Genetische Modifikation von Cyanobakterien durch Konjugation mit dem CyanoGate Modular Cloning Toolkit
31. Oktober 2019
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie i) einen sich selbst replizierenden Vektor mithilfe des modularen Klon-Toolkits CyanoGate zusammenstellen kann, ii) den Vektor durch Konjugation in einen cyanobakteriellen Wirt einführt und iii) transgene Cyanobakterienstämme mit einem Plattenleser oder Durchflusszytometrie.
Cyanobakterien sind ein wichtiges Phylum von photosynthetischen Mikroben, die zunehmend als nützliche Plattformen für synthetische Biologie und erneuerbare Biotechnologie-Anwendungen anerkannt werden. Daher ist es wichtig, robuste Techniken zu entwickeln, um das Design, das Klonen und die Einführung heterologer DNA in verschiedene cyanobakterielle Arten zu vereinfachen. Diese Technik zeigt also eine etablierte Methode namens Konjugation oder triparentale Paarung zur Einführung von DNA in cyanobakterielle Arten, die nicht natürlich transformierbar sind.
Die Konjugation wurde erfolgreich in einer Vielzahl von cyanobakteriellen Stämmen von Einzelzell- bis zu mehrzelligen fadenförmigen Arten durchgeführt. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal versuchen, achten Sie bitte darauf, sowohl Ihre Cyanobakterien als auch Ihre E.coli-Stämme mit Vorsicht zu behandeln. Zentrifugieren Sie z. B. nicht über den im Protokoll angegebenen Werten und wirbeln Sie nicht.
Mischen von Bakterien und Cyanobakterien kann seltsam für Erstanwender erscheinen. Wir hoffen, dass wir durch die Demonstration des Konjugationsprozesses dazu beitragen werden, dies zu klären. Wählen Sie nach dem Bau der Baugruppen der Ebene 1 einen geeigneten Pegel-T-Akzeptorvektor aus.
Wählen Sie einen geeigneten Endlink aus, um das drei Primende der endgültigen Ebene 1-Baugruppe auf das Level-T-Backbone zu ligte. Um eine oder mehrere Baugruppen der Ebene 1 in Ebene T zusammenzustellen, bereiten Sie einen Reaktionsmix mit PBI1 und dem erforderlichen Endlinkvektor vor. Richten Sie das Thermocycler-Programm ein und fahren Sie entsprechend dem Manuskript fort.
Wachsen Sie am ersten Tag die cyanobakterielle Kultur, indem Sie eine neue Kultur von Synechocystis PCC 6803 oder Synechococcus elongatus UTEX 2973 aufbauen. Mit einer hitzesterilen Schleife die Zellen von der axtischen BG-11 Agarplatte kratzen und in einen 100 Milliliter Konuskolben geben, gefüllt mit 50 Millilitern frischem BG-11-Medium bis zur Unheil. Legen Sie den Kolben in einen schüttelnden Inkubator mit Beleuchtung, um die Synechocystis PCC 6803 Zellkulturen bei 30 Grad Celsius bei 100 U/min zu züchten.
Für Synechococcus elongatus UTEX 2973, wachsen die Zellkulturen bei 40 Grad Celsius bei 100 RPM. Zeichnen Sie nach ein bis zwei Tagen einen Milliliter der Zellkultur und messen Sie auf einem Spektralphotometer. Die Absorption bei OD 750 erreicht 0,5 bis 1,5.
Am zweiten Tag impfen Sie einen MC1061 E.coli-Helferstamm, der die Vektoren PRK24 und PRL528 in fünf Millilitern LB-Medium mit Ampicillin in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter und Chloramphenicol in einer Konzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter enthält. Wachsen Sie bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 225 RPM in einem Schüttel-Inkubator. Dann impfen Sie fünf Milliliter LB-Medium mit geeigneten Antibiotika mit der E.coli-Kultur, die den Frachtvektor der Ebene T trägt.
Wachsen Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 225 RPM in einem zitternden Brutkasten. Zentrifugieren Sie am dritten Tag den Helfer und die Ladung E.coli über Nacht bei 3.000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.
Waschen Sie die Pellets, indem Sie fünf Milliliter frisches LB-Medium ohne Antibiotika hinzufügen. Setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie sanft nach oben und unten und Zentrifugen pfeifen, um den Überstand zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal, um Restantibiotika aus der Nachtkultur zu entfernen.
Nach der letzten Wäsche das Zellpellet in der Hälfte des Volumens des LB-Mediums des ursprünglichen Kulturvolumens wieder aufhängen. Dann 450 Mikroliter der Helfersorte mit 450 Mikrolitern der Ladungsdehnung in einem Zwei-Milliliter-Rohr kombinieren und bei Raumtemperatur verlassen. Als nächstes bereiten Sie die cyanobakterielle Kultur vor, indem Sie einen Milliliter cyanobakterielle Kultur bei 1, 500 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrieren.
