Name: Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Islmn:GFP Transgene Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Lernen Sie die Isolation und Kultur von Okulomotor-, Trochlea- und Spinalmotorneuronen aus embryonalen Mäusen. Diese Methode ermöglicht vergleichende Studien zur selektiven Vulnerabilität bei ALS.

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Wir danken Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) für den Unterricht in SMN-Sektionstechniken; die Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, die Immunology Division Flow Cytometry Facility der Harvard Medical School, The Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women es Hospital Flow Cytometry Core und Boston Children es Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neurons; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, weitere Engle-Labormitglieder und Mitglieder des Project ALS-Konsortiums für technische Hilfe und nachdenkliche Diskussion. Diese Studie wurde vom Projekt ALS unterstützt. Darüber hinaus wurde R.F. von der Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad und dem NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748 finanziert; J.J. wurde durch das NIH/NEI-Schulungsprogramm in den Molekularen Basen von Augenkrankheiten (5T32EY007145-16) durch das Schepens Eye Research Institute und durch das Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) durch das Boston Children es Hospital unterstützt; M.C.W wurde von NEI (5K08EY027850) und der Children es Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award) unterstützt. und E.C.E. ist ein Howard Hughes Medical Institute Investigator.

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Historisch gesehen haben sich In-vitro-Studien von CN3- und/oder CN4-Motorneuronen auf heterogene Kulturen wie dissoziierte17,18,19,20,21, Explant17,22,23,24,25,26...

