Genetische Modifikation von Cyanobakterien durch Konjugation mit dem CyanoGate Modular Cloning Toolkit
October 31st, 2019
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie i) einen sich selbst replizierenden Vektor mithilfe des modularen Klon-Toolkits CyanoGate zusammenstellen kann, ii) den Vektor durch Konjugation in einen cyanobakteriellen Wirt einführt und iii) transgene Cyanobakterienstämme mit einem Plattenleser oder Durchflusszytometrie.
Cyanobakterien sind ein wichtiges Phylum von photosynthetischen Mikroben, die zunehmend als nützliche Plattformen für synthetische Biologie und erneuerbare Biotechnologie-Anwendungen anerkannt werden. Daher ist es wichtig, robuste Techniken zu entwickeln, um das Design, das Klonen und die Einführung heterologer DNA in verschiedene cyanobakterielle Arten zu vereinfachen. Diese Technik zeigt also eine etablierte Methode namens Konjugation oder triparentale Paarung zur Einführung von DNA in cyanobakterielle Arten, die nicht natürlich transformierbar sind.
Die Konjugation wurde erfolgreich in einer Vielzahl von cyanobakteriellen Stämmen von Einzelzell- bis zu mehrzelligen fadenförmigen Arten durchgeführt. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal versuchen, achten Sie bitte darauf, sowohl Ihre Cyanobakterien als auch Ihre E.coli-Stämme mit Vorsicht zu behandeln. Zentrifugieren Sie z. B. nicht über den im Protokoll angegebenen Werten und wirbeln Sie nicht.
Mischen von Bakterien und Cyanobakterien kann seltsam für Erstanwender erscheinen. Wir hoffen, dass wir durch die Demonstration des Konjugationsprozesses dazu beitragen werden, dies zu klären. Wählen Sie nach dem Bau der Baugruppen der Ebene 1 einen geeigneten Pegel-T-Akzeptorvektor aus.
Wählen Sie einen geeigneten Endlink aus, um das drei Primende der endgültigen Ebene 1-Baugruppe auf das Level-T-Backbone zu ligte. Um eine oder mehrere Baugruppen der Ebene 1 in Ebene T zusammenzustellen, bereiten Sie einen Reaktionsmix mit PBI1 und dem erforderlichen Endlinkvektor vor. Richten Sie das Thermocycler-Programm ein und fahren Sie entsprechend dem Manuskript fort.
Wachsen Sie am ersten Tag die cyanobakterielle Kultur, indem Sie eine neue Kultur von Synechocystis PCC 6803 oder Synechococcus elongatus UTEX 2973 aufbauen. Mit einer hitzesterilen Schleife die Zellen von der axtischen BG-11 Agarplatte kratzen und in einen 100 Milliliter Konuskolben geben, gefüllt mit 50 Millilitern frischem BG-11-Medium bis zur Unheil. Legen Sie den Kolben in einen schüttelnden Inkubator mit Beleuchtung, um die Synechocystis PCC 6803 Zellkulturen bei 30 Grad Celsius bei 100 U/min zu züchten.
Für Synechococcus elongatus UTEX 2973, wachsen die Zellkulturen bei 40 Grad Celsius bei 100 RPM. Zeichnen Sie nach ein bis zwei Tagen einen Milliliter der Zellkultur und messen Sie auf einem Spektralphotometer. Die Absorption bei OD 750 erreicht 0,5 bis 1,5.
Am zweiten Tag impfen Sie einen MC1061 E.coli-Helferstamm, der die Vektoren PRK24 und PRL528 in fünf Millilitern LB-Medium mit Ampicillin in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter und Chloramphenicol in einer Konzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter enthält. Wachsen Sie bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 225 RPM in einem Schüttel-Inkubator. Dann impfen Sie fünf Milliliter LB-Medium mit geeigneten Antibiotika mit der E.coli-Kultur, die den Frachtvektor der Ebene T trägt.
Wachsen Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 225 RPM in einem zitternden Brutkasten. Zentrifugieren Sie am dritten Tag den Helfer und die Ladung E.coli über Nacht bei 3.000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
Waschen Sie die Pellets, indem Sie fünf Milliliter frisches LB-Medium ohne Antibiotika hinzufügen. Setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie sanft nach oben und unten und Zentrifugen pfeifen, um den Überstand zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal, um Restantibiotika aus der Nachtkultur zu entfernen.