Dann entsorgen Sie den Überstand sorgfältig, ohne das Zellpellet zu stören. Waschen Sie das Pellet viermal, indem Sie frisches BG-11 Medium des gleichen Anfangsvolumens hinzufügen. Fügen Sie 900 Mikroliter der gewaschenen cyanobakteriellen Kultur zu 900 Mikroliterdern der kombinierten E.coli-Stämme in einer Zwei-Milliliter-Röhre hinzu.
Mischen Sie die Kulturen, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten für Synechocystis PCC 6803 oder zwei Stunden für Synechococcus elongatus UTEX 2973. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 1, 500 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
1,6 Milliliter des Überstandes entfernen und das Pellet im restlichen Überstand wieder aufhängen. Legen Sie einen 0,45 Mikron Membranfilter ohne Antibiotika auf eine LB BG-11 Agarplatte. 200 Mikroliter der E.coli/Cyanobakterienkultur auf der Membran vorsichtig mit einem sterilen Streuer oder einer sterilen gebogenen Spitze verteilen.
Versiegeln Sie die Platte mit Paraffinfolie und legen Sie die Platte 24 Stunden lang in einen beleuchteten Inkubator. Übertragen Sie die Membran nach 24 Stunden sorgfältig mit Flammensterilisationszangen auf eine frische BG-11-Agarplatte, die geeignete Antibiotika enthält, um sie für den Ladungsvektor auszuwählen. Versiegeln Sie die Platte mit Paraffinfolie und brüten Sie unter den gleichen Bedingungen wie bisher, bis Kolonien auftreten.
Kolonien erscheinen in der Regel nach 7-14 Tagen für Synechocystis PCC 6803 und 3-7 Tage für Synechococcus elongatus UTEX 2973. Um Konjuganten auszuwählen, wählen Sie mit einem hitzesterilen Impfstab mindestens zwei einzelne Kolonien aus der Membran aus und streifen auf eine neue BG-11-Agarplatte mit geeigneten Antibiotika. Dann impfen Sie einen Streifen cyanobakterieller Kultur in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr mit fünf Millilitern LB-Medium und brüten bei 37 Grad Celsius über Nacht bei 225 U/min in einem Schüttelinkubator.
Die klare Kultur bestätigt das Fehlen einer E.coli-Kontamination. Wählen Sie nach einer ausreichenden Wachstumsphase von sieben Tagen einzelne axtische Kolonien aus, um flüssige Kulturen für die langfristige Kryolagerung oder nachfolgende Experimente einzurichten. In dieser Studie wurde der Workflow für die Golden Gate-Montage demonstriert.
Nach der Transformation der Montagereaktion wurden erfolgreiche Baugruppen mit dem Standard-Blauweiß-Screening von E.coli-Kolonien identifiziert. Die eYFP-Expressionskassette im Vektor der Ebene 1 und der Endlink-Eins-Vektor wurden dann zu einem Akzeptorvektor der Ebene T zusammengesetzt, um dem Vektor cpcBA-eYFP zu geben. Der montierte cpcBA-eYFP-Vektor wurde durch Restriktionsverdauung verifiziert.
Die erfolgreiche eheliche Übertragung von cpcBA-eYFP oder dem pPMQAK1-T-Vektor führte zu einem Wachstum von bis zu mehreren hundert Kolonien auf der Membran für Synechocystis PCC 6803 und Synechococcus elongatus UTEX 2973. Wie für den starken Pcpc560-Promotor erwartet, waren die Werte für normalisierte eYFP-Fluoreszenz vom Plattenleser und die eYFP-Fluoreszenz pro Zelle aus dem Durchflusszytometer im Vergleich zur Negativkontrolle hoch. Sowohl beim Plattenleser als auch beim Durchflusszytometer waren die Fluoreszenzwerte in Synechococcus elongatus UTEX 2973 höher als bei Synechocystis PCC 6803.
Stellen Sie sicher, dass Sie für die minimale Zeit inkubieren, je nachdem, welche Sorte Sie konjugieren.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Zusammenstellung eines selbstreplizierenden Vektors unter Verwendung des CyanoGate-Modularcloning-Toolkits und dessen Einführung in cyanobakterielle Wirtszellen mittels Konjugation vor. Dabei wird die Bedeutung dieser Methoden hervorgehoben, um die Konstruktion und das Klonen von heterologer DNA in Cyanobakterien zu vereinfachen, die aufgrund ihrer Eigenschaften für Anwendungen in der Synthetischen Biologie von großem Wert sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Synthetische Biologie
- Biotechnologie
- Genetische Ingenieurtechnik bei Cyanobakterien
Hintergrund
- Cyanobakterien sind bedeutende photosynthetische Mikroben, die in der erneuerbaren Biotechnologie eingesetzt werden.
