Name: Laserinduzierte Fluoreszenzemission (L.I.F.E.) als neuartiges nichtinvasives Werkzeug zur In-Situ-Messung von Biomarkern in kryosphärischen Lebensräumen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Anwendung der Laserinduzierten Fluoreszenzemission (L.I.F.E.) zur nichtinvasiven In-Situ-Messung von Biomarkern in kryosphärischen Lebensräumen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen von Chlorophyll A und Phycoerythrin.

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Die Autoren danken Oberst (IL) J.N. Pritzker, der Tawani Stiftung, USA, dem Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft (Sparkling Science SPA04_149 und SPA05_201), Alpine Forschungsstelle Obergurgl (AFO), Österreichisches Weltraumforum ( ÖWF), Roman Erler vom Hintertuxer Natur Eis Palast, der österreichische Bundesforst- und Stützpunktleiter Nick Cox von der Arktisstation in Ny Alesund (Svalbard). Wir sind auch Sabrina Obwegeser, Carina Rofner und Fabian Drewes für ihre Hilfe bei den Dreharbeiten dankbar. Abschließend möchten wir James Bradley dafür danken, dass er die Stimme für das videoerhaltende Video gegeben hat.

1. Kalibrierung und Validierung
HINWEIS: Bereiten Sie für die Pigmentkalibrierung Verdünnungsreihen aus Lagerlösungen von chla und B-PE vor. Die chleine Lagerlösung wird mit Aceton verdünnt und B-PE mit destilliertem sterilem Wasser verdünnt. Später werden 15 ml jedes Verdünnungsschritts benötigt. Schützen Sie die Pigmente vor Licht, indem Sie sie mit Aluminiumfolie umwickeln. Bewahren Sie die Chla in einem Gefrierschrank und die B-PE bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank auf. Ein detailliertes Protokoll für die Verdünnungszeile folgt in den Abschnitten 1.1 für chla und 1.2 für B-PE. Sowohl die chla als auch die B-PE-Laborkalibrierung zur Pigmentdetektion und -quantifizierung mit dem L.I.F.E.-Instrument werden nachfolgend beschrieben. Eine vorherige Kalibrierung24 wurde mit den gleichen Pigmenten wie in dieser Studie gemacht.
<ol><li>
Chlorophylleine Verdünnungsreihe
	<ol>
<li>1 mg chla (gereinigt aus A. nidulanen Algen) mit Aceton in einem 50 ml Probenröhrchen auflösen undeine Stammlösung mit Aceton auf folgende Endkonzentrationen verdünnen: 1.000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 1; und 0,5 ng/ml.</li>
		<li>15 ml jeder Verdünnung in 50 ml Probenrohre übertragen und aufgrund der Lichtempfindlichkeit mit Aluminiumfolie bedecken. Bewahren Sie die Rohre in einem -20 °C-Gefrierschrank auf, bis die Kalibrierungsmessungen durchgeführt werden. HINWEIS: Das Protokoll kann hier unterbrochen werden.</li>
		<li>Messen Sie die chla Absorptionsmerkmale aus jeder Verdünnung in einem Doppelstrahlspektrophotometer als Dreiklänglich und berechnen Sie den chleinen Inhalt, wie von Lorenzen25beschrieben, der in Abschnitt 2.2.2 ausführlich beschrieben wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PE-Verdünnungsreihe
	<ol>
<li>Eine 4 mg/ml B-PE-Stammlösung mit sterilem gefiltertem Wasser (pH = 7) auf folgende Endkonzentrationen verdünnen: 1.000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; und 5 ng/mL B-PE. 15 ml jeder Verdünnung in ein 50 ml Probenrohr geben und mit Aluminiumfolie bedecken. Bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung lagern. HINWEIS: Das Protokoll kann hier unterbrochen werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Setup für die Kalibrierung
	<ol>
<li>Erstellen Sie ein Rack, wie in Abbildung 5 dargestellt, um drei Messplattformen einzurichten, die jeweils 1,5 cm höher als die nächste sind. ANMERKUNG: Die Rack- und Säulenhöhe spielen eine wichtige Rolle für die Messungen, da die Oberfläche der Flüssigkeiten im Brennpunkt des L.I.F.E.-Instruments bleiben sollte, wie in Abbildung 5angegeben.</li>
		<li>Fügen Sie 5 ml der höchsten konzentrierten Verdünnung in eine Polyscintillation Kunststoff-Durchstechflasche und legen Sie es auf den höchsten Punkt des Racks. Messen Sie die Fluoreszenzintensität.</li>
		<li>Legen Sie die Durchstechflasche in die mittlere Position des Racks und fügen Sie weitere 5 ml (10 ml Gesamtvolumen) hinzu. Messen Sie die Fluoreszenzintensität. Wiederholen Sie den Vorgang an der niedrigsten Position auf dem Rack mit weiteren 5 ml (15 ml Gesamtvolumen; insgesamt 45 mm in Säulenhöhe). HINWEIS: Passen Sie die Belichtungszeit für jeden Verdünnungsschritt an, um eine Sättigung des Detektors (Grauwerte über 255 in 12-Bit-Bildern) und ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis der schwachen Fluoreszenzsignale zu verhindern.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2 und 1.3.3 mit allen Verdünnungen (Schritte 1.1.1 und 1.2.1) von chla und B-PE.</li>
		<li>Laden Sie die generierten Datendateien in den Datenreduktions-Assistenten, um die Grauwerte jeder Pixellinie entlang der Y-Achse (räumliche Verteilung) automatisch zu zählen und zusammenzufassen. HINWEIS: Unterschiedliche Belichtungszeiten werden automatisch kompensiert, indem die Fluoreszenzintensität auf eine Integrationszeit von 1 s normalisiert wird.</li>
		<li>Berechnen Sie die Pigmentflächendichte mit einer Poisson-Regressionsanalyse unter Verwendung der bekannten Konzentrationen aus der Verdünnungsreihe und der berechneten normalisierten Fluoreszenzintensitäten. Normalisieren Sie dann die Fluoreszenzzählungen von den drei verschiedenen Säulenhöhen auf 1,5 cm (5 ml), indem die Zählungen aus jeder Spaltenhöhe mit einem Faktor multipliziert werden (Faktoren 1, 0,5 und 0,33 für die Konzentrationslösungen 5 ml, 10 ml bzw. 15 ml).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig05.jpg"> Abbildung 5: Einrichtung für die L.I.F.E.-Kalibrierung mit chla und B-PE unter Laborbedingungen. (A) Linsenrohr des Instruments. (B) Grüner Laser für B-PE Anregung. (C) Blauer Laser für chleine Anregung. (D) Scintillationsdurchstechflasche. (E) Schwerpunkt des L.I.F.E.-Instruments. (F) B-PE/wasser oder chleine/acetonLösung mit 5 ml, 10 ml und 15 ml. (G) Abstandshalter, die die Oberfläche jeder Lösung drei verschiedene Volumina auf der Brennebene halten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
2. Probenahme und Probenverarbeitung
<ol><li>Sammlung von Schnee und Eis
	<ol>
<li>Schnee und supraglaziale Eis von einem Gletscher in sterile Polyethylenbeutel sammeln und bis zur Weiterverarbeitung gefroren aufbewahren. HINWEIS: Für diese Studie wurden die Proben in Midtre Lovenbreen (MLB) gesammelt, einem polythermischen Gletscher in der Nähe des Forschungsdorfes Ny-Elesund im hocharktischen Archipel Spitzbergen (78°53' N, 12°03' E).</li>
		<li>Proben Sie Bakterienmatten aus dem Gletschervorfeld in sterile Polyethylenbeutel und transportieren Sie alle Proben zur Weiterverarbeitung in ein Labor.</li>
		<li>Gefrorenes Material bei 4 °C langsam im Dunkeln schmelzen. Filtern Sie Flüssigkeitsproben auf GF/F-Filter (47 mm Durchmesser) und notieren Sie das gefilterte Volumen. Halten Sie die Filter bis zur weiteren Verarbeitung eingefroren.</li>
	</ol></li>
	<li>Chlorophylla Messungen
	<ol>
<li>Messen Sie den Filter mit dem L.I.F.E.-Instrument in vier zufälligen Bereichen, jeweils in Dreisprachigen mit dem grünen und blauen Laser. Berechnen Sie die Gesamtpigmentkonzentration, indem Sie die Flächendichte mit der gefilterten Fläche und dem gefilterten Volumen multiplizieren. Normalisieren Sie die Pigmentkonzentration (g/L) auf ein Volumen von 1 L.</li>
		<li>Bewerten Sie denchl-Inhalt der GF/F-Filter mit einem Laborstandard nach dem Protokoll von Lorenzen25. Dazu jeden filtern in eine Durchstechflasche mit 13 ml Aceton geben und über Nacht bei 4 °C im Dunkeln lagern. Als nächstes nehmen Sie eine Durchstechflasche und legen Sie sie auf Eis vor der Beschallung für 2 min bei 50% Leistung im kontinuierlichen Modus. Drücken und entfernen Sie den Filter aus der Durchstechflasche.</li>
		<li>Tygonschläuche an einer Spritze befestigen undeine Extraktions-Aceton-Mischung aus der Durchstechflasche entfernen. Ersetzen Sie den Tygonschlauch durch einen GF-5 Filterhalter. Übertragen Sie die Lösung in eine Quarzküvette.</li>
		<li>Nach der Kalibrierung des Absorptionsspektrometers für Aceton legen Sie die Probe in die Küvette in das Spektrometer und messen Sie die Absorptionsmerkmale zwischen 400–750 nm. Als nächstes entfernen Sie die Küvette aus dem Spektrometer und fügen Sie der Probe 200 L von 2 M HCl hinzu. Wiederholen Sie dann die Absorptionsmessung, um den Phaeophytingehalt in der Probe zu messen.</li>
	</ol></li>
	<li>Messung der mikrobiellen Aktivität durch radioaktiv markierte Marker und Auswirkungen der Laserintensität und Der Expositionszeit auf die Produktivitätsraten VORSICHT: Vorsicht vor der Markerradioaktivität (Strahlung). Verwenden Sie einen Labormantel, Handschuhe und Eine Brille und arbeiten Sie unter einer Dunstabzugshaube in einem lizenzierten Isotopenlabor.<ol>
<li>Für die bakterielle Produktion transferieren Sie fünf Aliquots von Bakterienmatten in sterile Polyethylenbeutel. Inaktivieren Sie die Kontrollen mit Formaldehyd auf eine Endkonzentration von 4%. HINWEIS: Für die 3H-gekennzeichnete Leucinaufnahme werden drei Aliquots und als Kontrollen zwei Aliquots verwendet.</li>
		<li>Setzen Sie die Matten mit einem blauen Laser (405 nm, 5 mW) und mit einem grünen Laser (532 nm, 5 mW) für je 10 s und 30 s aus. Wiederholen Sie den Vorgang mit 50 mW Lasern. Dann inaktivieren Sie die Proben, die nicht mit Formaldehyd behandelt wurden. HINWEIS: Eine Matte wird nur für eine Laserbelichtung verwendet. Verwenden Sie nicht exponierte mikrobielle Matten als Kontrollen.</li>
		<li>Schätzen Sie nach der Laserbehandlung die bakterielle und primäre Produktion unter Einbeziehung von 3H-Leucin bzw. NaH14CO3. Verwenden Sie für bakterielle Produktionsmessungen fünf Aliquots pro Probe (20 ml) und fügen Sie zwei der Parallelen Formalin (4 % Endkonzentration) hinzu, die als Steuerung für die abiotische Einbeziehung des Markers dienen. Fügen Sie 3H-Leucin (40 nM) zu allen Proben der verschiedenen Behandlungen hinzu und inkubieren Sie sie für 4 h unter In-situ-Bedingungen (0,1 °C). Beenden Sie die Reaktion, indem Sie den verbleibenden lebenden Proben Formalin hinzufügen.</li>
		<li>Für die bakterielle Produktion von Bakterienmatten, übertragen Sie markierte Proben in Kryovials. Extraktzellen mit 5% Trichloressigsäure und Zentrifuge bei 10.000 x g für 5 min nach den Protokollen von Kirchman26 und Bell27. Scintillationsflüssigkeit hinzufügen und das Kryovial in eine Polyscintillationsdurchstechflasche geben. Analysieren Sie die Proben mit einem flüssigen Szintillationszähler und berechnen Sie die Aufnahmeraten. HINWEIS: Für die 3H-markierte Leucinaufnahme werden drei Aliquots verwendet, zwei Aliquots werden als Kontrollen verwendet.</li>
		<li>Für die Primärproduktion fünf Repliken verschiedener Behandlungen (100 ml) vorbereiten, zwei davon in Aluminiumfolie wickeln, um die dunklen Proben nachzuahmen, und NaH14CO3 (1 CIs) zu allen hinzufügen. Inkubieren Sie für 4 h im Umgebungslicht und in situ Temperatur (0.1 °C). Beenden Sie die Reaktion, indem Sie die restlichen drei Replikationen verdunkeln und filtern Sie die Probe auf GF/F-Filter (25 mm Durchmesser).</li>
		<li>Fügen Sie den Filtern 100 L von 2 N HCl hinzu, um alle überschüssigen Kohlenstoffe zu entfernen und sie unter der Dunstabzugshaube auslüften zu lassen. Trocknen Sie die Proben auf einer Heizplatte bei 80 °C und legen Sie die Proben in Polysintillationsfläschchen.</li>
		<li>Um radioaktive Disintegrationen pro Minute (dpm) aller Behandlungen der primär- und bakteriellen Produktion zu messen, legen Sie die Kryovials in Polysintillationsfläschchen und fügen Sie 5 ml Szintillationscocktail hinzu. Messen Sie dpm mit einem flüssigen Szintillationszähler und berechnen Sie die Aufnahmeraten.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Boyd, E. S., Skidmore, M., Mitchell, A. C., Bakermans, C., Peters, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenesis+in+subglacial+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Methanogenesis in subglacial sediments.</a> Environmental Microbiology Reports. 2, 685-692 (2010).</li>
