bis fünf Mikrogramm Myokardprobe in einer Petrischale mit 2,5 Millilitern Relax-ISO-Lösung auf und schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell präzise in kleine Stücke, ohne unnötige Zellschäden zu verursachen.

Wenn das gesamte Gewebe geschnitten wurde, übertragen Sie mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze das gesamte Volumen der Lösung und der Gewebefragmente in ein Potter-Elvehjem-Glas und verwenden Sie eine Schleifmaschine, um das Gewebe mit 30 bis 40 Umdrehungen pro Minute mechanisch aufzubrechen. Wenn eine gute Zellsuspension erhalten wurde, geben Sie 250 Mikroliter Triton in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 2,25 Millilitern Relax ISO und fügen Sie die Zellsuspension der resultierenden Lösung hinzu. Drehen Sie das Röhrchen dreimal vorsichtig um, um es zu mischen, und lassen Sie es eine Minute lang bei Raumtemperatur stehen, gefolgt von einer vierminütigen Inkubation auf Eis.

Am Ende der Eisinkubation wird das endgültige Volumen des Röhrchens auf 15 Milliliter mit zusätzlichem Relax-ISO erhöht und die Röhrchen wie gezeigt dreimal durch Inversion gemischt, dann die Zellen zentrifugiert und dann vorsichtig fast die gesamte Flüssigkeit mit Ausnahme der letzten drei Milliliter des Überstands entfernt. Entfernen Sie nach dem letzten Auswaschen den Überstand bis zu einem Volumen von fünf bis 10 Millilitern Zellsuspension. Für die Auswahl der gehäuteten Kardiomyozyten geben Sie einen Tropfen Zellsuspension auf ein Deckglas, das auf einem Objektträger in einem inversen Objektträgerhalter platziert wird, und verwenden Sie das 20X-Objektiv, um einen einzelnen stäbchenförmigen Kardiomyozyten mit einem guten Streifenmuster und einer guten Größe auszuwählen.

Drehen Sie das Deckglas mit zwei Händen, bis der ausgewählte Kardiomyzyt horizontal positioniert ist und seine Enden mit der Nadel des Kraftaufnehmers und dem Motor ausgerichtet sind, und tragen Sie mit einer Pipettenspitze eine dünne Klebelinie an der Seite des Deckglases auf. Um die Zelle an Ort und Stelle zu kleben, tauchen Sie die Nadelspitzen des Kraftaufnehmers und des Motors in die Klebelinie ein, um einen Klebehalo um beide Spitzen zu erzeugen, und bewegen Sie die Nadelspitze des Kraftaufnehmers schnell nach unten, so dass sie an einer Kante des Kardiomyozyten klebt. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit der Spitze des Motors und dem anderen Ende der Zelle.

Bewegen Sie nach fünf bis acht Minuten beide Mikromanipulatoren gleichzeitig, um die Nadeln um etwa 15 Mikrometer anzuheben, um ein Verkleben der Zelle mit dem Deckglas zu vermeiden. Um die aktiven und passiven Kräfte und die Kalziumempfindlichkeit zu messen, füllen Sie die erste Versuchsvertiefung mit 55 bis 100 Mikrolitern entspannender Lösung und füllen Sie die zweite Versuchsvertiefung mit 55 bis 100 Mikrolitern aktivierender Lösung. Stellen Sie mit der Kamerasoftware den interessierenden Bereich auf einen Bereich des Kardiomyozyten mit einem klaren Streifenmuster ein und stellen Sie die Sarkomerlänge auf 2,2 Mikrometer ein.

Messen Sie den Abstand zwischen den beiden Extremen des Kardiomyozyten und zeichnen Sie den Wert als Myozytenlänge in der Software auf. Bewegen Sie dann die Nadeln etwas höher und bewegen Sie den Mikroskoptisch vorsichtig, so dass sich die Zelle vom Deckglas in die Vertiefung mit der entspannenden Lösung auf der Rückseite des Tisches bewegt. Wählen Sie das Protokoll aus, das zwei Zellverkürzung enthält, die auftreten soll, wenn die Zelle nacheinander in den Kalzium- und Entspannungslösungen ausgestoßen wird.

Um eine isometrische Kontraktion hervorzurufen, bewegen Sie den Mikroskoptisch so, dass sich der Kardiomyozyten von der entspannenden zur aktivierenden Lösung bewegt. Wenn Sie das Kraftplateau erreicht haben, beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Kraftdaten. Schalten Sie die Zelle nach 10 Sekunden auf die entspannende Lösung und zeichnen Sie die Daten auf, bis der Test stoppt.

Um die Calciumsensitivität zu bestimmen, ersetzen Sie die aktivierende Lösung durch 55 bis 100 Mikroliter jeder Calciumlösung und notieren Sie die Daten wie gerade demonstriert. Dehnen Sie am Ende der Messung die Spitzen des Kraftaufnehmers und des Motors, um die Nadeln aus der Zelle zu entfernen, und entfernen Sie mit einem in Aceton getränkten Wattestäbchen vorsichtig den Leimhalo von den Nadelspitzen. Obwohl nach längeren Experimenten ein gewisses Maß an Verschlechterung und Kraftabnahme zu erwarten ist, sollten die Werte der aktiven Spannung innerhalb der funktionellen permeabilisierten Kardiomyozyten relativ stabil sein.

Hier sind repräsentative Kraftspuren von drei von acht Kraftaufzeichnungen dargestellt, die für die Durchführung eines Protokolls der Myofilament-Calciumsensitivität erforderlich sind. Durch das Übertragen der Zelle in eine Vertiefung, die die aktivierende Lösung enthält, beginnen die Kardiomyozyten, Kraft zu entwickeln, bis sie ein Plateau erreichen. Nach einem schnellen Durchhangtest können die Ausgangswerte der Kraft Null ermittelt werden.

Die Steigung des letzten Teils dieser Kurve kann verwendet werden, um den Wert der Geschwindigkeit der Kraftneuentwicklung zu bestimmen, die ein Maß für die scheinbare Geschwindigkeit des Verbindens und Lösens von Brücken ist. Nach dem Transfer der Zelle zurück in eine Vertiefung, die die entspannende Lösung enthält, entspannt sich die Zelle und ihre Kraft nimmt ab. Neben der Myofilament-Calciumsensitivität und den längenabhängigen Aktivierungsmessungen können die Sarkomerlängenabhängigkeiten der passiven Spannung und die Sarkomerlängenabhängigkeiten der calciumaktivierten Kraft pro Querschnittsfläche und der calciumunabhängigen Spannung berechnet werden.

Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass die Art und Weise, wie die Kardiomyozyten isoliert werden, die Ergebnisse erheblich beeinflusst. Die Verwendung von gehäuteten Kardiomyozyten zur Beurteilung der Herzfunktion in vitro ist eine wichtige Technik, um die auf Zellebene auftretenden Veränderungen zu klären und die Myofilamentmechanismen unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Zuständen zu untersuchen. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie eine minimale Menge an Myokardproben erfordert und die Verwendung von Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von Spezies, Herzlokalisationen und Pathologien ermöglicht.