Die Kultur der primären motorischen Neuronen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Untersuchung der neuronalen Entwicklung, Funktion, und Anfälligkeit für exogene Stressoren ermöglicht. Motorische Neuronenkulturen sind besonders nützlich für die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS)1,2, deren Krankheitsmechanismen unvollständig verstanden werden. Interessanterweise sind trotz des signifikanten Zelltodes von Spinalmotorneuronen (SMNs) bei ALS-Patienten und ALS-Modellmäusen der Zelltod in okulomotorischen Neuronen (CN3s) und Trochlea-Neuronen (CN4s) relativ knapp1,3,4,5,6,7,8,9. Daher könnten vergleichende Analysen reiner Kulturen von CN3s/CN4s und SMN wichtige Hinweise auf Mechanismen liefern, die der relativen Verwundbarkeit zugrunde liegen. Leider war ein großes Hindernis für solche Analysen die Unfähigkeit, gereinigte Kulturen dieser motorischen Neuronen zu züchten.
Viele Protokolle wurden für die Reinigung von SMNs aus Tiermodellen beschrieben. Die meisten dieser Protokolle verwenden Dichtegradientzentrifugation10,11,12 und/oder p75NTR-Antikörper-basierte Zellsortierungs-Schwenktechniken13,14,15,16. Die Dichtegradientenzentrifugation nutzt die größere Größe von SMNs im Vergleich zu anderen Rückenzellen aus, während p75NTR ein extrazelluläres Protein ist, das ausschließlich von SMNs im Rückenmark exprimiert wird. Fast 100% reine SMN-Kulturen wurden von einem oder beiden dieser Protokolle11,12,14erzeugt. Diese Protokolle waren jedoch nicht erfolgreich bei der Erzeugung von CN3/CN4-Kulturen, da CN3s/CN4s p75NTRnicht ausdrücken und andere spezifische CN3/CN4-Marker nicht identifiziert wurden. Sie sind auch kleiner als SMNs und daher schwieriger zu isolieren, basierend auf der Größe. Stattdessen haben sich In-vitro-Studien von CN3s oder CN4s auf dissoziierte17,18,19,20,21, Explant17,22,23,24,25,26und Slice27,28 Kulturen, die aus heterogenen Zelltypen bestehen, und keine Protokolle für die Isolation und Kultur von primären CN3s oder CN4s.
Hier wird ein Protokoll für die Visualisierung, Isolierung, Reinigung und Kultivierung von CN3s, CN4s und SMNs vom selben Embryonaltag 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgene Mäuse29 (Abbildung 1, Abbildung 2A) beschrieben. IslMN:GFP kennzeichnet speziell motorische Neuronen mit einem farnesylierten GFP, das auf die Zellmembran lokalisiert. Dieses Protokoll ermöglicht einen art- und altersgerechten Vergleich mehrerer Arten von motorischen Neuronen, um pathologische Mechanismen bei motorischen Neuronenerkrankungen aufzuklären.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-konjugiertes F(ab')2-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11072</td><td>1:400</td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x), serumfrei</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria llu SORP Durchflusszytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>- </td><td>Dies verfügt über 4 Lasersysteme, die mit 405-, 488-, 594- und 640-nm-Lasern ausgestattet sind.</td></tr><tr><td>BD Falcon 70&mu; m Nylon Zellsiebe</td><td>CORNING</td><td>352350</td><td>Zum Filtern der dissoziierenden Zellen vor dem FACS.</td></tr><tr><td>BD Falcon Reagenzgläser mit rundem Boden und Schnappverschluss</td><td>CORNING</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>BDNF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-207</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Mikroplatte, 96 Well, PS, F-Boden (Chimney Well)</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>655090</td><td>Wir haben mehrere 96-Well-Schalen ausprobiert und dies war die beste für Kultur und Analysen nach ICC</td></tr><tr><td>Circular Cover Glasses für die Mikroskopie</td><td>Karl Hecht & Assistent</td><td>1001/14</td><td>Wir haben dieses Deckglas verwendet, da die Fläche groß war (Durchmesser: 14 mm).</td></tr><tr>Verifizierter Lieferant - <td>CNTF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-272</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopiazonsäure aus Penicillium cyclopium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1530</td><td>CPA. Einer der Stressoren in der Notaufnahme.</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylinodol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette Inox Spitzengröße 0,05 mm x 0,01 mm Biologie Spitzen</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25205</td><td></td></tr><tr><td>GDNF Human</td><td>ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.</td><td>CYT-305</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E</td><td>BrainBits</td><td>HE</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E niedrige Fluoreszenz</td><td>BrainBits</td><td>HELF</td><td>Die Fluoreszenz, die die Beobachtung der GFP-Expression des Embryos behindert, sollte niedrig sein.</td></tr><tr><td>Pferdeserum, hitzeinaktiviert, neuseeländischen Ursprungs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Tocris Cookson</td><td>2845</td><td>Isobutylmethylxanthin</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz s L15 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierschere</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-5913</td><td></td></tr><tr><td>Mikromesser 4,75" 1,7 mm x 27 mm Klinge</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-6272</td><td></td></tr><tr><td>Moria Mini Perforierter Löffel</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>10370-19</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler Maus-Antikörper gegen neuronales Klasse-III&beta-Tubulin (TUBB3)</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>1:500, TUJ1</td></tr><tr><td>Nikon Perfect Focus Eclipse Ti Lebendzell-Fluoreszenzmikroskop und Elements-Software</td><td>Nikon-Differentielle</td><td></td> <td>Interferenzkontrastbilder und immunzytochemische Bilder der Zellkulturen wurden mit diesen Geräten aufgenommen</td></tr><tr><td>Salpetersäure 90%, Rauchend (ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A202-212</td><td>Zum Spülen von Deckgläsern</td></tr><tr><td>Olympus 1,7 mL Mikroröhrchen, klar</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td>Dies sind die Röhrchen, die wir in diesem Zusammenhang als "1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen" bezeichnet haben.</td></tr><tr><td>Papain-Dissoziationssystem</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LK003150</td><td>Papain-Lösung und Alubumin-Ovomucoid-Inhibitor-Lösung werden aus diesem Kit hergestellt.</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin (PDL)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Islet1</td><td>Abcam</td><td>ab109517</td> 1<td>:200</td></tr><tr><td>SMZ18 und SMZ1500 Zoom-Stereomikroskope mit DS-Ri1 Es</td> <td>wurde eine Nikon-Dissektion durchgeführt und Bilder von präparierten Embryonen und Geweben werden unter diesen Fluoreszenzmikroskopen aufgenommen.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 170 Schwarz Silikonverkapselung - A+B 0,9 kg Kit</td><td>Dow Corning</td><td>1696157</td><td>Mit diesem Kit stellen wir Sezierschalen her.</td></tr><tr><td>TC-behandelte Schalen, 100 mm x 20 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td>Wir stellen Präparierschalen mit dieser Schale her.</td></tr><tr><td>Thum Verbandzange 4,5" gezahnt 2,2 mm Spitzenbreite</td><td>Roboz Chirurgisches Instrument</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Schallkopf für LOGOQ e VET</td><td>GE Healthcare</td><td>L8-18i-RS</td><td>Für Ultraschall an weiblichen</td></tr><tr><td>Mäusen Veterinär-Ultraschallgerät</td><td>GE Healthcare</td><td>LOGOQ e VET</td><td>Für Ultraschall an weiblichen Mäusen</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 700 Serie Laser-Scanning-Konfokalmikroskop und Zen-Software</td><td>Carl Zeiss</td><td>-</td><td>Das konfokale Bild des Embryos wurde mit diesen Geräten aufgenommen</td></tr></tbody></table>