<li>Sattler, B., Puxbaum, H., Psenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+growth+in+supercooled+cloud+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Geophysical+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Bacterial growth in supercooled cloud droplets.</a> Geophysical Research Letters. 28, 239-242 (2001).</li>
<li>Good, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+developments+in+climate+change+science.+Part+I%3A+Understanding+of+future+change+in+the+large-scale+climate+system%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Physical+Geography%22%5BJournal%5D)">A review of recent developments in climate change science. Part I: Understanding of future change in the large-scale climate system.</a> Progress in Physical Geography. 35, 281-296 (2011).</li>
<li>Fountain, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Disappearing+Cryosphere%3A+Impacts+and+Ecosystem+Responses+to+Rapid+Cryosphere+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22BioScience%22%5BJournal%5D)">The Disappearing Cryosphere: Impacts and Ecosystem Responses to Rapid Cryosphere Loss.</a> BioScience. 62, 405-415 (2012).</li>
<li>Rignot, E., Mouginot, J., Morlighem, M., Seroussi, H., Scheuchl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread%2C+rapid+grounding+line+retreat+of+Pine+Island%2C+Thwaites%2C+Smith%2C+and+Kohler+glaciers%2C+West+Antarctica%2C+from+1992+to+2011%5BTitle%5D)+AND+%22Geophysical+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Widespread, rapid grounding line retreat of Pine Island, Thwaites, Smith, and Kohler glaciers, West Antarctica, from 1992 to 2011.</a> Geophysical Research Letters. 41, 3502-3509 (2014).</li>
<li>McMillan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ice+losses+from+Antarctica+detected+by+CryoSat-2%5BTitle%5D)+AND+%22Geophysical+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Increased ice losses from Antarctica detected by CryoSat-2.</a> Geophysical Research Letters. 41, 3899-3905 (2014).</li>
<li>Barletta, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glacier+shrinkage+and+modeled+uplift+of+the+Alps%5BTitle%5D)+AND+%22Geophysical+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Glacier shrinkage and modeled uplift of the Alps.</a> Geophysical Research Letters. 33, 14307(2006).</li>
<li>Nuth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decadal+changes+from+a+multi-temporal+glacier+inventory+of+Svalbard%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cryosphere%22%5BJournal%5D)">Decadal changes from a multi-temporal glacier inventory of Svalbard.</a> The Cryosphere. 7, 1603-1621 (2013).</li>
<li>Takeuchi, N., Kohshima, S., Seko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+formation%2C+and+darkening+process+of+albedo-reducing+material+%28cryoconite%29+on+a+Himalayan+glacier%3A+A+granular+algal+mat+growing+on+the+glacier%5BTitle%5D)+AND+%22Arctic+Antarctic+and+Alpine+Research%22%5BJournal%5D)">Structure, formation, and darkening process of albedo-reducing material (cryoconite) on a Himalayan glacier: A granular algal mat growing on the glacier.</a> Arctic Antarctic and Alpine Research. 33, 115-122 (2001).</li>
<li>Takeuchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+characteristics+of+cryoconite+%28surface+dust%29+on+glaciers%3A+the+relationship+between+light+absorbency+and+the+property+of+organic+matter+contained+in+the+cryoconite%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Glaciology%22%5BJournal%5D)">Optical characteristics of cryoconite (surface dust) on glaciers: the relationship between light absorbency and the property of organic matter contained in the cryoconite.</a> Annals of Glaciology. 34, 409-414 (2002).</li>
<li>Anesio, A. M., Hodson, A. J., Fritz, A., Psenner, R., Sattler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+microbial+activity+on+glaciers%3A+importance+to+the+global+carbon+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Change+Biology%22%5BJournal%5D)">High microbial activity on glaciers: importance to the global carbon cycle.</a> Global Change Biology. 15, 955-960 (2009).</li>
<li>Anesio, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+fluxes+through+bacterial+communities+on+glacier+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Glaciology%22%5BJournal%5D)">Carbon fluxes through bacterial communities on glacier surfaces.</a> Annals of Glaciology. 51, 32-40 (2010).</li>
<li>Storrie-Lombardi, M. C., Sattler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-Induced+Fluorescence+Emission+%28L.I.F.E%29%3A+In+Situ+Nondestructive+Detection+of+Microbial+Life+in+the+Ice+Covers+of+Antarctic+Lakes%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E): In Situ Nondestructive Detection of Microbial Life in the Ice Covers of Antarctic Lakes.</a> Astrobiology. 9, 659-672 (2009).</li>
<li>Murray, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+life+at+-13+%C2%B0C+in+the+brine+of+an+ice-sealed+Antarctic+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microbial life at -13 °C in the brine of an ice-sealed Antarctic lake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20626-20631 (2012).</li>
<li>Edwards, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+fungal+community+inhabiting+cryoconite+holes+on+glaciers+in+Svalbard%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Ecology%22%5BJournal%5D)">A distinctive fungal community inhabiting cryoconite holes on glaciers in Svalbard.</a> Fungal Ecology. 6, 168-176 (2013).</li>
<li>Miteva, V. Bacteria in Snow and Glacier Ice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiteva%2C+V+%22Psychrophiles%3A+from+Biodiversity+to+Biotechnology%22">Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology</a>. Margesin, R., Schinner, F., Marx, J. C., Gerday, C. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin/Heidelberg, Germany. 31-50 (2008).</li>
<li>Yallop, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysiology+and+albedo-changing+potential+of+the+ice+algal+community+on+the+surface+of+the+Greenland+ice+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Photophysiology and albedo-changing potential of the ice algal community on the surface of the Greenland ice sheet.</a> The ISME Journal. 6, 2302-2313 (2012).</li>
<li>Edwards, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metagenomic+snapshot+of+taxonomic+and+functional+diversity+in+an+alpine+glacier+cryoconite+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">A metagenomic snapshot of taxonomic and functional diversity in an alpine glacier cryoconite ecosystem.</a> Environmental Research Letters. 8, 035003(2013).</li>
<li>Remias, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+UV-and+VIS-absorbing%2C+purpurogallin-derived+secondary+pigment+new+to+algae+and+highly+abundant+in+Mesotaenium+berggrenii+%28Zygnematophyceae%2C+Chlorophyta%29%2C+an+extremophyte+living+on+glaciers%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Characterization of an UV-and VIS-absorbing, purpurogallin-derived secondary pigment new to algae and highly abundant in Mesotaenium berggrenii (Zygnematophyceae, Chlorophyta), an extremophyte living on glaciers.</a> FEMS Microbiology Ecology. 79, 638-648 (2012).</li>
<li>Cook, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+estimate+of+microbially+mediated+carbon+fluxes+from+the+Greenland+ice+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Glaciology%22%5BJournal%5D)">An improved estimate of microbially mediated carbon fluxes from the Greenland ice sheet.</a> Journal of Glaciology. 58, 1098-1108 (2012).</li>
<li>Mueller, D. R., Vincent, W. F., Pollard, W. H., Fritsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glacial+cryoconite+ecosystems%3A+a+bipolar+comparison+of+algal+communities+and+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Nova+Hedwigia+Beiheft%22%5BJournal%5D)">Glacial cryoconite ecosystems: a bipolar comparison of algal communities and habitats.</a> Nova Hedwigia Beiheft. 123, 173-198 (2001).</li>
<li>Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. C., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Huner, N. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+Acclimation+of+Photosynthetic+Microorganisms+to+Permanently+Cold+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Adaptation and Acclimation of Photosynthetic Microorganisms to Permanently Cold Environments.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70, 222-252 (2006).</li>
<li>Hodson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryoconite+ecosystem+on+the+Greenland+ice+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Glaciology%22%5BJournal%5D)">The cryoconite ecosystem on the Greenland ice sheet.</a> Annals of Glaciology. 51, 123-129 (2010).</li>
<li>Tilg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.I.F.E.%3A+laser+induced+fluorescence+emission%2C+a+non-invasive+tool+to+detect+photosynthetic+pigments+in+glacial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+SPIE.+8152%2C+Instruments%2C+Methods%2C+and+Missions+for+Astrobiology+XIV%2C+81520I%22%5BJournal%5D)">L.I.F.E.: laser induced fluorescence emission, a non-invasive tool to detect photosynthetic pigments in glacial ecosystems.</a> Proceedings SPIE. 8152, Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology XIV, 81520I. , (2011).</li>
<li>Lorenzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+chlorophyll+and+pheo-pigments%3A+spectrophotometric+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+%26+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Determination of chlorophyll and pheo-pigments: spectrophotometric equations.</a> Limnology & Oceanography. 12, 343-346 (1967).</li>
<li>Kirchman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+bacterial+biomass+production+and+growth+rates+from+leucine+incorporation+in+natural+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring bacterial biomass production and growth rates from leucine incorporation in natural aquatic environments.</a> Methods in Microbiology. , 227-238 (2001).</li>
<li>Bell, R. T. Estimating production of heterotrophic bacterioplankton via incorporation of tritiated thymidine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+RT+%22Handbook+of+methods+in+aquatic+microbial+ecology.+Edited+by%22">Handbook of methods in aquatic microbial ecology. Edited by</a>. Kemp, P. F., Cole, J. J., Sherr, B. F., Sherr, E. B. , CRC press. Boca Raton, FL. 495-503 (1993).</li>
<li>Groemer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+trial+of+a+dual-wavelength+fluorescent+emission+%28L.I.F.E.%29+instrument+and+the+Magma+White+rover+during+the+MARS2013+Mars+analog+mission%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Field trial of a dual-wavelength fluorescent emission (L.I.F.E.) instrument and the Magma White rover during the MARS2013 Mars analog mission.</a> Astrobiology. 14, 391-405 (2014).</li>
<li>Beutler, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Spectral+fluorescence+of+chlorophyll+and+phycobilins+as+an+in+situ+tool+of+phytoplankton+analysis-models%2C+algorithms+and+instruments%22">Spectral fluorescence of chlorophyll and phycobilins as an in situ tool of phytoplankton analysis-models, algorithms and instruments</a>. , Christian-Albrechts Universität Kiel. Doctoral dissertation (2003).</li>
<li>Krogmann, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discoveries+in+Oxygenic+Photosynthesis+%281727-2003%29%3A+A+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Discoveries in Oxygenic Photosynthesis (1727-2003): A Perspective.</a> Photosynthesis Research. 80, 15-57 (2004).</li>
<li>Corrêa, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+saturable+absorption+in+chlorophyll+A+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics+B%22%5BJournal%5D)">Reverse saturable absorption in chlorophyll A solutions.</a> Journal of Applied Physics B. 74, 559-561 (2002).</li>
<li>Kaňa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+S+to+M+fluorescence+rise+in+cyanobacteria+is+due+to+a+state+2+to+state+1+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The slow S to M fluorescence rise in cyanobacteria is due to a state 2 to state 1 transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1817, 1237-1247 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

