Ein Tuberkulose-Molekularer bakterieller Belastungstest (TB-MBLA)
30. April 2020
Wir beschreiben einen Tuberkulose-Molekular-Bakterien-Belastungstest, der nach der Hitzeinaktivierung von Sputum durchgeführt wurde. Die Wärmeinaktivierung macht Sputumproben nicht infektiös und macht die Notwendigkeit von Laboratorien der Eindämmungsstufe 3 für Tuberkulosemolekulartests überflüssig.
Dieser Tuberkulose-Molekularbakterielle Assay beantwortet drei Schlüsselfragen. Eins: Wie hoch ist die Krankheitslast des Patienten? Zweitens: Wie reagiert die Patientenkrankheit auf das Antituberkulose-Medikament?
Und drittens: Was ist der Zusammenhang zwischen Krankheitslast und Behandlungsreaktion? Dieser Test führt zu einem quantitativen Ergebnis der Tuberkulosebelastung des Patienten und misst, wie sich diese Belastung mit der Behandlung in kurzer Zeit ändert. Mit Modifikation kann diese Methode auf andere bakterielle Krankheitserreger angewendet werden.
Wir haben bereits eine ähnliche Technologie für die Diagnose von nichttuberkulären Mykobakterien und Bakterien entwickelt, die mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung assoziiert sind. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausführen, sehen Sie sich das Video an und üben Sie die Schritte. Es ist sehr wichtig, mit Proben zu üben, die nicht für die Patientendiagnose ergebnisse benötigt werden.
Visuelle Demonstration ist wichtig, da sie das Erlernen und Mastering von Schritten vereinfacht, insbesondere die Teile der Methode, die im Text schwer zu erklären sind. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Zellkulturen. Auf einer sauberen Laborbank oder Klasse eins Kabine, ernten Sie einen Milliliter Aliquots der exponentiellen Phase Bacille Calmette-Guerin oder BCG Kultur in 15 Milliliter Kunststoffrohre und dicht schließen.
Bei der Vorbereitung der Sputumproben des Patienten arbeiten Sie in einem gut belüfteten Raum und befolgen Sie die Richtlinien im GL One Stop TB Handbuch. Öffnen Sie den Probenbecher und die Pipette vorsichtig einen Milliliter aliquots in 15 Milliliter Kunststoffzentrifugenrohre. Schließen Sie dann die Rohre fest.
Übertragen Sie die Probenrohre in ein Inseististen, das in ein Wasserbad eingetaucht ist, das auf 95 Grad Celsius vorgewärmt ist, und stellen Sie sicher, dass 3/4 jedes Rohres eingetaucht ist. Kochen Sie die Proben für 20 Minuten. Dann übertragen Sie die Rohre auf die Bank, um bei Raumtemperatur für fünf Minuten abzukühlen.
Führen Sie die RNA-Extraktion in einer Dunstabzugshaube durch, wenn Sie ein Kit mit Phenolchloroform oder Tumor-Groß-Ethanol verwenden. Das hier dargestellte RNA-Verfahren ist das Phenolchlorformextraktionsverfahren. Es können jedoch auch alternative Methoden zur RNA-Extraktion verwendet werden.
Übertragen Sie einen Milliliter Aliquots der inaktivierten Wärmeprobe in 1,5 Milliliter-Rohre und spike 100 Mikroliter Extraktionskontrolle in jede Probe. Schließen Sie die Rohre und mischen Sie sie, indem Sie sie dreimal umkehren. Zentrifugieren Sie die Rohre 10 Minuten lang mit 20.000 mal g.
Dann, aspirieren Sie den Überstand, so dass 50 Mikroliter Sediment. Wir suspendieren das Sediment in 950 MikroliterLysepuffer durch Pipettieren und übertragen die gesamte Suspension in die mit dem RNA-Extraktionskit gelieferten Lysing-Matrixröhren. Schließen Sie die Rohre fest und stellen Sie sicher, dass sie sowohl am Deckel als auch an der Seite beschriftet sind.
Dann homogenisieren Sie die Proben für 40 Sekunden bei 6.000 Rpm. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit frische Ein-Milliliter-Rohre zubereiten und 300 Mikroliter Chloroform hinzufügen.
Verwenden Sie eine 1 Milliliter Pipette, um den Überstand sorgfältig zu saugen, ohne die Lysing-Matrix zu berühren und mit dem Chloroform in das Rohr zu übertragen. Wirbeln Sie die Rohre für fünf Sekunden und lassen Sie sie für fünf Minuten oder bis drei Phasen deutlich sichtbar sind. Zentrifugieren Sie die Rohre fünf Minuten lang bei 12.000 mal g.
