Eine integrierte Raman-Spektroskopie- und Massenspektrometrie-Plattform zur Untersuchung der Aufnahme von Einzelzellen-Medikamenten, des Stoffwechsels und der Effekte

Wir haben eine innovative Methode für die Metabolomik entwickelt. Wir kombinierten die Belfry-Spektralbildgebung lebender Zellen mit einer einzelzelligen Massenspektrometrie. Unsere Technik kann die metabolischen Veränderungen einzelner Zellen gegen Medikamente überwachen und vorhersagen.

Und das eröffnet eine Menge Anwendung für Grundlagenforschung und Industrie. Unsere Methode fügt den derzeitigen Techniken zur Drogenbewertung eine einzellige Auflösung hinzu, die zukünftige Bemühungen zur Entdeckung von Arzneimitteln erheblich unterstützen wird. Unsere Technik kann uns auch helfen, die Rolle der zellulären Heterogenität bei der Krebsresistenz zu verstehen.

Die einzellige Probenahme und Datenanalyse sind die anspruchsvollsten Aspekte in diesem Experiment. Wir arbeiten derzeit an der Automatisierung dieser beiden Schritte, insbesondere des Sampling-Teils. Wir empfehlen Ihnen, die einzellige Probenahme lange vor dem Experiment zu üben, da jedes Mikromanipulator-Setup etwas anders ist und Sie sich die Zeit nehmen sollten, sich mit den Steuerelementen vertraut zu machen.

Nach der Inkubation von Zellen, um 70% Konfluenz zu erreichen, Kulturzellen von Interesse in einem geeigneten Kulturmedium, fügen Sie Penicillin-Streptomycin, um Kontamination zu vermeiden. Nach messung der Zelldichte auf einem Hämozytometer, Subkulturzellen in eine 35-Millimeter-Glasbodengitterschale oder Quarz-Dias, mit dem gleichen Medium bei einer Sädichte von 0,7 mal 10 bis sechs. Dann bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden inkubieren.

Am nächsten Tag erreichen die Zellen eine Konfluenz von 50 bis 60%Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmten PBS-Puffer bei 37 Grad Celsius. Teilen Sie die Zellen in medikamentös behandelte und unbehandelte Untergruppen in 35-Millimeter-Kulturgerichten auf. Mischen Sie In Dimethylsulfoxid gelöstes Tamoxifen mit den Kulturmedien, um ein Endvolumen von zwei Millilitern und eine Tamoxifenkonzentration von 10 Mikromolar zu erhalten.

Dies ist die medikamentöse Gruppe. Mischen Sie ein entsprechendes Volumen von DMSO in das Medium als Kontrollgruppe, um die Auswirkungen von DMSO zu untersuchen. Inkubieren Sie beide Gruppen in zwei Milliliter der Spike-Medien für 24 Stunden, um eine Konfluenz von 70 bis 80% vor spektralen Messungen zu erreichen, überprüfen Sie die Loch- und Laserposition übereinstimmung mit einem Ziel.

Um das Spektralphotometer vor jedem Experiment zu kalibrieren, legen Sie Ethanol in eine Glasbodenschale, messen Sie das Spektrum bei einer bestimmten Laserintensität für eine Sekunde und ordnen Sie den Peak bekannten Wellenlängen zu. Dann stellen Sie die Mikrokammer bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius auf. Sobald das Mikroskopsystem fertig ist, entfernen Sie Zellen aus dem Inkubator und spülen Sie Zellen sofort zweimal mit erwärmtem PBS-Puffer bei 37 Grad Celsius ab.

Dann fügen Sie zwei Milliliter erwärmten PBS oder FluoroBrite DMEM. Fügen Sie 10 Mikroliter Wasser auf die Wassertauchobjektivlinse. Und die Glasbodenzellenschale zart auf die Mikroskopbühne legen.

Fixieren Sie das Zellentnahmesystem auf dem Raman-Mikroskop. Schließen Sie den 3D-Mikromanipulator an den Glaskapillarhalter an, der zum Probensaugen an einer leeren Spritze befestigt ist. Stellen Sie das Mikroskop auf ein hoch großes Vergrößerungsfeld von 40 Mal, um die Spitze der Glaskapillare zu beobachten, und stellen Sie sicher, dass es nicht gebrochen ist.