eichung Es bestand eine lineare Korrelation zwischen Pigmentkonzentration und Fluoreszenzintensität nach normalisierender Photonenzahl auf eine Belichtungszeit von 1 s. Proben mit niedriger Säulenhöhe und niedrigen Pigmentkonzentrationen führten zu einer Überschätzung der Zielpigmente, im Vergleich zu höheren Säulenhöhen mit der gleichen Pigmentkonzentration. Darüber hinaus erforderten schwache Fluoreszenzsignale lange Belichtungszeiten für ausreichende Photonenzähler am Sensor. Die langen Integrationszeiten erhöhten jedoch auch die Menge an Streulicht am Sensor, was zu einer Verringerung des Signal-Rausch-Verhältnisses führte. In der aktuellen Version kann die Software während des Datenreduktionsprozesses nicht zwischen Rauschen und Signal unterscheiden. Daher führten Messungen der niedrigen Fluoreszenzintensität zu einer Pigmentüberschätzung, da Rauschen als Signal gezählt wurde, das von den Zielpigmenten abgeleitet wurde. Darüber hinaus zeigten Fluoreszenzintensitäten aus konzentrierteren Pigmentlösungen eine größere Variabilität als Lösungen mit geringer Konzentration. Dieser Effekt könnte durch Absorptionsprozesse innerhalb der Pigmentlösungen erklärt werden, die für die Kalibrierkurve verwendet wurden.
Datenvalidierung für Chlorophyllund Quantifizierung Nach dem Filtern von Eis- und Schneeproben tauchten die dreidimensionalen Proben fast als zweidimensionale Probe auf dem Filter auf. Dies rechtfertigte einen direkten Vergleich zwischen L.I.F.E (Flächendichte) und spektrophotometrischen Daten (volumetrische Messung).
Der Datensatz (Abbildung 8) zeigte, dass eine hohe Pigmentkonzentration zu einer Unterschätzung führt, während eine niedrige Pigmentkonzentration zu einer Überschätzung des tatsächlichen Wertes führt. Dieser Effekt kann durch die Dicke des Filterkuchens und damit durch den volumetrischen Charakter der Probe erklärt werden. Die Eindringtiefe des Lasers hing von der optischen Dichte und Dicke der Probe ab. Hohe Pigmentgehalte wurden unterschätzt, da der Laser keine Pigmentfluoreszenz in tieferen Schichten induzieren konnte. Bei dünnen Filterkuchen wurden jedoch niedrige Fluoreszenzsignale aufgrund geringer Flächendichten von Pigmenten erfasst. Offenbar zeigte der Filter selbst laserinduzierte Signale, nachdem er den 450 nm Langpassfilter passiert hatte (Abbildung 12). Dieses Signal wurde irreführend als Fluoreszenzsignal gezählt, das von chlaabgeleitet wurde. So sind dünne und zu dicke Filterkuchen mit dem L.I.F.E.-Instrument schwer zu messen.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig12.jpg"> Abbildung 12: Fluoreszenzsignale von dicken (A) und dünnen (B) Filterkuchen auf einem GF/F-Filter. (A) Selbstschattierung verhindert laserinduzierte Fluoreszenz aus tieferen Schichten, was zu einer Unterschätzung der tatsächlichen Pigmentkonzentration führt. (B) Fluoreszenzemission aus Filterkuchen mit Überlagerung durch Filterreflexionen. (C) Rohdaten zeigen Filterreflexion (grau). Die spektrale Eigenschaft eines Labors abgeleitet chlein Fluoreszenzmuster ist rot dargestellt. Maßstabsleiste = 45 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig12large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Einschränkungen des L.I.F.E.-Prototyps Während der Datenreduktion interpretierte die MATLAB-codierte Software die Rohbilder, indem sie Pixellinien innerhalb eines bestimmten Wellenlängenbereichs zusammenfasste. Die aktuelle Version der Software unterscheidet nicht zwischen organischen und anorganischen abgeleiteten Signalen. Das Vorhandensein mehrerer Signale kann zu einer Überschätzung des tatsächlichen Pigmentgehalts führen. Lange Expositionszeiten aufgrund niedriger Fluoreszenzintensitäten führten zu einer Verringerung des Signal-Rausch-Verhältnisses, wodurch der oben beschriebene Effekt gefördert wurde (siehe Abbildung 8 und Abbildung 12).
Ein in Abbildung 13 dargestelltes Geodegestein zeigte rotes fluoreszierendes Licht, wenn es mit grünem und blauem Licht ausgesetzt wurde. Derzeit ist nicht klar, ob die Fluoreszenz aus Mineralien oder aus Porphyrin-basierten Molekülen stammt. Daher kann eine Überlagerung biologischer und nichtbiologischer Signale die Anwendung dieser Methode einschränken und die Einrichtung einer Fluoreszenzdatenbank erfordern, die speziell für den L.I.F.E.-Prototyp erstellt wurde.
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig13.jpg"> Abbildung 13: Mineralfluoreszenz aus einem Geodegestein, gefunden in Ny-Elesund. Das Gestein wurde mit einem 532 nm 50 mW Laser (A) und einem 405 nm 50 mW Laser (B) angeregt. Beide Bilder wurden mit einem Polarisationsfilter an der Linse aufgenommen, was zu einer Fälschung der tatsächlichen Fluoreszenzfarben führte. (C) Echtes Farbbild ohne Verwendung eines Polarisationsfilters bei Tageslicht. Maßstabsleiste = 40 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig13large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Beutler undandere 29 kamen zu dem Schluss, dass charakteristische Emissionsspektren von Cyanobakterien in marinen Ökosystemen von Umweltbedingungen abhängen. Auch der Stoffwechselzustand hat einen Einfluss auf die Fluoreszenzeigenschaften in phototrophen Organismen30. Das L.I.F.E-Instrument kann zwischen dem Algen- und dem Cyanobakterienfluoreszenzmuster unterscheiden, indem Bio-Fingerabdruckbibliotheken verwendet werden, die spektrale Informationen der Probe enthalten, die mit Denkbedingungen korreliert sind.
In dunkel angepasstenChl-Molekülen sind alle Reaktionszentren vollständig oxidiert und für die Photochemie verfügbar und es wird keine Fluoreszenzausbeute abgeschreckt31. Mit dem L.I.F.E.-Verfahren wird eine Probe zunächst durch einen 532 nm Laser (grün) und dann mit einem 405 nm Laser (blau) angeregt. Während der zweiten Anregung durch den blauen Laser kann chla eine verringerte Fluoreszenzreaktion aufgrund der vorherigen Anregung durch den grünen Laser zeigen. Chla absorbiert Energie bei 532 nm Wellenlänge, trotz seines Abstands von seiner Absorption maximale Wellenlänge32. Vor der eigentlichen chleine Messung bei 405 nm kann der grüne Laser photochemische Reaktionen verursachen, die Abschreckungsmechanismen in den Zielpigmenten aktivieren. Darüber hinaus führte die Vorbeleuchtung mariner phototropher Organismen nicht zu einer Veränderung der Spektralnormkurven zwischen 450 nm–600 nm, während die Standardabweichung der Fluoreszenzintensitäten um 25%29zunahm. Je nach Art stiegen die Fluoreszenzintensitäten als Reaktion auf die vorherige Anregung sogar an. Dieses Thema bedarf weiterer Untersuchungen.
Anwendbarkeit Wir testeten das L.I.F.E. Instrument in verschiedenen Lebensräumen mit schwerpunkt auf Kryokonitlöchern. Der Laser wurde erfolgreich in Boden- und Biofilm-Lebensräumen eingesetzt, da während der Messung kein Umgebungslicht zur Welt kam. Kryokonitengranulat e.V. konnte gemessen werden, wenn Sedimentschichten Licht unter dem Loch blockierten (Abbildung 14A,C). Dünne Sediment-Kryokonitlöcher waren durchlässig für Streulicht von unten (Abbildung 14B). Stray-Licht stört die Messung. So ist die Pigmentkonzentration in nackten Eisflächen bei Tageslicht noch nicht messbar. Derzeit laufen Die Signalverarbeitungsbemühungen, um den Betrieb des Systems bei hohen Umgebungslichtverhältnissen zu ermöglichen.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig14.jpg"> Abbildung 14: Kryokonitloch mit flüssigem Wasser obendrauf. (A) Kryokonit auf Gletscher mit L.I.F.E. Linsenrohr. Maßstabsbalken = 70 mm. (B) Die Sedimentschicht (rot) ist sehr dünn. Stray Licht blutet durch die Kryokonitschicht. (C) Die Sedimentschicht ist dick genug, um das Streulicht von unten zu blockieren. Diese Art von Kryokonitloch ist mit dem L.I.F.E.-Instrument messbar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig14large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser L.I.F.E.-Instrument photoautotrophe Organismen in terrestrischen Lebensräumen wie Böden, Bakterienmatten, Biofilmen und in Kryokonitlöchern auf Gletscheroberflächen nachgewiesen hat. Die Zielmoleküle waren chla und B-PE. Die räumliche Auflösung betrug 30 m/px. Die Nachweisgrenze für chla betrug 250 pg/mL und 2 ng/ml für B-PE. Nach einer Laborkalibrierung konnten wir den Pigmentgehalt in Proben quantifizieren, die an unserem Studienort in der Arktis gesammelt wurden. Wir haben selbstprogrammierte Software für einen automatisierten Datenreduktionsprozess eingesetzt. Die Auswirkungen des Vorhandenseins von Mineralien und sich verändernden Lichtverhältnissen während der Messungen erfordern weitere Untersuchungen.
Mit der Klimaerwärmung führen steigende Temperaturen zu einer verbesserten Verfügbarkeit von flüssigem Wasser, was zu einer höheren biologischen Aktivität auf eisigen Oberflächen autotrophischer und heterotropher Natur führt. Es sollten energische Anstrengungen unternommen werden, um heterotrophe Organismen vor Ort zu erkennen, um ein vollständiges Bild des aktiven Lebens in der Kryosphäre zu vermitteln. Dies könnte mit anderen Zielpigmenten und geeigneten Laseranregungswellenlängen getestet werden. Damit bietet L.I.F.E. ein geeignetes Überwachungssystem, das eine hohe zeitliche und räumliche Auflösung für supraglaziale Bedingungen im Zusammenhang mit globalen Veränderungen sowie möglichen astrobiologischen Anwendungen bietet.