Dann die obere Phase vorsichtig pipette und in ein 1,5-Milliliter-Rohr übertragen. 500 Mikroliter eiskaltes 100%Ethanol in die Probe geben, das Rohr schließen und dreimal umkehren, um es zu mischen. Die Röhren bei minus 80 Grad Celsius für 15 Minuten oder bei minus 20 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren.
Dann die Rohre 20 Minuten lang bei 13.000 mal g und vier Grad Celsius in eine vorgekühlte Mikrozentrifuge und Zentrifuge laden. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 500 Mikroliter 70% eiskaltes Ethanol und Zentrifuge für weitere 10 Minuten bei 13.000 mal g hinzu. Verwerfen Sie alle Überstand.
Und inkubieren Sie die Rohre bei 50 Grad Celsius für 20 Minuten, um das Nukleinsäurepellet zu trocknen, um sicherzustellen, dass die Rohre teilweise offen bleiben, um die Verdunstung von Ethanol zu ermöglichen. Als nächstes 100 Mikroliter Kernfreies Wasser in das Pellet geben und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang brüten. Wirbeln Sie die Probe für drei Sekunden und fahren Sie mit der DNA-Entfernung fort oder speichern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie einsatzbereit ist.
Hergestellte DNA-Mischung nach den Manuskriptrichtungen und Pipette 11 Mikroliter in jede Röhre mit RNA-Extrakt. Wirbel für drei Sekunden und drehen Sie kurz nach unten, um alle Tröpfchen von der Wand des Rohres zu entfernen. Dann inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten im heißen Block oder Inkubator.
Nach der Inkubation einen zusätzlichen Mikroliter des dna-Enzyms direkt in die Röhre geben und durch Wirbeln gut vermischen. Dann inkubieren Sie die Rohre für weitere 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Das Inaktivierungsreagenz der DNA auftauen und wirbeln.
Fügen Sie dann 10 Mikroliter zu jedem RNA-Extrakt hinzu. Und die Rohre bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubieren. Wirbeln Sie die Rohre dreimal während des Inkubationsschritts.
Zentrifugieren Sie dann die Mischung zwei Minuten lang bei 13.000 mal g und übertragen Sie den Überstand vorsichtig in eine 1,5-Milliliter-RNA-freie Röhre, um sicherzustellen, dass keine der Inaktivierungsmatrix berührt wird. Verdünnen Sie dann alle unbekannten RNA-Proben eins bis zehn im freien Wasser der RNA, mischen Sie sie, indem Sie sie fünf Sekunden lang wirbeln und kurz nach unten drehen. MTB- und EC-RNA-Proben auftauen und sieben- bzw. sechsfach verdünnte Proben für eine Standardkurve herstellen.
Bereiten Sie RT plus und RT minus PCR Master-Mischungen entsprechend den Manuskriptrichtungen vor. Vortex die RT plus mischen und übertragen 16 Mikroliter in jedem RT plus PCR-Rohr. Dann wirbeln Sie den RT Minus mix und fügen Sie 16 Mikroliter in jedem RT minus PCR-Rohr.
Fügen Sie vier Mikroliter RNA-Extrakt oder Wasser hinzu und duplizieren Sie die RT plus Röhren. Das Wasser ist die Nicht-Vorlagen-Steuerung oder NTC. Fügen Sie vier Mikroliter RNA-Extrakt oder Wasser zu den RT minus Röhren hinzu.
Laden Sie die Reaktionsrohre in die Echtzeit-PCR-Maschine, programmieren Sie die Reaktion wie im Manuskript beschrieben und führen Sie die Reaktion aus. Um das Behandlungsverhalten zu interpretieren, verwenden Sie die Standardkurve, um CQ-Werte in bakterielle Last umzuwandeln und die Reaktion als Änderung der bakteriellen Belastung während des Behandlungsnachbeobachtungszeitraums zu berechnen. Der Rückgang der bakteriellen Belastung nach der Behandlung bedeutet eine positive Reaktion, während keine Veränderung oder Zunahme der bakteriellen Belastung eine negative Reaktion impliziert.
Um zu überprüfen, ob alle M.tuberculosis-Bazillen wärmeinaktiviert waren, wurde die optische Dichte der Zellen gemessen und mit der von lebenden Zellen verglichen. Für die inaktivierten Wärmeproben wurde keine Veränderung der OD im Laufe der Zeit beobachtet, was auf kein Wachstum hindeutet. Wärmeinaktivierte Proben wurden bei 37 Grad Celsius inkubiert, um festzustellen, ob die RNA nach der Wärmeinaktivierung von Zellen abgebaut wird.
