Name: Vorbereitung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Ovarialgeweben für die quantitative Proteomik-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben mittels Differentialgeschwindigkeits- und Dichtegradientenzentrifugation. Diese Methode liefert hochwertige Proben für quantitative Proteomanalysen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Hunan Provincial Hundred Talent Plan (zu X.Z.), die Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (to XZ), die National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 und 81272798 to XZ), die Stipendien aus China "863" Plan Projekt (Grant-Nr. 2014AA020610-1 bis XZ) und die Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 14JJ7008 to XZ). X.Z. konzipierte das Konzept für das vorliegende Manuskript, erhielt die iTRAQ quantitativen Proteomik-Daten von Mitochondrienproben, schrieb und überarbeitete das Manuskript, koordinierte die entsprechende Arbeit und war für die finanzielle Unterstützung und die entsprechende Arbeit. H.L. bereitete Mitochondrienproben her. S.Q. nahm an Teilarbeiten teil. X.H.Z nahm am Schreiben und Bearbeiten der englischen Sprache teil. N.L. analysierte die iTRAQ Proteomics-Daten. Alle Autoren stimmten dem endgültigen Manuskript zu.

Für dieses Protokoll wurden Eierstockgewebe einschließlich Eierstockkrebsgewebe (n = 7) und normales Kontroll-Ovarialgewebe (n = 11) verwendet. Das vorliegende Protokoll3,4,5 ist von der Xiangya Hospital Medical Ethics Committee of Central South University, China, genehmigt.
1. Präparation von Mitochondrien aus menschlichem Eierstockkrebsgewebe
<ol><li>Vorbereiten 250 ml des mitochondrialen Isolationspuffers durch Mischen von 210 mM Mannitol, 70 mM Saccharose, 100 mM Kaliumchlorid (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM Diaminetetraessigsäure (EDTA), 0,1 mM Ethylenglykol bis(2-Aminoethylether)Tetraessigsäure (EGTA), 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) Proteaseinhibitor, 2 mM Natriumorthovanadate (V) und 0,2% Rinderserumalbumin (BSA), pH 7,4.</li>
	<li>Legen Sie 1,5 g Eierstockkrebsgewebe in eine saubere Glasschale.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml des vorgekühlten mitochondrialen Isolationspuffers hinzu, um das Blut von der Gewebeoberfläche 3x leicht zu waschen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine saubere Augenschere, um das Gewebe vollständig in ca. 1 mm3 Stück zu zerkleinern und das gehackte Gewebe in ein 50 ml Zentrifugenrohr zu übertragen.</li>
	<li>Fügen Sie 13,5 ml mitochondrialen Isolationspuffer mit 0,2 mg/ml Nagarse hinzu, und verwenden Sie dann einen elektrischen Homogenisator, um die Hackfleischgewebe (2 min, 4 °C) zu homogenisieren (Verwendung skalieren 2, 10 s 6x, Intervall 10 s).</li>
	<li>Fügen Sie weitere 3 ml mitochondrialen Isolationspuffer in die Gewebehomogenate und mischen Sie sie gut durch Pipettieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das vorbereitete Gewebe homogenat (1.300 x g, 10 min, 4 °C). Entfernen Sie die rohe Kernfraktion (d. h. das Pellet) und halten Sie den Überstand.</li>
	<li>Recentrifuge der Überstand (10.000 x g, 10 min, 4 °C). Entfernen Sie die Mikrosomen (d. h. den Überstand) und halten Sie das Pellet.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu und setzen Sie das Pellet durch leichte Pipettierung gut aus.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Pelletsuspension (7.000 x g, 10 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie die rohen Mitochondrien (d. h. das Pellet) auf.</li>
	<li>Fügen Sie 12 ml mit 25% Dichtegradientenmedium (d.h. Nycodenz) hinzu, um die extrahierten rohen Mitochondrien wieder auszusetzen.</li>
	<li>Machen Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten, indem Sie ein Rohr von unten nach oben mit 5 ml 34%, 8 ml von 30%, 12 ml von 25% (mit den rohen Mitochondrien ab Schritt 1,11), 8 ml von 23% und 3 ml 20% Dichtegradientenmedium und Zentrifuge (52.000 x g, 90 min, 4 °C) füllen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine lange und stumpfe Spritze, um die gereinigten Mitochondrien an der Schnittstelle zwischen dem 25% und 30% Dichtegradientenmedium in ein sauberes Rohr zu sammeln.</li>
	<li>Fügen Sie den mitochondrialen Isolationspuffer in die gesammelten Mitochondrien ein, um sie auf ein dreifaches Volumen zu verdünnen. Zentrifuge (15.000 x g, 20 min, 4 °C) und den Überstand entsorgen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Pellet wieder auszusetzen, und Zentrifuge (15.000 x g, 20 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet.</li>
	<li>Das endgültige Pellet (d.h. die gereinigten Mitochondrien) sammeln und bei -20 °C lagern. HINWEIS: Kombinieren Sie alle gereinigten Mitochondrien aus dem Eierstockkrebsgewebe als Mitochondrienprobe für die quantitative Proteomik-Analyse.</li>
</ol>2. Herstellung von Mitochondrien aus dem eierrischen Gewebe der menschlichen Kontrolle
<ol><li>Bereiten Sie 250 ml des mitochondrialen Isolationspuffers vor, wie in Schritt 1.1 beschrieben.</li>
	<li>Legen Sie 1,5 g des normalen Kontroll-Ovarialgewebes in eine saubere Glasschale.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml vorgekühlten mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Blut leicht von der Gewebeoberfläche 3x zu waschen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine saubere Augenschere, um das Gewebe vollständig in ca. 1 mm3 Stück zu zerkleinern und das gehackte Gewebe in ein 50 ml Zentrifugenrohr zu übertragen.</li>
	<li>Fügen Sie 8 ml 0,05% Trypsin/20 mM EDTA in phosphatgepufferter Saline (PBS) in das gehackte Kontrollgewebe und verdauen (30 min, Raumtemperatur), was hilft, das Gewebe und die Zellen zu lysieren und Mitochondrien freizusetzen. Dann Zentrifuge (200 x g, 5 min). Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie die Gewebe und Zellen auf.</li>