Die Kryosphäre beherbergt Meereis, Gletscher, Hochgebirgsseen, Schneegebiete, Seeeis, Schmelzwasserströme und Permafrost. Diese Gebiete bedecken etwa 11% der Landmassen der Erde1,2 und werden von der Atmosphäre als anerkannte kryosphärische Umgebung überförmig. Jüngste Studien zeigen, dass sich massive Bereiche der Kryosphäre schnell zurückziehen3,4. Die Antarktis5,6, die Alpen7, die Arktis8 undandere Regionen weisen negative Eismassenbilanzen auf. Der Rückzug von Eiskappen und Gletschern führt zur Erschöpfung unseres größten Süßwasserreservoirs der Erde. In einigen Gebieten ist der Gletscherrückzug unaufhaltsam5.
Lange Zeit galten Eisökosysteme als sterile Umgebungen. Trotz rauer Bedingungen ist das Vorhandensein von aktivem Leben in der Kryosphäre der Erde jedoch offensichtlich9,10,11,12,13,14,15 . Aufgrund des Trends zu massiven Eisverlusten durch Schmelzen durchläuft die Kryosphäre eine Verschiebung der biologischen Aktivität, die sich auf benachbarte Lebensräume auswirkt. Um diese teilweise irreversiblen Veränderungen zu verstehen, benötigen wir Methoden, um biologische Aktivität im Eis unter In-situ-Bedingungen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen.
In supraglazialen Umgebungen findet man Leben in Kryokonitlöchern, Schneedecken, geschmolzenem Wasser, Bächen und auf nackten Eisflächen. Die offensichtlichsten supraglazialen Lebensräume sind jedoch Kryokonitlöcher. Sie erscheinen weltweit in vergletscherten Umgebungen und wurden erstmals vom schwedischen Entdecker Adolf Erik Nordenskjold während einer Expedition nach Grönland in den 1870er Jahren16,17beschrieben. Der Name leitet sich von den griechischen Wörtern "kryos" (kalt) und "konia" (Staub) ab. Äolische-abgeleitete dunkle organische und anorganische Ablagerungen befestigen sich auf der Eisoberfläche und reduzieren die Albedo lokal. Die Sonneneinstrahlung fördert das Schmelzen der Trümmer in tiefere Eisschichten und bildet zylindrische Becken mit Sediment (Kryokonit) im Boden9. Kryokonitlöcher decken 0,1–10% der Gletscherablationszonen11ab.
Kryokonit-Gemeinschaften bestehen aus Viren, Pilzen, Bakterien, Cyanobakterien, Mikroalgen und Protozoen. Je nach Region können auch metazoische Organismen wie Färsen, Nematoden, Copepoden, Tardigrade und Insektenlarven gefunden werden. Edwards und andere18 beschreiben Kryokonitenlöcher als "eiskalte Hotspots". Sie verfolgten auch funktionelle Gene in Kryokonitlöchern, die für N, Fe, S und P Radfahren verantwortlich sind. Die Mini-See-Ökosysteme atmen und photosynthetisieren mit Raten in viel wärmeren und nährstoffreicheren Lebensräumen11. Diese Ergebnisse unterstreichen die wichtige Rolle der mikrobiellen Sequestrierung in supraglazialen Umgebungen. Neben lebenden Gemeinschaften in Kryokonitlöchern werden nackte Eisflächen von Eisalgen bewohnt. Ihre Physiologie ist gut untersucht19 aber ihre räumliche Verteilung wurde nicht bewertet20. Ihre Anwesenheit in supraglazialen Umgebungen verringert die Albedo und fördert damit das Schmelzen, das zu einer Nährstoffaushuntung und Nährstoffeintrag in nachgelagerte Lebensräume führt9. Steigende Temperaturen und damit eine höhere Verfügbarkeit von flüssigem Wasser beeinflussen die Netto-Ökosystemproduktivität in diesen eisigen Ökosystemen.
In supraglazialen Umgebungen wandeln photosynthetisch aktive Organismen anorganischen Kohlenstoff und Stickstoff in organische, verfügbare Quellen für das mikrobielle Nahrungsnetz21,22um. Bisher gibt es nur wenige Studien, die supraglaziale Kohlenstoffflüsse11,20,23" schätzen. Die Diskrepanz bei den vorgeschlagenen Co2-Flussraten resultiert aus einer geringen räumlichen und zeitlichen Datenauflösung. Darüber hinaus wird die räumliche Verteilung supraglazialer Gemeinschaften außerhalb von Kryokonitlöchern kaum beurteilt. Cook undandere 20 sagten in ihren Modellen voraus, dass supraglaziale Algengemeinschaften aufgrund ihrer großen Oberflächenabdeckung bis zu 11-fach mehr Kohlenstoff fixieren als zeitgenössische Kryokonitlöcher. Der Nachweis supraglazialer Algengemeinschaften, die die Probenintegrität gewährleisten, wird aufgrund fehlender Werkzeuge zur In-situ-Erkennung und Quantifizierung immer noch behindert.
Als Reaktion auf logistische Schwierigkeiten werden Eisökosysteme seltener untersucht als Lebensräume in gemäßigten Gebieten. Die Datenauflösung hängt von der Anzahl der bewerteten Proben ab und hängt von der Zugänglichkeit der Studienstandorte ab. Standard-Probenahmeverfahren wie Sägen, Koringen und anschließendes Schmelzen beinhalten eine Manipulation der mikrobiellen Gemeinschaft. Beispielsweise ist eine Chlorophyll-a-Bewertung in Festisproben mit Standardmethoden ohne wesentliche Eingriffe nicht möglich. Daher sind schmelzinduzierte Temperaturänderungen innerhalb der untersuchten mikrobiellen Gemeinschaften unvermeidbar. Als Reaktion auf die Thermolität des Photosystems II und anderer zellulärer Strukturen bei Psychrononen22führen Laboranalysen von geschmolzenen Eisproben immer zu einer Verfälschung von In-situ-Bedingungen.
Zerstörungsfreie In-situ-Messungen sind der einzig vernünftige Weg, um zuverlässige Daten zu erhalten. Dieses Ziel kann mit fluoreszenzbasierten Methoden erreicht werden. Aufgrund ihrer leichten Erntefunktion sind chla und B-Phycoerythrin (B-PE) in Organismen vorhanden, die zum Kohlenstoffkreislauf in supraglazialen Umgebungen beitragen, wie Von Anesio und anderen11nachgewiesen wurde. Daher sind diese fluoreszierenden Moleküle geeignete Biomarker für die Quantifizierung mikrobiellen vermittelten Kohlenstoffflüsse in Eisökosystemen.
In dieser Studie stellen wir die Entwicklung, Kalibrierung und Anwendbarkeit eines neuartigen nicht-invasiven Werkzeugs zur In-situ-Quantifizierung von chla- und B-PE-Molekülen in terrestrischen und Eisökosystemen vor. Das Prototypgerät basiert auf laserinduzierter Fluoreszenzemission, auch bekannt als L.I.F.E. Das optische Instrument (Abbildung 1) erfasst fluoreszierende Biomarker-Signaturen nach laserinduzierter Fluoreszenzerregung. Das Verfahren ist zerstörungsfrei und kann am Studienort oder im Labor durchgeführt werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig01.jpg"> Abbildung 1: Der L.I.F.E.-Prototyp. Links: Foto des Instruments ohne Schutzdeckel. Rechts: Schematische Darstellung des Instruments. Gesamtmasse = 5,4 kg (Laser und Optik = 4,025 kg, Laptop = 1,37 kg). Aluminiumrahmen = 32,5 cm x 20,3 cm x 6,5 cm. Optisches Rohr: 18,4 cm x 4 cm (Durchmesser). CCD: bluefox mv220g Sensor; F: servogesteuerte Langpassfilter (450 nm und 550 nm); L: optische Linsen; M1: Spiegel; M2: dichroitischer Spiegel; MC: Mikrocontroller; P: Prisma; PBS: polarisierender Strahlteiler; S: Schlitzöffnung aus verstellbaren Rasierklingen. Maßstabsleiste = 70 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Das tragbare Dual-Wellenlängen-Kit wiegt 4,5 kg und wird auf einem Stativ in Kombination mit einem externen Computer verwendet. Die Feldeinrichtung ist schnell und einfach. Das Gerät ist am Stativ befestigt, und das Linsenrohr wird zusammen mit einem USB-Kabel und dem Kamerakabel am Gerät befestigt. Der externe Computer ist über ein USB-Kabel mit dem Gerät verbunden. Die Stativbeine sind so eingestellt, dass das Linsenrohr auf die Probe gerichtet ist und die Probe bedeckt. Dann trifft ein 5 mW grüner Laser die Probe, nachdem er einen polarisierenden Strahlsplitter passiert hat, der polarisiertes Licht in Richtung der optischen Achse des Spektrometers umleitet. Die Probe zeigt ein fluoreszierendes Licht, rot in Abbildung 1dargestellt. Die Hälfte des kollimierten Lichts passiert den polarisierenden Strahlteiler und wird durch einen servogesteuerten Langpassfilter fokussiert, der die Lasersignale entfernt. Als nächstes trifft das Signal auf einen Blendenschlitz, der aus zwei verstellbaren Rasierklingen besteht. Ein Prisma trennt die feine Linie des orthogonalen Lichts spektral von der Schlitzöffnung, bevor das Signal vom Sensor erfasst wird. Das Verfahren wird mit einem blauen Laser wiederholt. Die Rohdaten werden automatisch an einen tragbaren Computer übertragen, der auch für den Softwarebetrieb verwendet wird.