Steuern Sie die Position der Glaskapillare mit dem Mikromanipulator. Stellen Sie sicher, dass die Kapillarspitze im Sichtfeld zentriert ist. Dann bewegen Sie die Kapillare auf der Z-Achse nach oben, um später Für die Kulturschale Freiraum zu geben.

Legen Sie die Probenschale auf die Bühne des Mikroskops, passen Sie die Vergrößerung und den Fokus an, wählen Sie die Zielzelle auf der Gitterschale aus und verschieben Sie sie in die Mitte der Ansicht. Messen Sie jede Zelle, indem Sie die Laserlinie fokussieren. Eine Belichtungszeit von 15 Sekunden pro Zelle reicht aus, um einen Querschnitt einer Zelle mit einem klaren Raman-Signal zu erhalten.

Ein Galvanospiegel ermöglicht das Scannen einer Zelle oder einer Gruppe von Zellen innerhalb von mehreren Dutzend Minuten. Dann die Glaskapillare vorsichtig mit Mikromanipulator nach unten senken, bis die Spitze in den Fokus rückt. Berühren Sie unter mikroskopischer Beobachtung die Ziel-Einzelzelle mit der Kapillarspitze.

Dann beginnen Sie mit der Spritze unter Druck, um die Zelle in der Kapillarspitze einzufangen. Zeichnen Sie dieses Verfahren auf, indem Sie ein Video aufnehmen, um das Timing und die gesaugte Position der Zelle genau zu überprüfen. Bewegen Sie die Kapillare auf der Z-Achse nach oben.

Lösen Sie dann die Kapillare mit Zangen aus dem Kapillarhalter, um die Massenspektrometrieanalyse vorzubereiten. Nach dem Einrichten des Massenspektrometrie-Instruments und der Analyse der Medien zwei Mikroliter des Ionisationslösungsmittels in die Kapillare, die die Zelle enthält. Befestigen Sie die Kapillare an einem Nano-Elektrospray-Adapter, der mit einem geeigneten Massenspektrometer verbunden ist, und starten Sie die automatische Erfassungsmethode.

Eine vergleichende Analyse des durchschnittlichen Spektrums jeder Erkrankung mit und ohne medikamentöse Behandlung wird hier gezeigt. Das durchschnittliche Spektrum der beiden Bedingungen unterscheidet sich an verschiedenen Spitzen deutlich. Insbesondere die Spitzen von 1.000 Per Zentimeter, was ein Zeichen für aromatische Verbindungen wie Phenylalanin und Tyrosin ist, zeigen starke Unterschiede.

Basierend auf der Projektion auf latenten Strukturmodell wurden die VIP-Scores berechnet, die die Bedeutung von Wellenlängen bei der Unterscheidung der experimentellen Bedingungen darstellen. Wichtig ist, dass die höchsten Gipfel der VIP-Profile Raman-Spitzen entsprachen, für die starke Unterschiede zwischen den beiden Behandlungen zu beobachten waren. Dies bestätigte die spezifischen molekularen Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Zellen.

Nach positiver Identifizierung wurde die relative Häufigkeit des Arzneimittels und seiner Metaboliten in jeder Zelle gemessen und mit Hintergrundspitzen in unbehandelten Zellen verglichen. Starke Variation wurde in Tamoxifen Fülle beobachtet. Und dieses Phänomen war bei seinem Metaboliten 4-Hydroxy-Tamoxifen noch ausgeprägter.

Forscher können daran interessiert sein, den Zusammenhang zwischen Spektralbildern und den metabolischen Profilen von Zellen zu erforschen. Unsere Forschung hat auch industrielle Anwendungen, weil sie ein lokales Screening von Zellen für die pharmazeutische Fertigung ermöglicht. Bei der Vorbereitung des Ionisationslösungsmittels für die Massenspektrometermessungen ist Vorsicht geboten.

Es sollte unter einer Dunstabzugshaube zubereitet werden. Achten Sie auch darauf, die Ionenquelle des Massenspektrometer-Instruments nicht zu berühren, um zu vermeiden, dass sie elektrocuted wird. Schließlich sind die während der Messung verwendeten Probenahmekapillaren sehr scharf, also behandeln Sie sie mit Sorgfalt, um Verletzungen zu vermeiden.