	<li>Fügen Sie 13,5 ml mitochondrialen Isolationspuffer mit 0,2 mg/ml Nagarse hinzu, und verwenden Sie dann einen elektrischen Homogenisator, um die Hackfleischgewebe (2 min, 4 °C) zu homogenisieren (Verwendung skalieren 2, 10 s 6x, Intervall 10 s).</li>
	<li>Fügen Sie weitere 3 ml mitochondrialen Isolationspuffer in die Gewebehomogenate und mischen Sie sie gut durch Pipettieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das vorbereitete Gewebe homogenat (1.300 x g, 10 min, 4°C). Entfernen Sie die rohe Kernfraktion (d. h. das Pellet) und halten Sie den Überstand.</li>
	<li>Recentrifuge der Überstand (10.000 x g, 10 min, 4°C). Entfernen Sie die Mikrosomen (d. h. den Überstand) und halten Sie das Pellet.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Pellet durch leichte Pipettierung gut auszusetzen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Pelletsuspension (7.000 x g, 10 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie die rohen Mitochondrien (d. h. das Pellet) auf.</li>
	<li>Fügen Sie 12 ml mit 25% DichteGradientenmedium hinzu, um die extrahierten rohen Mitochondrien wieder auszusetzen.</li>
	<li>Machen Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten, indem Sie ein Rohr von unten nach oben mit 8 ml von 38%, 5 ml von 34%, 8 ml von 30%, 12 ml von 25% (mit den rohen Mitochondrien von Schritt 2,12), 8 ml von 23% und 3 ml mit 20% Dichtegradienten medium und Zentrifuge (52.000 x g, 90 min, 4 ° C) füllen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine lange und stumpfe Spritze, um die gereinigten Mitochondrien im Bereich von der Schnittstelle zwischen 25% und 30% bis zur Schnittstelle zwischen 34% und 38% in ein sauberes Rohr zu sammeln.</li>
	<li>Fügen Sie den mitochondrialen Isolationspuffer in die gesammelten Mitochondrien ein, um sie auf ein dreifaches Volumen zu verdünnen. Zentrifuge (15.000 x g, 20 min, 4 °C) und den Überstand entsorgen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Pellet wieder aufzuhängen, und zentrifugieren Sie es (15.000 x g, 20 min, 4 °C). Entsorgen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet.</li>
	<li>Das endgültige Pellet (d.h. die gereinigten Mitochondrien) sammeln und bei -20 °C lagern. HINWEIS: Kombinieren Sie alle gereinigten Mitochondrien aus dem Kontroll-Ovarialgewebe als mitochondriale Proben für die quantitative Proteomik-Analyse.</li>
</ol>3. Überprüfung der Qualität von gereinigten gewebemitochondrialen Proben
<ol><li>Nehmen Sie eine Röhre mit gereinigten mitochondrialen Proben (d. h. die Pellets aus dem Eierstockkrebsgewebe ab Schritt 1.16 und die Kontrolle des Eierstockgewebes ab Schritt 2.17) zur Überprüfung mit Elektronenmikroskopie (EM). HINWEIS: Das detaillierte Protokoll wurde zuvor beschrieben15,16.</li>
	<li>Bereiten Sie den mitochondrialen Proteinextraktionspuffer durch Mischen von 8 M Harnstoff, 2 M Thiourea, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM Dithiothreitol (DTT) und 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propanesulfonat (CHAPS) vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,52 ein.</li>
	<li>Nehmen Sie eine Röhre mit gereinigten mitochondrialen Proben (d. h. die Pellets aus dem Eierstockkrebsgewebe in Schritt 1.16 und die Kontrolle des Eierstockgewebes in Schritt 2.17) und fügen Sie mitochondrialen Proteinextraktionspuffer (mitochondriale Proben zum Proteinextraktionspuffer, 1:5) das Pellet wieder aussetzen. Die Proben in flüssigem Stickstoff 3x einfrieren und bei Raumtemperatur 2 h lagern.</li>
	<li>Zentrifuge bei 12.000 x g,30 min, 4 °C, sammeln Sie den Überstand (d.h. die extrahierte mitochondriale Proteinprobe) und messen Sie den Proteingehalt mit einem Bicinchoninsäure (BCA) Protein-Assay-Kit.</li>
	<li>50 ml von 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) durch Mischen von 9,08 g Tris und 40 ml ddH2O vorbereiten, den pH-Wert mit HCl auf 8,8 einstellen und ddH2O zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>50 ml von 1 M Tris-HCl (pH 6,8) durch Mischen von 6,06 g Tris und 40 ml ddH2O vorbereiten, den pH-Wert mit HCl auf 6,8 einstellen und ddH2O zu einem Endvolumen von 50 ml hinzufügen. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>100 ml 30% Acrylamid-Bis-Lösung durch Mischen von 29 g Acrylamid, 1 g Bisacrylamid und 80 ml ddH2 O und Zugabe von ddH2O auf ein Endvolumen von 100 ml vorbereiten. Bewahren Sie sie in einer braunen Flasche bei 4 °C auf.</li>
	<li>1.000 ml 10x Tris-Glycin-Elektrophoresepuffer durch Mischen von 29 g Glycin, 58 g Tris, 3,7 g Natriumdodecylsulfat (SDS) und 800 ml ddH2O vorbereiten und dann ddH2O zu einem Endvolumen von 1.000 ml hinzufügen.</li>
	<li>10 ml Ladepuffer durch Mischen von 2 ml Glycerin, 0,02 g Bromphenolblau, 0,4 g SDS, 2 ml Tris-HCl pH 6,8 und 7 ml ddH2O vorbereiten und dann ddH2O zu einem Endvolumen von 10 ml hinzufügen.</li>
	<li>10 ml 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) auflösendes Gel durch Mischen von4 ml ddH2 O vorbereiten, 3,3 ml 30% Acrylamid-Bis-Lösung, 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml 10% SDS, 0,1 ml 10% Ammoniumpersulfat und 0,004 ml Tetramethylethylendiniin (TEMED). Gießen Sie die SDS-PAGE-Auflösungsgellösung in die Platte zwischen den Glasplatten auf die Ebene des Bodens des Kamms. Fügen Sie 2 ml Isopropylalkohol auf die Oberseite. Lassen Sie für 30 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Isopropylalkohol und waschen Sie die Oberseite mit ddH2O 3x. Gießen Sie die 5%ige Gellösung mit 4,1 ml ddH2O, 1,0 ml 30% Acylamid-bis-Lösung, 0,75 ml von 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 ml 10% SDS, 0,06 ml 10% Ammoniumpersulfat und 0,006 ml TEMED. Den Kamm sofort in die Konzentrationsgellösung einlegen, 30 min lassen und dann den Kamm herausnehmen.</li>