Es wurde kein Unterschied zwischen der RNA gefunden, die unmittelbar nach der Hitzeinaktivierung geerntet wurde, und der RNA isolierte ein, zwei, drei und vier Tage später in beiden BCG-Kulturen und TB-positivem Sputum. Wenn das A-Enzym der RNA den Proben vor und nach der Wärmeinaktivierung exogen zugesetzt wurde, trat in allen wärmeinaktivierten Proben über vier Tage inkubiert er den RNA-Verlust auf. Die Wirkung der Wärmeinaktivierung auf ribosomale RNA wurde in BCG-Kulturen und Sputum von TB-positiven Patienten gemessen.
Die gemessene bakterielle Belastung der Kontrollkultur war höher als die kombinierte bakterielle Last der inaktivierten Wärmekultur bei 80 Grad Celsius, 85 Grad Celsius und 95 Grad Celsius für BCG- und Sputumproben. Die Wärmeinaktivierung der Proben führt zu einem minimalen VERLUST der RNA, so dass eine ausreichende RNA für nachgeschaltete TB-MBLA und andere nachgeschaltete molekulare Tests übrig bleibt. Transmission Electron Microscopy wurde verwendet, um zu untersuchen, ob Zellen durch Wärmeinaktivierung lysiert.
Die Inspektion der Zellen bei niedrigerer und höherer Vergrößerung ergab die intakten Zellwände und die sichtbaren intrazellulären Lipidkörper. Die Zellen erschienen ländisch, aber nicht lysiert. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Extraktionskontrolle hinzuzufügen, die für alle falschen negativen Ergebnisse aufgrund schlechter RNA-Extraktion steuert.
Dieser Ansatz kann auf Bakterien angewendet werden, die mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, nicht-tuberkulöser Mykobakterien-Infektion und anderen Atemwegserregern assoziiert sind. Die quantitativen Ergebnisse von TB-MBLA haben eine mathematische und pharmako-Modellierung ermöglicht, wie Patienten auf eine Tuberkulosetherapie reagieren. Wir freuen uns darauf, die Technik in der Routineversorgung anzuwenden, in der Tuberkulosepatienten behandelt werden.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt einen molekularen bakteriellen Belastungstest für Tuberkulose, der nach der Hitzedinaktivierung von Sputumproben durchgeführt wird. Diese Methode macht die Proben nicht infektiös und ermöglicht eine sicherere Untersuchung, ohne dass Hochsicherheitslabore benötigt werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Infektionskrankheiten
- Diagnostische Methoden
Hintergrund
- Tuberkulose ist ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem.
- Die genaue Bestimmung der bakteriellen Belastung ist entscheidend für die Therapiemonitoring.
- Herkömmliche Methoden erfordern eine hohe Sicherheitsstufe aufgrund infektiöser Proben.
- Die Hitzeinaktivierung bietet eine sicherere Alternative für die Handhabung von Proben.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines sicheren und wirksamen Tests zur Messung der tuberkulösen Bakterienlast.
- Beurteilung der Krankheitslast des Patienten und der Therapieantwort.
- Bereitstellung einer Methodik, die auch auf andere bakterielle Pathogene anwendbar ist.
Verwendete Methoden
- Inaktivierung von Sputumproben durch Erhitzen auf 95 Grad Celsius.
- RNA-Extraktion mittels Phenol-Chloroform oder alternativen Methoden.
- Echtzeit-PCR zur Quantifizierung der bakteriellen Last.
- Herstellung einer Standardkurve für genaue Messungen.
Hauptergebnisse
- Der Test liefert quantitative Ergebnisse zur Tuberkuloselast.
- Er misst wirksam Veränderungen der bakteriellen Belastung während einer Behandlung.
- Die Methodik kann für andere bakterielle Infektionen angepasst werden.
- Visuelle Demonstrationen verbessern das Lernen und die Beherrschung der Technik.
Schlussfolgerungen
- Der entwickelte Test stellt eine sichere Alternative für die Tuberkulose-Diagnostik dar.
- Er ermöglicht eine effektive Überwachung des Behandlungsansprechens.