Nach der letzten Wäsche das Zellpellet in der Hälfte des Volumens des LB-Mediums des ursprünglichen Kulturvolumens wieder aufhängen. Dann 450 Mikroliter der Helfersorte mit 450 Mikrolitern der Ladungsdehnung in einem Zwei-Milliliter-Rohr kombinieren und bei Raumtemperatur verlassen. Als nächstes bereiten Sie die cyanobakterielle Kultur vor, indem Sie einen Milliliter cyanobakterielle Kultur bei 1, 500 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrieren.
Dann entsorgen Sie den Überstand sorgfältig, ohne das Zellpellet zu stören. Waschen Sie das Pellet viermal, indem Sie frisches BG-11 Medium des gleichen Anfangsvolumens hinzufügen. Fügen Sie 900 Mikroliter der gewaschenen cyanobakteriellen Kultur zu 900 Mikroliterdern der kombinierten E.coli-Stämme in einer Zwei-Milliliter-Röhre hinzu.
Mischen Sie die Kulturen, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten für Synechocystis PCC 6803 oder zwei Stunden für Synechococcus elongatus UTEX 2973. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 1, 500 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
1,6 Milliliter des Überstandes entfernen und das Pellet im restlichen Überstand wieder aufhängen. Legen Sie einen 0,45 Mikron Membranfilter ohne Antibiotika auf eine LB BG-11 Agarplatte. 200 Mikroliter der E.coli/Cyanobakterienkultur auf der Membran vorsichtig mit einem sterilen Streuer oder einer sterilen gebogenen Spitze verteilen.
Versiegeln Sie die Platte mit Paraffinfolie und legen Sie die Platte 24 Stunden lang in einen beleuchteten Inkubator. Übertragen Sie die Membran nach 24 Stunden sorgfältig mit Flammensterilisationszangen auf eine frische BG-11-Agarplatte, die geeignete Antibiotika enthält, um sie für den Ladungsvektor auszuwählen. Versiegeln Sie die Platte mit Paraffinfolie und brüten Sie unter den gleichen Bedingungen wie bisher, bis Kolonien auftreten.
Kolonien erscheinen in der Regel nach 7-14 Tagen für Synechocystis PCC 6803 und 3-7 Tage für Synechococcus elongatus UTEX 2973. Um Konjuganten auszuwählen, wählen Sie mit einem hitzesterilen Impfstab mindestens zwei einzelne Kolonien aus der Membran aus und streifen auf eine neue BG-11-Agarplatte mit geeigneten Antibiotika. Dann impfen Sie einen Streifen cyanobakterieller Kultur in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr mit fünf Millilitern LB-Medium und brüten bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 225 U/min in einem Schüttelinkubator.
Die klare Kultur bestätigt das Fehlen einer E.coli-Kontamination. Wählen Sie nach einer ausreichenden Wachstumsphase von sieben Tagen einzelne axtische Kolonien aus, um flüssige Kulturen für die langfristige Kryolagerung oder nachfolgende Experimente einzurichten. In dieser Studie wurde der Workflow für die Golden Gate-Montage demonstriert.
Nach der Transformation der Montagereaktion wurden erfolgreiche Baugruppen mit dem Standard-Blauweiß-Screening von E.coli-Kolonien identifiziert. Die eYFP-Expressionskassette im Vektor der Ebene 1 und der Endlink-Eins-Vektor wurden dann zu einem Akzeptorvektor der Ebene T zusammengesetzt, um dem Vektor cpcBA-eYFP zu geben. Der montierte cpcBA-eYFP-Vektor wurde durch Restriktionsverdauung verifiziert.
Die erfolgreiche eheliche Übertragung von cpcBA-eYFP oder dem pPMQAK1-T-Vektor führte zu einem Wachstum von bis zu mehreren hundert Kolonien auf der Membran für Synechocystis PCC 6803 und Synechococcus elongatus UTEX 2973. Wie für den starken Pcpc560-Promotor erwartet, waren die Werte für normalisierte eYFP-Fluoreszenz vom Plattenleser und die eYFP-Fluoreszenz pro Zelle aus dem Durchflusszytometer im Vergleich zur Negativkontrolle hoch. Sowohl beim Plattenleser als auch beim Durchflusszytometer waren die Fluoreszenzwerte in Synechococcus elongatus UTEX 2973 höher als bei Synechocystis PCC 6803.