	<li>Bereiten Sie den 1x Tris-Glycin-Elektrophoresepuffer vor, indem Sie 100 ml 100-Tris-Glycin-Elektrophoresepuffer mit 900 ml ddH2O verdünnen und in den elektrophoretischen Tank gießen.</li>
	<li>Mischen Sie 30 g der mitochondrialen Proteine aus dem Eierstockkrebs und kontrollieren Sie Eierstockgewebe von Schritt 3.4 mit Ladepuffer bis zu einem Endvolumen von 20 l. Kochen Sie das Gemisch für 5 min, und trennen Sie es dann mit dem 10% SDS-PAGE Auflösungsgel mit einer konstanten Spannung von 100 V. Wenn das Bromphenolblau den Boden erreicht, stoppen Sie die Elektrophorese.</li>
	<li>1,5 l elektrophoretischen Transferpuffer vorbereiten, indem 150 ml 10x Tris-Glycin-Elektrophoresepuffer, 1.050 ml ddH2O und 300 ml Methanol gemischt werden.</li>
	<li>Die PVDF-Membran in 100% Methanol für 10 min und im elektrophoretischen Transferpuffer für mindestens 5 min einweichen. Fünf Blatt Filterpapier in 1x elecrophoretischem Transferpuffer für mindestens 5 min einweichen.</li>
	<li>Nehmen Sie das SDS-PAGE-Gel heraus, das die Proteine enthält, und tränken Sie es 10 min im elektrophoretischen Transferpuffer.</li>
	<li>Machen Sie eine Transferkassette, indem Sie einen nassen Schwamm auf die weiße Platte, drei Blatt nasses Filterpapier, die PVDF-Membran, das SDS-PAGE-Gel mit den Proteinen, zwei Blatt nasses Filterpapier und den nassen Schwamm von unten nach oben legen. Vermeiden Sie Blasen.</li>
	<li>Legen Sie die Transferkassette in den elektrophoretischen Tank, gießen Sie den elektrophoretischen Transferpuffer ein und übertragen Sie dann 2 h unter einem konstanten 200 mA Strom.</li>
	<li>Bereiten Sie 10x Tris-gepufferte Salin (TBS) Stofflösung vor, indem Sie 12,114 g Tris, 29,22 g NaCl mischen und ddH2O zu einem Endvolumen von 500 ml hinzufügen. Bereiten Sie 2 L 1x 1x TBST vor, indem Sie 200 ml 10x TBS, 2 ml Tween-20 und 1.798 ml ddH2O mischen. Bereiten Sie 100 ml Blockierlösung durch Mischen von 100 ml TBST und 5 g BSA vor.</li>
	<li>Nach dem Transfer die PVDF-Membran herausnehmen, in TBST 5 min leicht waschen und dann in Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur blockieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die PVDF-Membran (4 °C über Nacht) mit verschiedenen primären Antikörpern, die für verschiedene subzelluläre Organellen spezifisch sind, einschließlich Lamin B (Zellkern; Ziegenantihumanantikörper 1: 1.000 Blockierlösung), Flottillin-1 (Zytomembran; Kaninchen-Antihuman Antikörper 1:500 Blockierlösung), COX4I1 (Mitochondrion; Kaninchen antihuman 1:1,000 Blockierlösung), GM130 (Golgi-Apparat; Maus-Antihuman-Antikörper 1:1.000 Blockierlösung), Kataalase (Peroxisome; Kaninchen-Antihuman-Antikörper 1:1.000 Blockierung und Kathepsin B (Lysosom; Kaninchen antihumanantikörper 1:1,000 Blocking Solution). In TBST für 5 min 3x leicht waschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die PVDF-Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit den entsprechenden sekundären Antikörpern (Kaninchen-Anti-Ziege, Ziege Anti-Kaninchen oder Ziege Anti-Maus). In TBST für 5 min 3x leicht waschen. Visualisieren Sie es mit Elektrochemilumineszenz (ECL).</li>
</ol>4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS Analyse
HINWEIS: Die detaillierten Verfahren für Abschnitt 4 beziehen sich auf die iTRAQ-Anweisungen (Tabelle der Materialien).
<ol><li>SDT-Puffer (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7.6 und 100 mM DTT) zu den gereinigten mitochondrialen Proben hinzufügen (d.h. die Pellets aus dem Eierstockkrebsgewebe ab Schritt 1.16 und die Kontrolle des Eierstockgewebes ab Schritt 2.17). Wirbeln Sie die Probe, bis es keinen sichtbaren Niederschlag gibt. HINWEIS: Das mitochondriale Verhältnis zu SDT-Puffer sollte 1:5 betragen.</li>
	<li>Die SDT-behandelte Probe 5 min aufkochen, die Probe auf Eis abkühlen und dann Zentrifuge (2.000 x g, 2 min) abkühlen.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand als extrahierte mitochondriale Proteinproben und messen Sie den Proteingehalt mit einem BCA-Protein-Assay-Kit.</li>
	<li>Nehmen Sie SDT-extrahierte mitochondriale Proteine (200 g jeder Probe) zur Reduktion, Alkylierung, Verdauung mit Trypsin, Entsalzung und Lyophilisierung3,4. Machen Sie drei Replikationen für jedes Beispiel.</li>
	<li>Behandeln Sie die tryptischen Peptide (100 g jeder Probe) ab Schritt 4.4 mit 100 mM Tetraethylammoniumbromidlösung (pH 8.5) und beschriften Sie die tryptischen Peptide mit einem der 6-Plexi-iTRAQ-Reagenzien gemäß den Anweisungen3,4. Beschriften Sie jedes Sample 3x.</li>
	<li>Mischen Sie gleich 6 markierte tryptische Peptidproben (drei aus Eierstockkrebsgewebe und drei aus der Kontrolle von Eierstockgeweben) und trocknen Sie mit einem Vakuumkonzentrator.</li>
	<li>Fraktionieren Sie die gemischten iTRAQ-markierten Peptide mit SCX-Chromatographie in 60 Fraktionen (eine Fraktion pro 1 min), und kombinieren Sie dann alle zwei Fraktionen als SCX-fraktionierte Probe (n = 30).</li>
	<li>Unterziehen Sie jede SCX-fraktionierte Probe einer LC-MS/MS-Analyse auf einem Massenspektrometer3,4 gekoppelt mit einem Nano-LC-System innerhalb eines LC-Trenngradienten von 60 min, um MS/MS-Daten zu erhalten.</li>
	<li>Durchsuchen Sie die MS/MS-Daten, um Proteine mit der Suchmaschine (Tabelle der Materialien) zu identifizieren.</li>
	<li>Verwenden Sie die iTRAQ Reporter-Ionen-Intensitäten, um jedes Protein zu quantifizieren und mitochondriale Differentialexprimien (mtDEPs) mit einer Veränderung von >1,5 oder <-1,5-fach und p < 0,05 zu bestimmen.</li>
</ol>