Das Gerät wird von einem externen Computer über eine LabVIEW-Umgebung gesteuert, die die Bildaufnahme mit der CCD-Kamera synchronisiert, Laser ein-/ausschalten und das Langpass-Filterrad drehen. Die grafische Benutzeroberfläche (GUI) ist in drei Hauptabschnitte unterteilt. Die Belichtungseinstellung erfolgt manuell. Obwohl die Korrektur zwischen Belichtungszeit und Signalintensität linear ist (Abbildung 2B), ist die maximale Belichtungszeit auf 10 s begrenzt, da längere Integrationszeiten zu einer signifikanten Verringerung des Signal-Rausch-Verhältnisses führen. Das Kommentarfeld wird für die Beschreibung der Stichprobe verwendet (Abbildung 2A). Im rechten Bereich werden Rohbilder angezeigt, sobald die Messungen abgeschlossen sind. Diese Funktion ist für die sofortige Datenauswertung vor Ort von entscheidender Bedeutung (Abbildung 2C–E). Rote Bereiche zeigen überbelichtete Pixel an, die durch Eine Verkürzung der Belichtungszeit vermieden werden können.
Der nachfolgende Rohdatenreduktionsprozess ist vom Bildaufnahmeverfahren entkoppelt und kann jederzeit nach der Bildaufnahme durchgeführt werden.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig02.jpg"> Abbildung 2: Grafische Benutzeroberfläche von L.I.F.E. für die Datenerfassung und Rohdatenauswertung. (A) Die Software ermöglicht manuelle Texteingabe für Beispielbeschreibungen. (B) Die Belichtungszeit kann vor der Messung eingestellt werden. (C-E) Die Rohbilder werden auf der rechten Seite der Benutzeroberfläche angezeigt. (E) Rote Farben zeigen eine Sättigung des Sensors an. (F) Die Aktivierung der Schaltfläche RUN MEASUREMENT löst den Datenerfassungsprozess aus. Im Array (G) werden alle Befehle angezeigt, die während der Datenerfassung automatisch ausgeführt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig03.jpg"> Abbildung 3: Beispiel für ein Rohbild. Links: Rohdaten von chlein Standard in Aceton-Lösung, aufgezeichnet mit dem L.I.F.E Instrument. Aufgrund der optischen Eigenschaften des Geräts wird das Signal als verzogene Linie angezeigt. Rechts: Interpretation des Rohbildes pro Pixel (px). Die Spektralachse (5 nm/px Auflösung) wird gegen die räumliche Achse (30 m/px-Auflösung) geplottet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die 12-Bit-Rohbilder im Graumaßstab zeigen eine räumliche Komponente aufgrund des eindimensionalen Blendenschlitzes und eine Spektralkomponente aufgrund des Prismas vor der CCD (Abbildung 3). Als Reaktion auf optische Einschränkungen werden die Rohbilder verzerrt. Daher müssen sie beschnitten und entzerrt werden, indem ein Code angewendet wird, der den Grad der Verzerrung erkennt. Dies geschieht mit einem Software-Assistenten(Abbildung 4). Als nächstes erfolgt die Wellenlängenkalibrierung mit dem 532 nm Laser. Das grüne Licht wird durch Frequenzverdoppelung eines 1.064 nm Infrarotlasers erzeugt. Beide Wellenlängen können von der CCD erfasst werden und daher kann die Spektralposition jedes Pixels in entzerrten Bildern automatisch berechnet werden (Abbildung 4).
Das Bild wird dann auf einen bestimmten Wellenlängenbereich heruntergeschnitten (550–1.000 nm für grüne Lasermessungen und 400–1.000 für blaue Lasermessungen). Graue Werte aus jedem Pixel in einer ausgewählten Pixellinie werden gezählt und summiert. Ein Grauwert kann zwischen 0 und 255 liegen. Danach ist jede Pixellinie für eine Zahl. Weitere Softwareanweisungen auf dem Bildschirm führen zur Generierung eines Diagramms, das die Grauwertzahlen jeder Pixellinie zeigt, die gegen die räumlichen Koordinaten gezeichnet wird. Dies ermöglicht eine quantitative räumliche Diskriminierung von chla und B-PE gleichzeitig in der Stichprobe. Darüber hinaus können die spektralen Eigenschaften eines Samples automatisch aus ausgewählten Pixellinien gezeichnet werden.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig04.jpg"> Abbildung 4: Dewarping von Rohbildern. Links: Rohbild, das mit einem grünen Laser aufgenommen wurde. Es wurde kein Filter verwendet. Die Signale werden bei 532 nm und 1.064 nm angezeigt. Belichtungszeit = 0,015 s. Mitte: Das zugeschnittene 532 nm Signal wird als Referenzlinie verwendet, um einen Satz von Bildern zu entwirn. Rechts: Das verzerrte Bild aus der Rohbildquelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Merck</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>B-Phycoerythrin</td><td>Invirtrogen</td><td>P6305</td><td></td></tr><tr><td>Chlorophyll a Standard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6144-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Merck</td><td>HT501128</td><td>36%</td></tr><tr><td>GF/C Filter</td><td>Whatman</td><td>WHA1822025</td><td>25mm Durchmesser</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>H1758</td><td>36,5-38% </td></tr><tr><td>L.I.F.E. Prototyp</td><td>Universität Innsbruck</td><td></td><td>built on demand</td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Software, Laboratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench</td></tr><tr><td>Leucin, L-[4,5-3H], 1 mCi</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET1166001MC</td><td>radioaktiv</td></tr><tr><td>Flüssigszintillation Cocktail Beckman Ready Use</td><td>Beckman</td><td>nicht mehr verfügbar, kompensierbar durch Ultra Gold, Packard</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigszintillationszähler</td><td>Beckman</td><td>nicht vorrätig</td><td>LSC 6000 IC</td></tr><tr><td>NaH14CO3 (4 & micro; Ci/ml)</td><td>DHI Dänemark</td><td>4 &mu; Ci/ml, 1 ml</td><td>radioaktiv</td></tr><tr><td>Osmonics Polycarbonat Filter</td><td>DHI Dänemark</td><td>PCTE</td><td>25mm Durchmesser, 0,2&micro; m Porengröße</td></tr><tr><td>Polyszintillationsfläschchen</td><td>Perkin Elmer</td><td>WHA1825047</td><td>20ml</td></tr><tr><td>Probenröhrchen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318-500EA</td><td>Greiner Zentrifugenröhrchen, 50ml</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td>Modell U2001, jedes Photometer für die Absorptionsspektroskopie mit Messungen bei 664nm und 750nm wäre geeignet</td></tr><tr><td>Trichloressigsäure (TCA)</td><td>Merck</td><td>T6399</td><td>Nanolabor für 100</td></tr><tr><td>%Ultraschallsonde</td><td></td><td>QS1T-2</td><td></td></tr></tbody></table>