isolation und kultur von okulomotor, trochlea, und spinal motor neuronen von pränatalen islmn:gfp transgene mäuse

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Okulomotorische Neuronen (CN3s) und Trochlea-Neuronen (CN4s) weisen eine bemerkenswerte Resistenz gegen degenerative motorische Neuronenerkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS) im Vergleich zu Spinalmotorneuronen (SMNs) auf. Die Fähigkeit, primäre Maus-CN3s, CN4s und SMNs zu isolieren und zu kultiieren, würde einen Ansatz zum Untersuchen von Mechanismen bieten, die dieser selektiven Sicherheitsanfälligkeit zugrunde liegen. Bis heute verwenden die meisten Protokolle heterogene Zellkulturen, die die Interpretation experimenteller Ergebnisse verwirren können. Um die Probleme im Zusammenhang mit gemischten Zellpopulationen zu minimieren, sind reine Kulturen unverzichtbar. Hier wird im ersten Protokoll detailliert beschrieben, wie CN3s/CN4s zusammen mit SMNs-Gegenstücken aus denselben Embryonen mit embryonalen Tag 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgene Mausembryonen effizient gereinigt und kultiviert werden können. Das Protokoll enthält Einzelheiten zur Gewebesektion und -dissoziation, zur FACS-basierten Zellisolierung und zur In-vitro-Kultivierung von Zellen aus CN3/CN4- und SMN-Kernen. Dieses Protokoll fügt bestehenden Protokollen ein neuartiges In-vitro-Kultursystem cN3/CN4 hinzu und bietet gleichzeitig eine reine spezies- und altersgerechte SMN-Kultur zum Vergleich. Analysen, die sich auf die morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften motorischer Neuronen konzentrieren, sind in diesem Kultursystem möglich. Dieses Protokoll wird die Erforschung der Mechanismen ermöglichen, die die Entwicklung des motorischen Neurons, die selektive Anfälligkeit und die Krankheit definieren.

Ziel dieses Protokolls war es, sowohl primäre CN3s/CN4s als auch SMNs langfristig hoch zu reinigen und zu kultivieren, um vergleichende Analysen der Mechanismen zu ermöglichen, die motorischen Neuronenstörungen zugrunde liegen (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 zur Übersicht).
Sobald Neuronen erfolgreich isoliert und in der Kultur angebaut wurden, wurden fast reine prim...

Diese Arbeit stellt ein Protokoll vor, um homogene Zellkulturen von primären okulomotorischen, Trochlea- und Spinalmotorneuronen zu ergeben. Diese Kulturen können für vergleichende Analysen der morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften von augen- und spinalmotorischen Neuronen verwendet werden.

Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Islmn:GFP Transgene Mäuse

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Dies ist das erste Protokoll, das gleichzeitig und effizient primäre okuläre und spinale motorische Neuronen von embryonalen Mäusen reinigt und kultiviert. Es ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen, die der motorischen Neuronenerkrankung zugrunde liegen. Dieses Protokoll fügt bestehenden Systemen eine neuartige in-vitro-Okulomotorik-Kulturkomponente hinzu und bietet reine Arten und altersgerechte Wirbelsäulen-Neuronenkulturen zum Vergleich.Bei der amyotrophen Lateralsklerose degenerieren die spinalen motorischen Neuronen, während okulomotorische Neuronen relativ verschont bleiben. Der Vergleich dieser Kulturen könnte Einblicke in Krankheitsmechanismus und Therapie geben. Diese Methode wird Studien über die Mechanismen, die der Entwicklung des motors Neuronen, Krankheit und selektiver Anfälligkeit zugrunde liegen, erleichtern.Unser Kultursystem ermöglicht die Charakterisierung der motorischen Neuronenmorphologie, Molekularbiologie und Elektrophysiologie. Für diejenigen, die neu in dieser Technik, empfehlen wir viel Übung. Die Zerlegung kann technisch anspruchsvoll sein und mehrere Dissektoren können erforderlich sein, um ausreichende Neuronen für die Primärkultur zu erhalten.Beginnen Sie mit der Ernte Islet1 EGF positive Embryonen von einer schwangeren Maus etwa 11,5 Tage nach der Befruchtung. Den Bauch gründlich mit Ethanol besprühen und die Gebärmutter mit einer sterilen Mikrodissektionsschere und Daumenverbandszange entfernen. Waschen Sie die Gebärmutter kurz in sterilem PBS.Dann auf die mit vorgekühlten sterilen PBS gefüllte Sezierplatte geben. Entfernen Sie unter dem hellen Licht des Mikroskops vorsichtig die Embryonen aus der Gebärmutter mit einer Mikrodissektionsschere, Daumen-Dressing-Zangen und Einer Pinzette von Dumont 5. Verwenden Sie dann einen sterilen Moria Mini perforierten Löffel, um jeden Embryo in einen separaten Brunnen einer 24-Well-Platte zu übertragen, die mit einem vorgekühlten Hiberat E Low Fluoreszenzmedium gefüllt ist, ergänzt mit 1X V27.Während Sie die Platte auf Eis halten, übertragen Sie einen Embryo auf eine sterile Sezierplatte und bedecken Sie ihn vollständig mit eiskalt steriler Hank es Balanced Salt Solution oder HBSS. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gesicht des Embryos und des Schwanzes zu entfernen, ohne das Mittelhirn zu beschädigen. Dann stellen Sie den Embryo anfällig mit Gliedmaßen gespannt und Schwanz zeigt nach vorne des Mikroskops.Verwenden Sie eine Pinzette, um das Dach des vierten Ventrikels aufzuschlitzen, um eine kleine Öffnung zu erzeugen. Verwenden Sie diese Öffnung, um eine Pinzette in den Raum zwischen dem vierten Ventrikel und seinem Dach einzuhaken. Sezieren Sie entlang der dorsalen Oberfläche des Embryorostrals zum Kortex und seitlich zur Bodenplatte und Motorsäule.Öffnen Sie dann das sezierte Gewebe in einer offenen Buchweise, um die GFP-positiven CN3- und CN4-Kerne zu enthüllen. Trennen Sie vorsichtig das ventrale Mittelhirn vom Embryo und entfernen Sie Meningealgewebe mit einer Pinzette und einem Mikrodissektionsmesser. Sezieren Sie die bilateralen GFP-positiven CN3- und CN4-Kerne von der Bodenplatte und anderen GFP-positiven umgebenden Geweben entfernt, wobei darauf geachtet wird, dass die Neuronen nicht berührt oder beschädigt werden.Wenn Sie separate CN3- und CN4-Kerne sammeln, schneiden Sie entlang des Mittelhirns dieser beiden Kerne und verwenden Sie eine P1000 Pipette, um das sezierte ventrale Mittelhirngewebe mit minimalem HBSS zu sammeln. Legen Sie es in ein beschriftetes 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit Dissektionsmedium gefüllt und lagern Sie das Rohr auf Eis bis zur Dissoziation. Ziehen Sie weiterhin ventrale Mittelhirne aus zusätzlichen Embryonen in der gleichen Röhre, bis die Gesamtzahl den experimentellen Anforderungen entspricht.Um das ventrale Rückenmark zu sezieren, halten Sie den Embryo anfällig mit dem Kopf nach vorne des Mikroskops. Halten Sie es mit einer Pinzette und legen Sie die Spitze des anderen Paares in den ungeöffneten kaudalen Teil der vierten Herzkammer. Öffnen Sie den Rest des Hinterhirns und des Rückenmarks dorsal über die gesamte rostrocaudale