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<li>Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome-mitochondria+interplay+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Peroxisome-mitochondria interplay and disease.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).</li>
<li>Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+structure+and+dynamics+by+the+cytoskeleton+and+mechanical+factors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812(2017).</li>
<li>Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+characterization+of+mitochondrial+proteome+from+human+T+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).</li>
<li>Zhan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).</li>
<li>Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revival+of+2DE-LC%2FMS+in+proteomics+and+its+potential+for+large-scale+study+of+human+proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Med+One%22%5BJournal%5D)">Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms.</a> Med One. 3, e180008(2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen von Eierstockkrebs. Die Herstellung hochwertiger mitochondrialer Proben aus menschlichem Eierstockkrebs und Kontrollgewebe nützen dem tiefen Verständnis der mitochondrialen Funktion bei Eierstockkrebspathogenese und mitochondrialen molekularen Netzwerkveränderungen und helfen dabei, den molekularen Mechanismus für die spätere Entdeckung der Zieltherapie und wirksamer Biomarker auf Basis von Mitochondrien4,5,<...

Eierstockkrebs ist ein häufiger gynäkologischer Krebs mit hoher Sterblichkeit, aber unklarem molekularen Mechanismus1,2. Die meisten Eierstockkrebserkrankungen werden im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, was die Therapie ernsthaft behindert. Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen von menschlichen Eierstockkrebs, und Mitochondrien sind die Zentren des Energiestoffwechsels, Zellsignalisierung, und oxidativen Stress3,4,5,6,7. Tiefe Einblicke in die Veränderungen des mitochondrialen Proteoms bei Eierstockkrebs im Vergleich zur Kontrolle des Eierstockgewebes werden ein vertieftes Verständnis der molekularen Mechanismen von Eierstockkrebs und die Entdeckung wirksamer und zuverlässiger Biomarker und therapeutischer Ziele bewirken. Mitochondrialer Stoffwechsel wurde vorgeschlagen und als Ziel für die Krebstherapie anerkannt, und antimitochondriale Therapie könnte letztlich sehr vorteilhaft für die Verhinderung des Wiederauftretens und Metastasierung von Krebs8sein. Individuelle metabolische Profilerstellung wird auch bereits als nützliches Werkzeug für Krebsschichtung und Vorhersagestrategien9,10praktiziert.
Das langfristige Ziel dieser Forschung ist die Entwicklung und Verwendung einer quantitativen mitochondrialen Proteomik-Methode zur Untersuchung von Eierstockkrebs zur Klärung von mitochondrialen Proteomveränderungen zwischen Eierstockkrebs und Kontrolle von Eierstockgeweben und deren molekularen Netzwerkveränderungen aus einem systematischen Multiomics-Winkel11,12, was zur Entdeckung von mitochondrienzielorientierten molekularen Biomarkern13 zur Klärung der molekularen Mechanismen von und personalisierte Behandlung von Eierstockkrebspatienten. Isobarische Tags für die relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) Kennzeichnung3,4 sind eine effektive Methode, um die mitochondrialen Proteinveränderungen zu quantifizieren. Die Herstellung hochwertiger mitochondrialer Proben aus humanem Eierstockkrebs und die Kontrolle von Eierstockgeweben sind die Voraussetzung für die quantitative iTRAQ-Analyse von mitochondrialen Proteomen3. Mitochondriale Präparat in Verbindung mit iTRAQ quantitative proteomics wurde erfolgreich in langfristigen Forschungsprogrammen über den menschlichen Eierstockkrebs mitochondrialen Proteom verwendet, einschließlich der Einrichtung von mitochondrialen Proteom Referenzkarten3, die Analyse von differenziell exprimierten mitochondrialen Profilen4,14 und post-translational Modifikationen, einschließlich Phosphorylierung, die bereits zur Entdeckung eines wichtigen Signalwegs geführt hat Netzwerkveränderungen bei menschlichen Eierstockkrebs5, einschließlich Veränderungen im Energiestoffwechsel4, Fettstoffwechsel, und Mitophagie-Signalweg-Systeme3.
Frühere Studien haben herausgefunden, dass Differentialgeschwindigkeitszentrifugation in Kombination mit Dichtegradientenzentrifugation eine effektive Methode ist, um Mitochondrien von menschlichem Eierstockkrebs zu isolieren und zu reinigen und Eierstockgewebe3,4,5,14zu kontrollieren. Die iTRAQ-Etikettierung in Verbindung mit starker Kationenaustausch (SCX)-Flüssigchromatographie (LC)-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) ist die Schlüsseltechnik, um die Proteine aus den vorbereiteten mitochondrialen Proben zu erkennen, zu identifizieren und zu quantifizieren.
Hier werden detaillierte Protokolle für die mitochondriale Präparation in Verbindung mit der quantitativen iTRAQ-Proteomik beschrieben. Diese wurden erfolgreich bei der Analyse von humanen Eierstockkrebsgewebe mitochondrialen Proteomen eingesetzt. Die Protokolle umfassen die Vorbereitung von Proben, Differentialgeschwindigkeitszentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation, Qualitätsbewertung von mitochondrialen Proben, Proteinverdauung mit Trypsin, iTRAQ-Kennzeichnung, SCX-Fraktionierung, LC, MS/MS, Datenbanksuche und quantitative Analyse von mitochondrialen Proteinen. Darüber hinaus übersetzt dieses Protokoll leicht, um andere menschliche Gewebe mitochondriale Proteome zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>BCA-Protein-Assay-Kit</td><td>Vazyme</td><td>E112</td><td>Das BCA-Protein-Assay-Kit ist eine spezielle 3-Komponenten-Version unserer beliebten BCA-Reagenzien, die für die Messung (A562 nm) der Gesamtproteinkonzentration von verdünnten Proteinlösungen (0,5 bis 20 Mikrogramm/ml) optimiert ist.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Solarbio</td><td>A8020-5G</td><td>Hitzeschockfraktion, australischen Ursprungs, proteasefrei, fettsäurearm, niedriger IgG-Wert, pH 7, &ge; 98%</td></tr> <tr><td>Zentrifuge</td><td>XiangYi</td><td>TDZ4 - WS</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C9426-5G</td><td>BioReagenz, geeignet für Elektrophorese, &ge; 98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)</td></tr><tr><td>Diamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>798681-100G</td><td>Wasserfrei, rieselfähig, Redi-Dri, &ge; 98%</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>1,4-Dithiothreitol</td></tr><tr><td>Easy nLC</td><td>Proxeon Biosystems (jetzt Thermo Fisher Scientific)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol bis(2-aminoethylether)tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E0396-10G</td><td>BioXtra, &ge; 97 .0</td></tr>%<tr><td>Homogenisator</td><td>SilentShake</td><td>HYQ-3110</td><td></td></tr><tr><td>iTRAQ Reagenzienkit</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Applied Biosystems iTRAQ Reagenzien&ndash; Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A</td></tr><tr><td>Niedertemperatur-Supergeschwindigkeitszentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Macklin</td><td>M813424-100G</td><td>Mannitol ist ein Polyol (mehrwertiger Alkohol), das durch Hydrierung aus Fruktose hergestellt wird und als Süßstoff, Feuchthaltemittel und Füllstoff fungiert. Es hat eine geringe Hygroskopizität und eine schlechte Öllöslichkeit.</td></tr><tr><td>MASCOT Suchmaschine</td><td>Matrix Science, London, UK; Version 2.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nagarse</td><td>Solarbio</td><td>P9090</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimide (SDT)</td><td>Sigma</td><td>56480-25G</td><td>Purum, &ge; 97,0% (T)</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Alere/Axis-Shield</td><td>1002424-1</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) Proteaseinhibitor</td><td>Solarbio</td><td>P0100-1ML</td><td>PMSF ist ein Proteaseinhibitor, der mit Serinresten reagiert, um Trypsin, Chymotrypsin, Thrombin und Papain zu hemmen.</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Macklin</td><td>P816354-25G</td><td>Kaliumchlorid, KCI, auch bekannt als Kaliummuriat und Sylvit, ist ein farbloser kristalliner Feststoff mit einem salzigen Geschmack, der bei 776 °C schmilzt; C (1420 VON). Es ist wasserlöslich, aber unlöslich in Alkohol. Kaliumchlorid wird in Düngemitteln, Pharmazeutika, in der Fotografie und als Salzersatz verwendet.</td></tr><tr><td>Proteome Discover 1.4</td><td>Matrix Science, London, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Millipore</td><td>05317</td><td>Es ist 1 Rolle, 26,5 cm x 1,875 m, 0,45 &; Mikro; m Porengröße, hydrophobe PVDF-Transfermembran mit geringer Hintergrundfluoreszenz für Western Blotting. Es ist kompatibel mit sichtbaren und infraroten Fluoreszenzsonden.</td></tr><tr><td>Q Exaktives Massenspektrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCX Säule</td><td>Sigma</td><td>58997</td><td>Es ist 5-&mu; M Partikelgröße, Länge 5cm & Zeiten; Innendurchmesser 4,6 mm (Supelco).</td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat (V)</td><td>Macklin</td><td>S817660-25G</td><td>Natriumorthovanadat (Vanadat) ist ein allgemeiner kompetitiver Inhibitor für Proteinphosphotyrosylphosphatasen. Die Hemmung durch Natriumorthovanadat ist unter Zugabe von EDTA oder durch Verdünnung reversibel.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Macklin</td><td>S824459-500G</td><td>Vetec Reagenzqualität, 99 %</td></tr> <tr><td>Thioharnstoff</td><td>Sigma</td><td>62-56-6</td><td>ACS-Reagenz, &ge 99,0%</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td>TRIS-Base ist im pH-Bereich von 7,0-9,0 nützlich. Er hat einen pKa von 8,1 bei 25°C.</td></tr><tr><td>Trypsin (Verwendung in Zellkulturen)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Diese flüssige Formulierung von Trypsin enthält EDTA und Phenolrot. Gibco Trypsin-EDTA wird aus Trypsinpulver hergestellt, einer bestrahlten Mischung von Proteasen, die aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins gewonnen werden. Aufgrund seiner verdauungsfördernden Kraft wird Trypsin häufig für die Zelldissoziation, die routinemäßige Zellkulturpassage und die Dissoziation des primären Gewebes verwendet.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378-100G</td><td>Pulver, BioReagenz, für die Molekularbiologie, geeignet für Zellkultur</td></tr></tbody></table>