laserinduzierte fluoreszenzemission (l.i.f.e.) als neuartiges nichtinvasives werkzeug zur in-situ-messung von biomarkern in kryosphärischen lebensräumen

Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E.) as Novel Non-Invasive Tool for In-Situ Measurements of Biomarkers in Cryospheric Habitats

Die globale Erwärmung wirkt sich auf mikrobielle Gemeinschaften in einer Vielzahl von Ökosystemen aus, insbesondere in kryosphärischen Lebensräumen. Über mikrobielle Kohlenstoffflüsse in extremen Umgebungen ist jedoch wenig bekannt. Daher impliziert die in den wenigen verfügbaren Studien beschriebene Methodik der Stichprobenerfassung zwei Hauptprobleme: A) Daten mit hoher Auflösung erfordern eine große Anzahl von Proben, was in abgelegenen Gebieten nur schwer zu erhalten ist; B) unvermeidbare Probenmanipulationen wie Schneiden, Sägen und Schmelzen von Eiskernen, was zu einem Missverständnis der In-situ-Bedingungen führt. In dieser Studie wird ein Prototyp-Gerät vorgestellt, das weder Probenvorbereitung noch Probenzerstörung erfordert. Das Gerät kann für In-situ-Messungen mit hoher spektraler und räumlicher Auflösung in terrestrischen und Eisökosystemen eingesetzt werden und basiert auf der Laser-Induced Fluorescence EMission (L.I.F.E.) Technik. Photoautotrophe supraglaziale Gemeinschaften können durch den Nachweis von L.I.F.E.-Signaturen in Photopigmenten identifiziert werden. Die L.I.F.E.-Instrumentenkalibrierung für die Porphyrinderivate Chlorophylla (chla) (405 nm Laseranregung) und B-Phycoerythrin (B-PE) (532 nm Laseranregung) wird demonstriert. Für die Validierung dieser Methodik wurden l.I.F.E.-Daten mit einer konventionellen Methode zurChl-Quantifizierung ratifiziert, die die Pigmentextraktion und die anschließende Absorptionsspektroskopie umfasste. Der Prototyp der Anwendbarkeit im Feld wurde in extrem polaren Umgebungen nachgewiesen. Weitere Tests an terrestrischen Lebensräumen fanden während der Mars-Analogsimulationen im marokkanischen Dessert und auf einem österreichischen Felsengletscher statt. Das L.I.F.E.-Instrument ermöglicht hochauflösende Scans großer Flächen mit akzeptabler Betriebslogistik und trägt zu einem besseren Verständnis des ökologischen Potenzials supraglazialer Gemeinschaften im Kontext des globalen Wandels bei.