Ausdehnung des Embryos.Schneiden Sie das Rückengewebe ab dem vierten Ventrikel und arbeiten in Richtung des zentralen Kanals des kaudalen Rückenmarks mit der Zange als Schere. Halten Sie dann den Embryo mit einer Pinzette und kneifen Sie die Klappe des Rückengewebes auf jeder Seite mit dem anderen Paar. Entfernen Sie das ventrale Rückenmark, indem Sie das Mikrodissektionsmesser verwenden, um direkt unterhalb des GFP-positiven SMN zu durchbohren, indem Sie das ventrale Rückenmark mit sägeartigen Bewegungen auf beiden Seiten anheben.Schneiden Sie das Rückenmark quer an der oberen Grenze der unteren Extremität und entfernen Sie den Zervixlenteil. Schneiden Sie quer direkt über C1, wo das erste GFP-positive Vorderhorn projiziert wird. Legen Sie das ventrale Rückenmark dorsale Seite nach oben und halten Sie es durch Drücken des GFP-negativen Gewebes zwischen den GFP-positiven SMN-Säulen mit einer Pinzette.Entfernen Sie das verbleibende angebrachte Mesenchym, DRGs und rückendes Rückenmark, indem Sie beide Seiten der GFP-positiven SMN-Säule mit dem Mikrodissektionsmesser beschneiden. Verwenden Sie eine P1000 Pipette, um das sezierte ventrale Rückenmarkgewebe mit minimalem HBSS zu sammeln und in ein beschriftetes 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit Dissektionsmedium zu legen. Lagern Sie es auf Eis bis zur Dissoziation und ziehen Sie weiterhin ventrale Rückenmark von zusätzlichen Embryonen in der gleichen Röhre.Fügen Sie jedem der Mikrozentrifugenröhrchen mit den sezierten Gewebeproben das entsprechende Volumen der Papainlösung hinzu. Inkubieren Sie die Rohre bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, indem Sie die Rohre alle 10 Minuten durch Fingerstreicher aufwirbeln. Nach der Inkubation jede Suspension achtmal mit einer P200 Pipette sanft trituieren und bei 300 mal g fünf Minuten zentrifugieren.Setzen Sie die Zellpellets mit der entsprechenden Menge an Albumin-Ovomucoid-Inhibitorlösung wieder auf, indem Sie sanft nach oben und unten pipetieren. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Dann entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer P1000 Pipette.Setzen Sie die Zellen im entsprechenden Volumen des Seziermediums wieder aus. Filtern Sie die Suspensionen mit einem 70-Mikrometer-Zellsieb. Verwenden Sie als Nächstes die FACS-Sortierung, um GFP-positive Zellen zu isolieren, die von CN3/CN4 und SMN seziert wurden.Verdünnen Sie die isolierten Zellsuspensionen mit motorischem Neuronenkulturmedium auf 37 Grad Celsius auf die entsprechende Dichte vorgewärmt und fügen Sie 200 Mikroliter der Suspension zu einem Brunnen einer PDL Laminin-beschichteten 96-Well-Platte hinzu. Kultur die Neuronen in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator sicherstellen, dass die motorische Neuronenkultur Medium alle fünf Tage zu erfrischen. Wenn erfolgreich isolierte Neuronen in der Kultur angebaut wurden, wurden fast reine primäre CN3/CN4- und SMN-Kulturen erhalten und 14 Tage lang in vitro gepflegt.Die Reinheit der Kulturen an zwei Tagen in vitro betrug 93,5% für CN3/CN4 und 86,7% für SMN, wenn sie von der Immunzytochemie mit dem motorischen Neuronenmarker Islet1 und dem neuronalen Marker TUJ1 beurteilt wurden. Die Reinheit beruhte stark auf dem Alter der Embryonen und der Festlegung der entsprechenden Schwellenwerte für GFP-Tore während der FACS. Die Reinheit der aus E10.5-Embryonen isolierten Neuronen war mit denen von E11.5-Embryonen vergleichbar.Die Reinheit nahm jedoch signifikant ab, als E13.5-Embryonen verwendet wurden. Um festzustellen, ob primäre CN3/CN4s und SMNs unterschiedliche Reaktionen auf endoplasmatische Retikulum-Stressoren zeigten, wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Cyclopiazonsäure oder CPA an zwei Tagen in vitro behandelt und drei Tage später für die Immunzytochemie zur Bewertung der Überlebensverhältnisse fixiert. Die Anzahl der lebensfähigen Neuronen in jeder Probe wurde gezählt und das Überlebensverhältnis berechnet.CN3/CN4-Monokulturen waren deutlich resistenter gegen CPA-Behandlungen als SMN-Monokulturen. Nach diesem Verfahren können viele zusätzliche Methoden durchgeführt werden, um motorische Neuronen zu untersuchen. Einige Beispiele sind Studien zur Elektrophysiologie, Zellbiologie, Transkription oder Chromatin-Zugänglichkeit.