- Er bietet ein Potenzial für eine breitere Anwendung bei der Diagnose anderer bakterieller Krankheitserreger.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die TB-MBLA bietet eine quantitative, auf RT-qPCR basierende Methode zur Messung der Mycobacterium-tuberculosis-Bazillenlast in Sputumproben und ermöglicht so eine objektive Beurteilung der Krankheitslast und des Behandlungsansprechens. Durch die Einbindung einer Hitzeinaktivierung erlaubt der Test die sichere Handhabung infektiöser Proben außerhalb von Hochsicherheitslaboren und unterstützt eine breitere Anwendung in entdeckungs- und translationsorientierten Forschungsumgebungen. Diese Fähigkeit fördert die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in der Entwicklung von Antiinfektiva, indem sie reproduzierbare, quantifizierbare Biomarker der Pathogenlast liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem Veränderungen der bakteriellen Belastung quantifiziert werden, was einen direkten Nachweis der Zielstrukturnbindung und Wirksamkeit eines Wirkstoffs liefert.
- Operationaler Wert: Bietet ein standardisiertes und reproduzierbares Maß für die Pathogenbelastung, das Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in der Leitstruktur-Optimierung unterstützt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messungen der abhängigen Variablen (eCFU/mL) mittels Cq-Werten und Standardkurven und ermöglicht damit Dosis-Wirkungs- und Zeitverlaufs-Analysen im antimikrobiellen Screening.
- Operativer Wert: Liefert skalierbare, hochdurchsatzfähige Messwerte nach RNA-Extraktion und RT-qPCR und unterstützt die Standardisierung von Assays über verschiedene Substanzbibliotheken hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt krankheitsrelevante Systeme, indem die bakterielle Belastung in klinisch relevanten Matrices (Sputum) gemessen wird, wodurch in-vitro-Befunde mit ex-vivo-Pathogendynamiken verknüpft werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem ein konsistenter Biomarker für die Behandlungsantwort über alle Studienphasen hinweg bereitgestellt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die TB-MBLA fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Hypothesenprüfung bis zur präklinischen Wirksamkeitsbewertung ein, wobei die quantitative Pathogenlast als mechanistische Brücke zwischen Substanzexposition und biologischem Ergebnis dient.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Wirkwegen, indem die bakterielle Belastung als funktioneller Endpunkt der anti-tuberkulösen Wirkung gemessen wird.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft des Assays durch standardisierte RNA-Extraktion und RT-qPCR-Arbeitsabläufe, die quantitative, reproduzierbare Ergebnisse für die Bewertung von Wirkstoffen liefern.
- Analytik: Erzeugt Cq-Werte und aus der Standardkurve abgeleitete eCFU/mL-Messungen, die einen Vergleich über verschiedene Bedingungen hinweg sowie die statistische Analyse von Behandlungseffekten ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem Proben aus Sputum verwendet werden, um die klinisch relevante bakterielle Belastung abzubilden und risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung zu unterstützen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine wiederverwendbare Methode zur Quantifizierung der bakteriellen Belastung bei verschiedenen Krankheitserregern dar, für die bereits eine Anwendbarkeit auf nicht-tuberkulöse Mykobakterien und COPD-assoziierte Bakterien nachgewiesen wurde.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine quantitative, mechanistisch verknüpfte Biomarker-basierte Vorhersage zur Bestätigung von Zielstrukturen anhand des bakteriellen Befalls.
- Operationaler Wert: Stellt durch Hitzedinaktivierung, standardisierte RNA-Extraktion und RT-qPCR mit internen Extraktionskontrollen Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühzeitige, datengestützte Go/No-Go-Entscheidungen auf Grundlage messbarer Veränderungen der Pathogenlast ermöglicht werden.
- Portfolio-Beitrag: Unterstützt eine risikoadjustierte Priorisierung, indem ein translationaler Biomarker bereitgestellt wird, der mit der Behandlungsreaktion in den Phasen der Entdeckung und präklinischen Entwicklung korreliert.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in molekularer Biosicherheit, RNA-Handhabung und RT-qPCR-Arbeitsabläufen, um die Schritte zur Hitzeinaktivierung und Extraktion durchzuführen.
- Setzt Zugang zu Echtzeit-PCR-Geräten, Kühlung für Reagenzien und biosicherheitskonformen Laborräumen für die anfängliche Probenvorbereitung voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der RNA-Extraktion und der Verwendung von Hemmkontrollen, um konsistente Ergebnisse an verschiedenen Standorten sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn der Test auf verschiedene Probentypen oder bakterielle Erreger über Mtb hinaus angewendet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie einen log10-eCFU/mL-RNA-Verlust von <60 % aufgrund einer durch Hitzeinaktivierung induzierten Lyse, was die Empfindlichkeit bei Proben mit geringer Belastung beeinträchtigen kann.