vorbereitung von mitochondrien aus eierstockkrebsgeweben und kontrolle von ovarialgeweben für die quantitative proteomik-analyse

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Eierstockkrebs ist ein häufiger gynäkologischer Krebs mit hoher Sterblichkeit, aber unklarem molekularen Mechanismus. Die meisten Eierstockkrebserkrankungen werden im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, was die Therapie ernsthaft behindert. Mitochondriale Veränderungen sind ein Kennzeichen menschlicher Eierstockkrebserkrankungen, und Mitochondrien sind die Zentren des Energiestoffwechsels, der Zellsignalisierung und des oxidativen Stresses. Tiefe Einblicke in die Veränderungen des mitochondrialen Proteoms bei Eierstockkrebs im Vergleich zur Kontrolle des Eierstockgewebes werden ein vertieftes Verständnis der molekularen Mechanismen von Eierstockkrebs und die Entdeckung wirksamer und zuverlässiger Biomarker und therapeutischer Ziele bewirken. Eine effektive mitochondriale Präparationsmethode in Verbindung mit einem isobarischen Tag für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) quantitative Proteomik werden hier vorgestellt, um menschlichen Eierstockkrebs zu analysieren und mitochondriale Proteome zu kontrollieren, einschließlich Differentialgeschwindigkeitszentrifugation, Dichtegradientenzentrifugation, Qualitätsbewertung von mitochondrialen Proben, Proteinverdauung mit Trypsin, iTRAQ-Kennzeichnung, starke Kationenaustauschfraktionierung (SCX), Flüssigkeitschromatographie (LC), Tandem-Massenspektrometrie (MS/ MS), Datenbankanalyse und quantitative Analyse von mitochondrialen Proteinen. Viele Proteine wurden erfolgreich identifiziert, um die Abdeckung des humanen Ovarialkarzinoms zu maximieren und das differenziell exprimierte mitochondriale Proteinprofil bei menschlichen Eierstockkrebs zu erreichen.

Es gab einen Unterschied in der Herstellung der Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und der Kontrolle von Eierstockgeweben. Diese Studie ergab, dass es viel einfacher war, Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben vorzubereiten als aus der Kontrolle von Eierstockgeweben3,4. Das Protokoll zur Herstellung von Mitochondrien aus kontrollischen Eierstockgeweben musste verbessert werden. Zunächst war es vor der Gewebehomogenisierung n...

Dieser Artikel stellt ein Protokoll der Differentialgeschwindigkeitszentrifugation in Kombination mit Dichtegradientenzentrifugation vor, um Mitochondrien von menschlichen Eierstockkrebsgeweben zu trennen und Eierstockgewebe für die quantitative Proteomik-Analyse zu kontrollieren, eine hochwertige mitochondriale Probe und eine quantitative Proteomikanalyse mit hohem Durchsatz und hoher Reproduzierbarkeit eines humanen Ovarialkarzinoms mitochondrialem Proteom.