Stellen Sie sicher, dass Sie für die minimale Zeit inkubieren, je nachdem, welche Sorte Sie konjugieren.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Zusammenstellung eines selbstreplizierenden Vektors unter Verwendung des CyanoGate-Modular-Klonierungs-Toolkits und dessen Einführung in zyanobakterielle Wirte durch Konjugation. Sie betont die Bedeutung dieser Techniken zur Vereinfachung des Designs und des Klonens von heterologer DNA in Cyanobakterien, die für Anwendungen in der synthetischen Biologie wertvoll sind.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Synthetische Biologie
- Biotechnologie
- Gentechnik von Cyanobakterien
Hintergrund
- Cyanobakterien sind bedeutende photosynthetische Mikroben, die in der erneuerbaren Biotechnologie verwendet werden.
- Konjugation ist eine Methode zur Einführung von DNA in Cyanobakterien, die nicht natürlich transformierbar sind.
- Robuste Techniken sind für das DNA-Klonen in verschiedenen zyanobakteriellen Arten notwendig.
Verwendete Methoden
- Zusammenstellung von selbstreplizierenden Vektoren unter Verwendung des CyanoGate-Toolkits.
- Konjugation zur Einführung von DNA in Cyanobakterien.
- Charakterisierung mittels Plattenlesern und Durchflusszytometrie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Konstruktion und Verifizierung des cpcBA-eYFP-Vektors.
- Erfolgreiche Konjugation in Synechocystis PCC 6803 und Synechococcus elongatus UTEX 2973 demonstriert.
- Etablieren von Techniken zur Selektion transgener Cyanobakterien.
Schlussfolgerungen
- Die Studie veranschaulicht eine zuverlässige Methode für die genetische Manipulation von Cyanobakterien.
- Sie hebt Fortschritte bei Werkzeugen für synthetische Biologie und erneuerbare Anwendungen hervor.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Standardized modular cloning and conjugation workflows, such as those enabled by the CyanoGate toolkit, are pivotal for accelerating genetic engineering in cyanobacteria. These capabilities streamline the construction and transfer of expression vectors, supporting rapid hypothesis testing and functional validation in renewable biotechnology pipelines. The approach enhances predictive confidence and scalability for early-stage discovery and platform strain development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates rapid assembly and testing of genetic constructs for pathway interrogation.
- Enables functional validation of promoters and genetic parts in relevant cyanobacterial hosts.
- Supports biological de-risking by allowing direct measurement of expression outputs.
- Improves predictive confidence for target selection in photosynthetic microbial platforms.
Screening & Assay Development
- Prepares genetically defined cyanobacterial strains for downstream screening workflows.
- Standardizes vector assembly and transfer, ensuring reproducibility across experiments.
- Enables quantitative readouts via fluorescence markers using plate readers and flow cytometry.
- Supports scalable and reusable assay platforms for synthetic biology applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered cyanobacterial systems with industrial strain development pipelines.
- Provides continuity from genetic part validation to preclinical strain optimization.
- Reduces risk in advancing engineered strains toward bioproduction applications.
- Enables benchmarking of genetic constructs across multiple cyanobacterial species.
Pipeline & Workflow Integration
The CyanoGate modular cloning and conjugation workflow integrates at the interface of early discovery and strain engineering, enabling seamless progression from construct design to functional validation in cyanobacteria.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of genetic elements and regulatory sequences.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs for comparative analysis.
- Analytics: Employs plate reader and flow cytometry data to benchmark construct performance.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical strain development for renewable bioproduction.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, modular workflow adaptable to diverse cyanobacterial hosts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in genetic part function.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of engineering workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and efficient resource allocation in platform development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of engineered strains for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cyanobacterial cultivation, and conjugation techniques.
- Needs access to thermal cyclers, spectrophotometers, plate readers, and flow cytometers.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible vector assembly and transfer.
- Adaptation may be necessary for different cyanobacterial species or genetic backgrounds.
- Careful handling is essential to prevent contamination and ensure successful conjugation.