Laborkalibrierung für B-PE Die Ansprechsignale der B-PE-Verdünnungsreihe wurden mit dem L.I.F.E.-Instrument in einem dunklen Raum bei 20 °C gemessen (Abbildung 6). Die Zählrate hing sowohl von der Konzentration als auch von der Spaltenhöhe der gemessenen Probe ab. Niedrige Konzentration und niedrige Säulenhöhe B-PE-Proben fluoreszenzierten stärker im Vergleich zu Proben der gleichen Konzentration und höheren Säulenhöhe.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig06.jpg"> Abbildung 6: B-PE-Laborkalibrierung. B-PE-Inhalts- und Spaltendichtekalibrierung wird angezeigt. Normalisierte Zählraten wurden für eine Spaltenhöhe von 1,5 cm berechnet. Nachdruck mit Erlaubnis28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Für die endgültige Anpassung der Kalibrierlinie wurde eine Poisson-Regression verwendet. Es gab eine lineare Korrelation zwischen der Flächendichte und der Anzahl der Pixelgrauwerte. Die Funktion der Kurve war y = 81.04x (Abbildung 7), was bedeutet, dass eine Grauwertzahl von 8.104 in einer 1 s exponierten Probe einer Flächendichte von 100 ng/cm2 B-PE entsprach. Die chleine Kalibrierung wird analog eingerichtet. Die Funktion war y = 8.94x.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig07.jpg"> Abbildung 7: Endgültige Kalibrierkurve für B-PE. Die Grauwertzählungen wurden auf eine Belichtungszeit von 1 s normalisiert und gegen die Flächendichte dargestellt. Nachdruck mit Berechtigung28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Anwendung auf Kryokonitproben aus Spitzbergen und Laborvalidierung von Daten Die Mittelwerte der L.I.F.E.-Messungen und die Einzelmessungen der gleichen Proben, die aus der konventionellen Extraktion mit Aceton und anschließender Analyse mit einem Spektralphotometer abgeleitet wurden, sind in Abbildung 8dargestellt.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig08.jpg"> Abbildung 8: Datenvalidierung mit natürlichen Proben. Die Proben (MLB) werden nach chla Gehalt geordnet, basierend auf den Ergebnissen eines Laborspektrophotometers (Einzelwerte) und im Vergleich mit dem chleine Fluoreszenzdaten gemessen an vier zufälligen Bereichen pro Filter. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der L.I.F.E.-Messungen dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Chlein Inhalt von 48 g/L–L–67 g/L wurden unterschätzt, und niedrigereChl-Inhalte von 0,7 g/L–7 g/l wurden vom L.I.F.E.-Prototyp überschätzt. Die Standardabweichungen von den L.I.F.E.-Messungen waren gering.
Vergleich von Spektraldaten aus In-situ-Messungen mit Laborstandards Chla spectra waren vergleichbar zwischen Kryokonitproben und solchen von a. nidulans Algen. Die Fluoreszenzspitzen in allen Proben lagen bei 700 nm–710 nm. Spektren, die aus Kryokonitproben abgeleitet wurden, zeigten jedoch höhere Rauschsignale zwischen 400 nm–650 nm und von 800 nm–1.000 nm im Vergleich zu Spektren deschl-Pigmentstandards (Abbildung 9).
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig09.jpg"> Abbildung 9: Interpretation von Spektraldaten. Messungen von vier Kryokonitgranulaten (blau) und einem chleiner Standardpigmentlösung (rot) nach Anregung mit 405 nm Lasern. Die Spektren wurden 1 Jahr nach der Probenentnahme aufgezeichnet. Die Proben wurden eingefroren und vor der Messung nicht dem Licht ausgesetzt. Als Reaktion auf Probleme bei der Wellenlängenkalibrierung befindet sich der Fluoreszenz-Peak bei 700 nm–710 nm statt 680 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Automatisierte Kryokonitkornanalyse In einem Beispiel für eine automatisierte Analyse eines Kryokonitlochs (Abbildung 10) wurden die höchsten Pigmentbereichsdichten an der Pixellinie 50 beobachtet. Das Probenspektrum nach Anregung mit einem 532 nm Laser zeigte eine Spitze mit einem Abgeschnittenen bei einem Grauwert von 255 als Reaktion auf eine Übersättigung des Sensors. Dieser Peak stammt vom grünen Laser und nicht vom Fluoreszenzsignal.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig10.jpg"> Abbildung 10: Automatisierte Datenanalyse eines einzelnen Kryokonitengranulats mit einem Durchmesser von 1 mm. Die Probe wurde in Vestre Br'ggerbreen (VBB) entnommen und innerhalb von 4 stunden nach einer Probenahme in einem dunklen Laborraum in der Arctic Station (GB) in Ny-Ilesund gemessen. Die linke Spalte zeigt B-PE-Messungen und die rechte Spalte stellt chla Daten dar. Die Rohbilder werden oben angezeigt. Laserinduzierte Fluoreszenzreaktionen werden in Grau angezeigt. Rote Bereiche zeigen die Reaktion von Standardpigmenten an. Der Mittelteil veranschaulicht die räumliche Verteilung der Zielpigmente. Die spektralen Eigenschaften des Fluoreszenzsignals werden in den unteren Bildern angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Auswirkungen der Lasererregung auf die Produktivität in Bakterienmatten Weder die primäre noch die bakterielle Produktivität wurden bei der Erhöhung der Leistung des Lasers und/oder der Belichtungszeit beeinträchtigt (Abbildung 11). Bei Laserbehandlungen mit erhöhter Leistung wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig11.jpg"> Abbildung 11: Produktivitätsmessungen von Proben aus Spitzbergen. Bakterielle Matten wurden mit grünen und blauen Lasern mit unterschiedlichen Laserintensitäten und Belichtungszeiten belichtet. Die Daten werden entsprechend der Laserwellenlängenquelle (grün und blau) eingefärbt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig11large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Kohlenstoffflüsse in der Kryosphäre sind noch kaum bewertet, aber entscheidend für den Klimawandel. Hier zeigen wir ein neuartiges Prototypgerät, das das phototrophe Potenzial in supraglazialen Umgebungen auf Basis laserinduzierter Fluoreszenzemission (L.I.F.E.) mit Daten mit hoher spektraler und räumlicher Auflösung unter in situ-Bedingungen erfasst.

Laserinduzierte Fluoreszenzemission (L.I.F.E.) als neuartiges nichtinvasives Werkzeug zur In-Situ-Messung von Biomarkern in kryosphärischen Lebensräumen

Global warming affects microbial communities in a variety of ecosystems, especially cryospheric habitats. However, little is known about ...