Vorbereitung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Ovarialgeweben für die quantitative Proteomik-Analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Mitochondriale Veränderungen spielen eine wichtige Rolle bei menschlichen Eierstockkrebs. Dieses Protokoll schafft eine effektive Plattform, um Mitochondrien von menschlichem Eierstockkrebs und den Kontrollgeweben für groß angelegte Proteomik-Analysen zu isolieren und zu reinigen. Mitochondrien, als Zentren des Energiestoffwechsels, Zellsignalisierung, und oxidativen Stress, Einblicke in mitochondriale Proteom-Änderungen bei Eierstockkrebs profitieren von unserem Verständnis molekularen Mechanismus, und ist eine Entdeckung der effektiven Biomarker und die therapeutischen Ziele.Diese Technik verwendet Differential-Speed-Zentrifugation in Kombination mit Dichtegradientzentrifugation, um Mitochondrien von menschlichem Eierstockkrebs in den Kontrollgeweben zu trennen, was zu hochwertigen Mitochondrienproben für die quantitative Proteomikanalyse führt. Das Mitochondrienpräparat, gekoppelt mit der quantitativen iTRAQ-Proteomik, wurde erfolgreich bei der Analyse des menschlichen Eierstockkrebsgewebes eingesetzt, was leicht übersetzt andere Gewebe, Mitochondrienproteomik, analysiert. Diejenigen, die diese Methode noch nie durchgeführt haben, können feststellen, dass es schwierig sein kann, Mitochondrien von der Eierstockkontrolle zu isolieren als Krebsgewebe.Es ist notwendig, ein Trypsin hinzuzufügen, um die Homogenisierung des Kontrollgewebes zu verbessern und eine zusätzliche Schicht des Dichtegradientenmediums hinzuzufügen, um die Mitochondrientrennung zu verbessern. Bereiten Sie zum Starten dieses Verfahrens 250 Milliliter des mitochondrialen Isolationspuffers vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie etwa 1,5 Gramm Eierstockkrebsgewebe in eine saubere Glasschale.Fügen Sie zwei Milliliter vorgekühlten mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Blut leicht von der Gewebeoberfläche zu waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal. Verwenden Sie dann eine saubere Augenschere, um das Gewebe vollständig in Stücke zu zerkleinern, die etwa einen Kubikmillimeter groß sind, und übertragen Sie das gehackte Gewebe in ein 50 Milliliter Zentrifugenrohr.Fügen Sie 13,5 Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer mit Nagarse bei einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter hinzu. Verwenden Sie einen elektronischen Homogenisator, um das Hackfleisch für zwei Minuten bei vier Grad Celsius zu homogenisieren. Danach fügen Sie weitere drei Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer in die Gewebehomogenate und mischen Sie sie gut durch Pipettieren.Zentrifugieren Sie das vorbereitete Gewebe bei 1, 300 xg und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie das Pellet und halten Sie den Überstand. Als nächstes zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 xg und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.Entfernen Sie den mikrosomenhaltigen Überstand und bewahren Sie das Pellet auf. Fügen Sie 2 Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer hinzu und setzen Sie das Pellet gründlich durch leichte Pipettierung wieder auf. Zentrifugieren Sie diese Pelletsuspension bei 7.000 xg und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf, das die rohen Mitochondrien enthält. Fügen Sie 12 Milliliter des 25%Dichte Gradienten medium, um die extrahierten rohen Mitochondrien wieder auszusetzen. Erstellen Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten, der die im Textprotokoll beschriebenen wieder aufgehängten rohen Mitochondrien enthält, und zentrifugieren Sie ihn 90 Minuten lang bei 52.000 xg und bei vier Grad Celsius.Verwenden Sie eine lange und stumpfe Spritze, um die gereinigten Mitochondrien an der Schnittstelle zwischen den 25% und 30%Gradientenmedien zu sammeln und diese auf ein sauberes Rohr zu übertragen. Fügen Sie den gesammelten Mitochondrien einen mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um ihn auf ein dreifaches Volumen zu verdünnen. Zentrifuge bei 15.000 xg und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf. Sammeln Sie das letzte Pellet, das die gereinigten Mitochondrien enthält, und lagern Sie es bei 20 Grad Celsius. Bereiten Sie zunächst 250 Milliliter des mitochondrialen Isolationspuffers vor, wie im Textprotokoll beschrieben.Etwa 1,5 Gramm des normalen Kontroll-Ovarialgewebes zu einer sauberen Glasschale geben. Fügen Sie zwei Milliliter vorgekühlten mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Blut leicht von der Gewebeoberfläche zu waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal.Mit einer sauberen Augenschere das Gewebe vollständig in Stücke zerkleinern, die etwa 1 Kubikmillimeter groß sind, und das hackfleischte Gewebe in ein sauberes 50-Milliliter-Rohr geben. Fügen Sie acht Milliliter einer Lösung, die 0,05%Trypsin und 20 Millimolar EDTA und PBS enthält, in das gehackte Kontrollgewebe und verdauen Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um die Zellen zu lysieren und die Mitochondrien freizusetzen. Zentrifuge bei 200 xg für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie die Gewebe und Zellen auf. Fügen Sie 13,5 Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer mit Nagarse bei einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter hinzu und verwenden Sie einen elektrischen Homogenisator, um das hackfleischige Gewebe bei vier Grad Celsius für zwei Minuten zu homogenisieren. Fügen Sie weitere drei Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer in das Gewebe homogenate und mischen Sie gründlich durch Pipettieren.Zentrifugieren Sie das vorbereitete Gewebe bei 1, 300 xg und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie das Pellet und halten Sie den Überstand. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 xg und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.Entfernen Sie den Überstand, der die Mikrosomen enthält, und halten Sie das Pellet. Fügen Sie dann 2 Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer hinzu und setzen Sie das Pellet gründlich durch leichte Pipettierung wieder auf. Zentrifugieren Sie diese Pelletsuspension bei 7.000 xg und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf, das die rohen Mitochondrien enthält. Fügen Sie 12 Milliliter des 25%Dichte Gradienten medium, um die extrahierten rohen Mitochondrien wieder auszusetzen. Machen Sie einen diskontinuierlichen Dichtegradienten, der die rohen Mitochondrien enthält, wie im Textprotokoll beschrieben, und zentrifugieren Sie sie 90 Minuten lang bei 52.000 xg und bei vier Grad Celsius.Verwenden Sie eine lange und stumpfe Spritze, um die gereinigten Mitochondrien im Bereich von der Schnittstelle zwischen den 25- und 30%Gradientenmedien bis zur Schnittstelle zwischen den 34- und 38%gradienten Medien zu sammeln. Die gereinigten Mitochondrien in ein sauberes Rohr geben. Fügen Sie den gesammelten Mitochondrien einen mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um ihn auf ein dreifaches Volumen zu verdünnen.Zentrifugieren Sie bei 15.000 xg und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 2 Milliliter mitochondrialen Isolationspuffer hinzu, um das Pellet und die Zentrifuge bei 15.000 xg und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten wieder aufzuhängen. Entsorgen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet.Sammeln Sie das letzte Pellet und lagern Sie es bei 20 Grad Celsius. In dieser Studie werden hochwertige mitochondriale Proben aus menschlichem Eierstockkrebs und Kontrollgewebe für groß angelegte quantitative Proteomik hergestellt. Es gibt einige Unterschiede in der Herstellung der Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Eierstockgeweben, einschließlich der Verwendung eines anderen diskontinuierlichen Dichtegradienten.Nach der Zentrifugation finden sich die gereinigten Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben an der Schnittstelle zwischen 25% und 30%, während die aus kontrollierbaren Eierstockgeweben im Bereich von der Schnittstelle zwischen 25% und 30% bis zur Schnittstelle zwischen 34% und 38% gefunden werden Die Qualität der hergestellten Mitochondrien wird dann mit Differentialgeschwindigkeitszentrifugation und Dichtegradientenzentrifugation mittels Elektronenmikroskopie bewertet. Die Elektronenmikroskop-Bilder zeigen, dass bei Eierstockkrebs und Kontrolle des Eierstockgewebes die wichtigsten isolierten Organellen Mitochondrien sind, mit Ausnahme einer geringen Menge peroxisomen. Jedoch, die Morphologie der Mitochondrien wird gesehen, um mehr bei Eierstockkrebs zu ändern, als Eierstockgewebe zu kontrollieren.Die Qualität der zubereiteten Mitochondrien wird auch über den westlichen Fleck bewertet. Die westlichen Blot-Bilder zeigen auch, dass die Hauptkomponente in vorbereiteten mitochondrialen Proben von Eierstockkrebs und Eierstöcken Mitochondrien ist, mit Ausnahme einer kleinen Menge von Peroxisomen, die mit der Elektronenmikroskopie-Analyse übereinstimmt. Es ist vernünftig, dass Peroxisomen in den vorbereiteten Mitochondrien enthalten sind, da Mitochondrien ausgiebig mit Peroxisomen interagieren, was wiederum die funktionelle Vollständigkeit der Mitochondrien widerspiegelt.Diese Ergebnisse zeigen die hohe Qualität der vorbereiteten mitochondrialen Proben. Wenn ich dieses Verfahren durcharbeite, ist es sehr wichtig, dass Sie Gewebe vor der Homogenisierung vollständig zerkleinern und das Trypsin zu den gehackten Kontrollgeweben hinzufügen. Es ist auch wichtig, dass Sie diskontinuierliche Dichte Gradient für die Krebsproben und die Kontrollen zu machen und vorbereitet.Nach diesem Verfahren können iTRAQ oder TMT quantitative Proteomik oder Phosphoproteomik durchgeführt werden, um das Profil des Ovarialkarzinoms Mitochondrienproteom zu klären, und phosphoproteomeprofil kann erstellt werden, um die Rolle von Mitochondrien bei Eierstockkrebs in großen Tiefen zu klären. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, mitochondopienproteom und das Phosphoprotelom bei Eierstockkrebs systematisch zu untersuchen, das Signalweg-Netzwerksystem zu konstruieren und die zuverlässigen Biomarker und die therapeutischen Ziele zu entdecken.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt das Verfahren zur Isolierung von Mitochondrien aus menschlichem Eierstockkrebsgewebe mittels Differential-Speed-Zentrifugation in Kombination mit Dichtegradientenzentrifugation. Die isolierten Mitochondrien können für die proteomische Analyse des mitochondrialen Proteoms des menschlichen Eierstockkarzinoms verwendet werden.