- Konjugation ist eine Methode, um DNA in Cyanobakterien einzubringen, die nicht natürlicherweise transformierbar sind.
- Es sind robuste Techniken erforderlich, um DNA-Klonierung in verschiedenen Cyanobakterienarten durchzuführen.
Verwendete Methoden
- Assembly von selbstreplizierenden Vektoren unter Verwendung des CyanoGate-Toolkits.
- Konjugation zur Einführung von DNA in Cyanobakterien.
- Charakterisierung mittels Plattenlesegeräten und Durchflusszytometrie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreicher Aufbau und Verifizierung des cpcBA-eYFP-Vektors.
- Nachweis einer erfolgreichen Konjugation in Synechocystis PCC 6803 und Synechococcus elongatus UTEX 2973.
- Entwicklung von Techniken zur Selektion transgener Cyanobakterien.
Schlussfolgerungen
- Die Studie veranschaulicht eine zuverlässige Methode zur genetischen Manipulation von Cyanobakterien.
- Sie unterstreicht Fortschritte bei Werkzeugen für die synthetische Biologie und erneuerbare Anwendungen.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Standardisierte modulare Klonierungs- und Konjugationsabläufe, wie sie durch das CyanoGate-Toolkit ermöglicht werden, sind entscheidend, um die genetische Ingenieurtechnik bei Cyanobakterien zu beschleunigen. Diese Fähigkeiten vereinfachen den Aufbau und die Übertragung von Expressionsvektoren und unterstützen so die schnelle Überprüfung von Hypothesen sowie die funktionelle Validierung in nachwachsenden biotechnologischen Prozessen. Die Methode erhöht die Vorhersagbarkeit und Skalierbarkeit für die frühe Entdeckung neuer Funktionen und die Entwicklung von Plattformstämmen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Erleichtert den schnellen Aufbau und die Testung genetischer Konstrukte zur Untersuchung von Stoffwechselwegen.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Promotoren und genetischen Bauteilen in relevanten cyanobakteriellen Wirtssystemen.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte Messung von Expressionsausgaben.
- Verbessert die Vorhersagegenauigkeit bei der Auswahl von Zielstrukturen in photosynthetischen mikrobiellen Plattformen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet genetisch definierte Cyanobakterienstämme für nachgeschaltete Screening-Workflows vor.
- Standardisiert die Vektorzusammenstellung und -übertragung, um die Reproduzierbarkeit zwischen Experimenten sicherzustellen.
- Ermöglicht quantitative Auswertungen mittels fluoreszierender Marker unter Verwendung von Plattenlesegeräten und Durchflusszytometrie.
- Unterstützt skalierbare und wiederverwendbare Assay-Plattformen für Anwendungen in der synthetischen Biologie.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft konstruierte Cyanobakterien-Systeme mit industriellen Stamm-Entwicklungs-Pipelines.
- Gewährleistet Kontinuität von der Validierung genetischer Elemente bis hin zur Optimierung von Präklinischen Stämmen.
- Verringert das Risiko beim Übergang konstruierter Stämme zu biotechnologischen Produktionsanwendungen.
- Ermöglicht den Vergleich genetischer Konstrukte über mehrere Cyanobakterienarten hinweg.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die CyanoGate-Modularklonierungs- und Konjugationsabfolge integriert sich an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckung und Stamm-Engineering und ermöglicht einen nahtlosen Übergang vom Konstrukt-Design zur funktionalen Validierung in Cyanobakterien.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Unterstützt hypothesengetriebene Tests genetischer Elemente und regulatorischer Sequenzen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Fluoreszenzsignale für den vergleichenden Analysen.
- Analytik: Verwendet Daten aus Mikroplattenlesegeräten und Durchflusszytometrie, um die Leistung von Konstrukten zu bewerten.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Stammentwicklung für erneuerbare Bioproduktion.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten, modularen Arbeitsablauf, der an verschiedene cyanobakterielle Wirtssysteme angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert die Mehrdeutigkeit bezüglich der Funktion genetischer Elemente.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit, Standardisierung und Skalierbarkeit von Engineering-Arbeitsabläufen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und eine effiziente Ressourcenallokation bei der Plattformentwicklung.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von konstruierten Stämmen für die weitere Entwicklung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in molekularer Klonierung, Cyanobakterien-Kultivierung und Konjugationstechniken.
- Benötigt Zugang zu Thermocyclern, Spektrophotometern, Mikroplatten-Readern und Durchflusszytometern.
- Erfordert eine strenge, übergreifende Standardisierung zwischen den Arbeitsgruppen für reproduzierbare Vektorzusammenstellung und -übertragung.
- Kann je nach Cyanobakterienart oder genetischem Hintergrund Anpassungen erfordern.
- Sorgfältiges Vorgehen ist unerlässlich, um Kontaminationen zu vermeiden und eine erfolgreiche Konjugation sicherzustellen.