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, ein neuartiges Gerät zu kalibrieren und zu testen, das für In-situ-Messungen von Biomarkern in kryosphärischen Lebensräumen verwendet werden kann. Das Gerät basiert auf der laserinduzierten Fluoreszenz-Emissionstechnologie, die als LIFE bezeichnet wird. Die derzeitigen Standard-Probenahmeverfahren führen zu physikalischen Auswirkungen auf die Probe aufgrund von Steinbruch, Zerfall von Proben durch Absplittern und Sägen und Temperaturverschiebung durch Schmelzen.Diese Methoden führen oft zur Fälschung von In-situ-Bedingungen. Daher ist eine neue Methodik zur In-situ-Erkennung und Charakterisierung von mikrobiellem Leben von entscheidender Bedeutung. Wir haben eine neuartige nicht-invasive, zerstörungsfreie Methode mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung entwickelt.Die Anwendung einer laserinduzierten Fluoreszenzemissionstechnik basiert auf der Tatsache, dass supraglaziale Umgebungen unter anderem von phototropen Organismen bewohnt werden. Diese Organismen können durch den Nachweis von fluoreszierenden Mustern der porphyrinbasierten Zubehörpigmente Chlorophyll A und Phycoerythrin, die jeweils durch einen blauen und grünen Laser angeregt werden, zurückverfolgt werden. Das tragbare Dual-Wellenlängen-Kit wiegt 4,5 Kilogramm und wird auf einem Stativ in Kombination mit einem externen Computer verwendet.Das Linsenrohr ist auf die Probe gerichtet. Dann trifft ein grüner Fünf-Milliwatt-Laser die Probe, nachdem er einen polarisierenden Strahlsplitter passiert hat, der polarisiertes Licht in Richtung der optischen Achse des Spektrometers umleitet. Das Exemplar zeigt ein rot dargestelltes Fluoreszenzlicht.Die Hälfte des kollimierten Lichts passiert den Polarisationsstrahlteiler und wird durch einen Langpassfilter fokussiert, der die Lasersignale entfernt. Als nächstes trifft das Signal auf einen Blendenschlitz, der aus zwei verstellbaren Rasierklingen besteht. Ein Prisma trennt spektral eine feine Linie von leichtem Orthogonal zur Schlitzöffnung, bevor das Signal auf einem Sensor erfasst wird.Das Verfahren wird mit dem blauen Laser wiederholt. Die Rohdaten werden automatisch an einen tragbaren Computer übertragen, der auch für den Softwarebetrieb verwendet wird. Es ist in drei Hauptabschnitte unterteilt.Die Belichtungseinstellung erfolgt manuell. Hier ist die Korrektur zwischen Belichtungszeit und Signalintensität linear. Das Kommentarfeld wird für die Beschreibung eines Beispiels verwendet.Im rechten Bereich werden Rohbilder angezeigt, sobald die Messung abgeschlossen ist. Diese Funktion ist für die sofortige Datenauswertung vor Ort von entscheidender Bedeutung. Rote Bereiche zeigen überbelichtete Pixel an, die durch Eine Verkürzung der Belichtungszeit vermieden werden können.Die 12-Bit-Graustufen-Rohbilder zeigen eine räumliche Komponente aufgrund des eindimensionalen Blendenschlitzes und eine Spektralkomponente aufgrund des Prismas vor dem CCD. Als Reaktion auf optische Einschränkungen werden die Rohbilder verzerrt. Daher müssen sie beschnitten und entzerrt werden, indem ein Code angewendet wird, der den Grad der Verzerrung erkennt.Als nächstes erfolgt die Wellenlängenkalibrierung mit Hilfe des 532 Nanometer Lasers. Das grüne Licht wird durch Frequenzverdoppelung von 1, 064 Nanometer Infrarotlaser erzeugt. Beide Wellenlängen können von der CCD erfasst werden und somit kann die Spektralposition jedes Pixels in entzerrten Bildern berechnet werden.Anschließend wird das Bild auf einen bestimmten Wellenlängenbereich heruntergeschnitten. Graue Werte aus jedem Pixel in einer ausgewählten Pixellinie werden gezählt und summiert. Ein Grauwert kann zwischen Null und 255 liegen.Danach ist jede Pixellinie für eine Zahl. In diesem Diagramm werden die Grauwertzahlen jeder Pixellinie anhand der räumlichen Koordinaten dargestellt. Dies ermöglicht eine quantitative räumliche Diskriminierung von Chlorophyll und Phycoerythrin gleichzeitig innerhalb der Probe.Darüber hinaus können die spektralen Eigenschaften eines Samples aus ausgewählten Pixellinien gezeichnet werden. Die Feldeinrichtung ist schnell und einfach. Befestigen Sie das Instrument auf einem Stativ.Befestigen Sie das Linsenrohr am Gerät. Schließen Sie das Arduino USB-Kabel und das Kamerakabel an. Schließen Sie den externen Computer über ein USB-Kabel mit dem Gerät an.Passen Sie die Stativbeine so an, dass das Linsenrohr die Probe bedeckt. Führen Sie die Software aus, beschreiben Sie das Beispiel, und starten Sie einen Messlauf. Für die Pigmentkalibrierung eine Verdünnungsreihenserie aus einer Serienlösung wie dargestellt vorbereiten.Die Chlorophyll-A-Stammlösung muss mit Aceton verdünnt werden und die Verdünnung von Phycoerythrin wird mit destilliertem sterilem Wasser durchgeführt. Fünfzehn Milliliter pro Verdünnungsschritt werden später benötigt. Schützen Sie die Pigmente vor Licht, indem Sie sie unter Aluminiumfolie wickeln.Chlorophyll in einem Gefrierschrank und das Phycoerythrin bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahren. Als nächstes bauen Sie ein Rack, wie gezeigt mit einem Höhenunterschied von 1,5 Zentimetern gezeigt. Fügen Sie fünf Milliliter der höchsten konzentrierten Verdünnung in eine Poly-Szintillations-Kunststoff-Durchstechflasche.Dieses Volumen entspricht einer 15 Millimeter hohen Wassersäule in der Durchstechflasche und misst die Fluoreszenzintensität. Legen Sie dann die Durchstechflasche in die mittlere Position des Racks und fügen Sie weitere fünf Milliliter der gleichen Lösung hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang mit weiteren fünf Millilitern, was 45 Millimetern in Spaltenhöhe entspricht.Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Verdünnungsschritten für Chlorophyll und Phycoerythrin. Die Rack- und Säulenhöhe spielen eine wichtige Rolle für die Messung, da die Oberfläche der Flüssigkeiten im Mittelpunkt des LIFE-Instruments liegt. Sammeln Sie Schnee- und Eisproben von einem Gletscher.Sammeln Sie zusätzlich mikrobielle Mattenproben aus dem Gletschervorfeld. In dieser Studie wurde Midtre Lovenbreen ausgewählt, ein Gletscher in der Nähe der Forschungseinrichtungen von Ny-Alesund im hocharktischen Archipel von Spitzbergen. Schnee- und Eisproben schmelzen und unter GF/F-Filtern vakuumfiltern.Beachten Sie das gefilterte Volume. Messen Sie dann die Filter mit dem LIFE-Gerät auf vier zufälligen Bereichen in Dreiern mit dem grünen und blauen Laser. Berechnen Sie die Gesamtpigmentkonzentration, indem Sie die Flächendichte mit der gefilterten Fläche und dem gefilterten Volumen multiplizieren.Normalisieren Sie die Pigmentkonzentration auf ein Volumen von einem Liter. Die Filter in eine Durchstechflasche mit 30 Milliliter Aceton geben und über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln lagern. Als nächstes nehmen Sie eine Durchstechflasche und legen Sie sie vor der Beschallung zwei Minuten lang bei 50 % Leistung im kontinuierlichen Modus auf Eis.Drücken und entfernen Sie den Filter aus der Durchstechflasche. Der Filter wird nicht mehr benötigt. Tygon-Schläuche an einer Spritze befestigen und die Chlorophyll-Extraktionsacetonmischung aus der Durchstechflasche entfernen.Ersetzen Sie den Tygon-Schlauch durch einen GF5-Filterhalter. Übertragen Sie die Lösung in eine Quarzküvette. Nach der Kalibrierung des Absorptionsspektrometers für Aceton legen Sie die Mitküvette enthaltende Probe in das Spektrometer und messen die Absorptionsmerkmale zwischen 400 und 750 Nanometern.Als nächstes entfernen Sie die Küvette aus dem Spektrometer und fügen Sie der Probe 200 Mikroliter zweimollaren Salzsäure hinzu. Wiederholen Sie dann die Absorptionsmessung, um den Phäophytingehalt in der Probe zu messen. Die Wirkung der Lasermessung auf die Aktivität bakterieller Gemeinschaften wird noch nicht im Detail beschrieben.Daher wurde der Effekt über die Primär- und Sekundärproduktion untersucht. Für die bakterielle Produktion, nehmen Sie fünf Aliquots unserer bakteriellen Matte. Für die Tritium-etikettierte Leucinaufnahme werden drei Aliquots und als Kontrollen zwei Aliquots verwendet.Inaktivieren Sie die Kontrollen mit Formaldehyd. Fügen Sie Tritium-markiertes Leucin zu allen Aliquots hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen Beispielen.Hier wird die benötigte Probenmenge für unser experimentelles Design angezeigt. Als nächstes, belichten Sie die bakterielle Matte mit dem grünen und blauen Laser, wie im Versuchsaufbau angegeben. Dann inaktivieren Sie alle Proben, die noch nicht mit Formaldehyd behandelt wurden.Die Probe in eine Kryovial geben und Trichloressigsäure oder TCA hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Durchstechflasche bei 10.000 g für fünf Minuten. Scintillationsflüssigkeit hinzufügen und das Kryovial in eine Poly-Szintillations-Durchstechflasche geben.Analysieren Sie die Proben mit einem flüssigen Szintillationszähler und berechnen Sie die Aufnahmeraten. Für die Photosynthese fünf Aliquots wie zuvor vorbereiten, von denen zwei verdunkelt sind. Fügen Sie den radioaktiven Tracer NaH14 CO3 hinzu und inkubieren Sie ihn vier Stunden lang.Beenden Sie nach der Inkubation die Reaktion, indem Sie die Proben in Aluminiumfolie einwickeln. Messen Sie Disintegrationen pro Minute durch Flüssigszintillation, wie zuvor beschrieben. Nach normalisierender Daten für eine Belichtungszeit von einer Sekunde und eine Probenspaltenhöhe von 15 Millimetern wurde die endgültige Kalibrierlinie mit einer Poisson-Regression berechnet.Die Korrelation zwischen Flächendichte und Photonenzahl hat einen linearen Charakter. Die Steigung der Kurve ist 81.04. Das bedeutet, dass eine Photonenanzahl von 8, 104 in einer Probe, die für eine Sekunde exponiert wurde, einer Flächendichte von 100 Nanogramm pro Zentimeter Quadrat des Phycoerythrins entspricht.Die Standardabweichung in höher konzentrierten Proben kann durch einen Selbstabsorptionsprozess innerhalb der Probe erklärt werden. Die Chlorophyll-A-Kalibrierkurve weist ähnliche Eigenschaften auf und hat einen linearen Charakter mit einer Neigung von 8,94. Sechs gefilterte Eis- und Schneeproben wurden mit dem LIFE-Instrument vor der Chlorophyllextraktion und anschließenden Absorptionsspektrummessungen für die Chlorophyllgehaltsanalyse gemessen.Die Proben werden nach ihrem Chlorophyllgehalt sortiert, der durch die Absorptionsspektrometrie erfasst wird. Die LIFE-Daten zeigen kleine Standardabweichungen, was darauf hindeutet, dass das Material auf dem Filter relativ gleichmäßig verteilt war. Das LIFE-Instrument unterschätzt den Chlorophyllgehalt der ersten drei Filter.Die letzten drei Filter, die einen niedrigeren Chlorophyllgehalt aufweisen, werden vom LIFE-Instrument überschätzt. Der Grund für die Datenunterschiede lässt sich durch die Dicke des Filterkuchens erklären. In dünnen Filterkuchen, in Orange dargestellt, werden niedrige Fluoreszenzsignale aufgrund geringer Flächendichten der Pigmente erfasst.Die Chlorophyll-A-Signale sind in diesem Rohbild rot dargestellt. Alle Graubereiche in diesem Rohbild zeigen an, dass der Filter selbst laserinduzierte Signale aufweist, nachdem er den 450 Nanometer Langpassfilter passiert hat. Die Software zählte dieses Signal irreführend als Chlorophyll-A-Fluoreszenz.Hohe Pigmentgehalte wurden unterschätzt, da der Laser keine Fluoreszenzreaktion in Chlorophyll-A-Molekülen in tieferen Schichten des Filterkuchens auslösen konnte. Das Laser-Expositionsexperiment zeigt keine signifikanten Auswirkungen auf die primäre und sekundäre Produktivität von Bakterienmatten. Weder die Belichtungszeit von fünf bis 60 Sekunden noch die Laserintensität von fünf bis 50 Milliwatt zeigten einen Einfluss auf die Produktivitätsergebnisse.Dies impliziert, dass die höheren Intensitäten und Belichtungszeiten, die erforderlich sind, um bessere Signale zu erzeugen, den Zellen nicht schaden würden. Vier Kryokoniten wurden vor Ort gemessen und mit chlorophyll-Standardlösung verglichen, die unter Laborbedingungen in Rot gemessen wurde. Die spektralen Fluoreszenzspitzen in Blau stimmten mit dem Chlorophyll-Standardspektrum überein und lieferten so das Konzept der In-situ-Messungen.LIFE-Messungen wurden an Böden, Bakterienmatten, Biofilmen und Kryokoniten durchgeführt. LIFE-Messungen von Kryokoniten mit einer dicken Sedimentschicht sind möglich, wenn die kryokonitbedeckte Oberfläche 12,5 Zentimeter quadratisch überschreitet. Diese Art von Kryokonit blockiert streunen Licht unter dem Eis.In dünnen Kryokonitschichten werden die Fluoreszenzsignale von Umgebungslicht umhüllt. Dementsprechend sind LIFE-Messungen von nackten Eisflächen nicht möglich, während alle anderen Probentypen mit dem LIFE-Instrument analysiert werden können. Temperaturänderungen führen zu einer verbesserten Verfügbarkeit von flüssigem Wasser, was zu einer höheren biologischen Aktivität auf Gletscheroberflächen führt.Infolgedessen kann die Pigmentkonzentration zunehmen. Es ist von entscheidender Bedeutung, diese Änderungen zu überwachen und mögliche und wahrscheinliche zukünftige Szenarien vorherzusagen.

laser-induced-fluorescence-emission-life-as-novel-non-invasive-tool

Research

Forschung

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Environment

Umwelt

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Laserinduzierte Fluoreszenzemission (L.I.F.E.) als neuartiges nichtinvasives Werkzeug zur In-Situ-Messung von Biomarkern in kryosphärischen Lebensräumen (Video) | JoVE Journal

Laserinduzierte Fluoreszenzemission (L.I.F.E.) als neuartiges nichtinvasives Werkzeug zur In-Situ-Messung von Biomarkern in kryosphärischen Lebensräumen

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