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Wir präsentieren ein zweistufiges Protokoll für die qualitativ hochwertige Isolierung von Mitochondrien, das mit der Entdeckung und Quantifizierung von Proteinen auf Proteomebene kompatibel ist. Unser Protokoll kommt ohne Gentechnik aus und eignet sich daher für die Untersuchung von Mitochondrien aus allen primären Zellen und Geweben.

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Isolierung von Mitochondrien für die mitochondriale Superkomplexanalyse aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben 

Dieses Protokoll bereitete erfolgreich ausreichend hochwertiges neovaskuläres Gewebe aus Gliomproben mittels Laser-Capture-Mikrodissektion für eine quantitative proteomische Analyse der Tumorangiogenese vor, überwand die Einschränkungen von Studien, die traditionell hauptsächlich auf angiogene Faktoren fokussiert sind, und lieferte ein großflächiges proteomisches Profil der Gliomangiogenese.

Präparation von neovaskulären Geweben aus humanen Gliomgeweben für quantitative proteomische Analyse der Tumorangiogenese

Erfahren Sie die Isolierung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben mittels Differentialgeschwindigkeits- und Dichtegradientenzentrifugation. Diese Methode liefert hochwertige Proben für quantitative Proteomanalysen.

Vorbereitung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Ovarialgeweben für die quantitative Proteomik-Analyse (Video) | JoVE Journal

Vorbereitung von Mitochondrien aus Eierstockkrebsgeweben und Kontrolle von Ovarialgeweben für die quantitative Proteomik-Analyse

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