isolation-culture-oculomotor-trochlear-spinal-motor-neurons-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein alternativer Weg zur Isolierung von embryonalen Maus-Motoneurone aus dem Rückenmark beschrieben. Die Methode berücksichtigt die Tatsache, dass Lektin kann die geringe Affinität nerve growth factor receptor p75NTR binden. Das Lektin-basierte preplating ermöglicht eine Reinigung ähnlich wie mit einem spezifischen Antikörper gegen das p75NTR.

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Isolierung von embryonalen Neuralleiste vom Neuralrohr erleichtert die Verwendung...

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

Das Video zeigt die Isolierung von okulomotorischen, trochleären und spinalen Motoneuronen aus einem transgenen Mausembryo. Der Embryo exprimiert Motoneuronen, die zur einfachen Visualisierung und Identifizierung mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) markiert sind. Die Motoneuronen werden chirurgisch unter einem Fluoreszenzmikroskop isoliert und in einem Kulturmedium aufbewahrt.

Isolierung und Kultur von okulomotorischen, trochleären und spinalen Motoneuronen aus einem Mausembryo

Dieses Video zeigt die ex vivo Kultur und Bildgebung von okulomotorischen Schnitten aus transgenen Mausembryonen. Die Embryonen werden isoliert und in Agarose eingebettet. Mit Hilfe eines Vibratoms werden Scheiben erhalten, die die okulomotorischen Kerne und Augen enthalten. Die Scheiben werden in Kultur aufbewahrt und mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet.

Ex-vivo-Kultur und Bildgebung von okulomotorischen Schnitten aus transgenen Mausembryonen

Die Ursachen der Degeneration von dopaminergen Neuronen im Mittelhirn während der Parkinson-Krankheit sind nicht vollständig geklärt. Zellkultursysteme stellen ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der neurophysiologischen Eigenschaften dieser Neuronen dar. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll vor, das für die in vitro Modellierung der Neurodegeneration verwendet werden kann.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Diese Studie stellt eine Technik für die Isolierung von Neuronen aus WT neonatalen Mäusen vor. Es erfordert die sorgfältige Sezierung des Rückenmarks aus der neonatalen Maus, gefolgt von der Trennung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe durch mechanische und enzymatische Spaltung.

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

Wir beschreiben die Immunomagnetic Isolierung der primäre Maustaste Oligodendrozyten, ermöglicht die schnelle und spezielle Isolierung der Zellen für in-vitro- Kultur.

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

Das Ziel dieser Technik ist eine hoch angereicherte Kultur der primären Motoneurone (MNs) aus murinen Rückenmark vorzubereiten. Um die Folgen von Mutationen MN Krankheiten verursachen zu bewerten, beschreiben wir hier die Isolation dieser isolierten MNs und ihre Transfektion von Magnetofection.

Charcot-Marie-Zahn Krankheit In Vitro Modellierung durch Transfecting Maus primären Motoneurone

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Ein ex vivo Slice-Assay ermöglicht es, das okulomotorische Nervenwachstum in Echtzeit abzubilden. Die Scheiben werden durch Einbetten von E10.5 Isl MN:GFP-Embryonen in Agarose erzeugt, auf einem Vibram geschnitten und in einem Bühnen-Top-Inkubator wachsen. Die Rolle der Axon-Beratungswege wird durch Dieminadien zu den Kulturmedien bewertet.

Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Küken-Ziliarganglien (CG) sind Teil des parasympathischen Nervensystems. Neuronale Kulturen von Küken CG Neuronen wurden gezeigt, dass effektive Zellmodelle in der Studie der Nervenmuskel-Interaktionen. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Zerlegung, Dissoziation und In-vitro-Kultur von CG-Neuronen aus Kükenembryonen.

Isolation und Kultur von Chick Ciliary Ganglion Neurons

Lernen Sie die Isolation und Kultur von Okulomotor-, Trochlea- und Spinalmotorneuronen aus embryonalen Mäusen. Diese Methode ermöglicht vergleichende Studien zur selektiven Vulnerabilität bei ALS.

Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Isl^mn:GFP Transgene Mäuse

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