Zellkultur auf Siliziumnitridmembranen und Kryovorbereitung für Synchrotron-Röntgenfluoreszenz Nano-Analyse

Neu entwickelte Synchrotron-Röntgenfluoreszenz-Nanosonden ermöglichen die Visualisierung der elementaren Verteilung einer Probe. Die Verwendung kryogener Ansätze ist obligatorisch, um Die Schäden an Röntgenstrahlung zu verlangsamen. Daher ist eine schnelle Kryofixierung unerlässlich, um gefrorene hydratisierte Zellen zu erhalten, um die Erhaltung der Zellstruktur und ihre chemische Integrität zu optimieren.

Die Spezifität der zellulären Präparate für Synchrotronstudien führt zur Optimierung dieses Protokolls für den Erwerb gefrorener hydratisierter Zellmonolayer. Visuelle Demonstration ist wichtig, um zu verstehen, wie man die Zellmonolayer-Proben manipuliert, um reproduzierbar kryofixierte Zellen zu erreichen, die in eine dünne Eisschicht eingebettet sind. Um eine Siliziumnitrid-Membranstütze vorzubereiten, öffnen Sie die Kapsel mit der Membranstütze und drücken Sie die Kapsel vorsichtig, um die Stütze leicht zu lösen.

Verwenden Sie dünne Pinzette, um eine Ecke des Siliziumrahmens zu greifen, wobei darauf zu achten ist, dass die Siliziumnitridmembran in der Mitte des Rahmens nicht berührt wird, und legen Sie den Rahmen in eine ungedeckte Petrischale in einem laminaren Strömungsschrank. Anschließend sterilisiert UV die Membran für 25 bis 30 Minuten. Am Ende der Sterilisation 10 Mikroliter Befestigungsfaktor wie Poly-L-Lysin hinzufügen.

25 Minuten bei 37 Grad Celsius und bei 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit inkubieren. Dann füllen Sie die Brunnen einer sterilen 48-Well-Platte mit 200 bis 250 Mikroliter 0,22 Mikrometer gefiltertultrar und Ultra-Spurenwasser pro Brunnen. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Membran vorsichtig vertikal mit drei aufeinanderfolgenden 10-Sekunden-Spülungen in einem Brunnen mit Wasser zu untertauchen.

Nach dem Spülen die Membran vertikal in einen leeren Brunnen einer sterilen 96-Well-Platte unter die laminare Strömungshaube legen und über Nacht bis zum Trocknen lassen. Für die Aussaat der von Interesse interessierten Zellen die beschichtete Membran mit der flachen Seite nach oben in einem Brunnen einer sterilen Vier-Brunnen-Platte legen. Fügen Sie den vier Zellen in 10 Mikrolitern eines geeigneten Kulturmediums fünfmal 10 Zellen zur Oberfläche der Siliziumnitridmembran hinzu, ohne die Membran zu berühren.

Der Tropfen sollte die gesamte Membran abdecken. Dann kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit. Wenn die Zellen begonnen haben, sich an das Substrat zu heften, fügen Sie langsam einen Milliliter komplettes Kulturmedium an die Wand jedes Brunnens hinzu, der jede Membran bedeckt.

Dann kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit. Für die Kryoimmobilisierung der zellulären Zubereitung zuerst einen automatischen Tauchgefrierschrank einschalten und die entsprechende Anzahl von Brunnen in einer 12-Well-Kunststoffplatte mit 37 Grad Celsius Ammoniumacetatpuffer füllen. Unmittelbar vor dem Spülen und Tauchen der Membran, entfernen Sie die Probe aus dem Inkubator und verwenden Sie den schwarzen Klemmring einer Schnellspannzange, um die Pinzette zu entsperren.

Verwenden Sie die entsperrte Pinzette, um die Membranstütze zu erfassen und die Membran für etwa fünf Sekunden vertikal in die Ammoniumacetat-Pufferlösung einzutauchen. Um überschüssige Puffer zu entfernen, drücken Sie die Unterseite der Membranstütze auf Filterpapier und bteilen Sie jede Seite des Rahmens auf das Filterpapier, ohne dass die Membran das Papier berühren kann. Wenn der überschüssige Puffer entfernt wurde, öffnen Sie die Umweltkammertür, schieben Sie die Pinzette schnell in die Zangenverriegelung und schließen Sie die Tür der Kammer.

Drücken Sie Blot Ein Sprung. Die Pinzette, die die Siliziumnitridmembran hält, wird schnell in das Kryogen gestürzt. Nach dem Einfrieren den Deckel des Transferbehälters mit vorgekühlten Zangen und Pressentransfer entfernen.

Die Siliziumnitridmembran wird leicht über dem Kryogen bewegt. In einer schnellen Einzelbewegung schieben und kippen Sie die Pinzette leicht aus der Zangenverriegelung, um die Pinzette direkt in einen leeren Schlitz der Kryobox im mit Stickstoffflüssigkeit gefüllten Transferbehälter zu bringen. Lassen Sie dann den schwarzen Klemmring los, um die Membran zu befreien.

Zum Einfrieren der Gefriertrocknung der tauchgefrorenen Zellen verwenden Sie den Wippschalter auf der Rückseite des Gefriertrocknungsgeräts, um das Gerät einzuschalten. Auf dem Display wird die Drucktaste angezeigt, wenn die Probe geladen werden kann. Montieren Sie den Siliziumnitrid-Membran-Messinghalter auf den vom Lieferanten bereitgestellten Probentransferhalter im Polystyrol-Lagerbehälter, wodurch der Gehalt an flüssigem Stickstoff etwa ein bis zwei Millimeter unter der Oberkante des ersten Messingstücks liegt.

Legen Sie die Membran mit der Zellprobenseite nach oben in den messinghalternummerierten Hohlraum und kühlen Sie den Transferstab in einer flüssigen, mit Stickstoff gefüllten Polystyrolschaumbox vor. Verwenden Sie die Stange, um in der vollmontage zu verriegeln, drücken Sie enter, um das Vakuum zu brechen, um den Deckel der Gefriertrocknerkammer zu lösen, sofort die Probe in die Gefriertrocknerkammer zu übertragen, und schließen Sie den Gefriertrockner-Kammerdeckel. Dann sofort drücken Sie beginnen, um mit dem Gefriertrocknungszyklus fortzufahren.

Drücken Sie am Ende des Gefriertrocknungszyklus den Stopp, um die Kammer zu entlüften, und entfernen Sie die vollständige Baugruppe, um auf die gefriergetrockneten Proben zuzugreifen. Hier wird eine typische optische Videomikroskopansicht von gefrorenen hydratisierten Brustkrebszellzellen gezeigt, die auf eine poly-L-Lysin beschichtete Siliziumnitridmembranunterstützung subkultiviert werden. Die Röntgenfluoreszenz-Elementarkartierung der gefrorenen hydratisierten Zellen zeigt die Verteilung physiologischer Elemente wie Kalium, Schwefel und Zink.

In diesem repräsentativen Beispiel war das eng gebundene Schwefelelement gleichmäßig innerhalb der Zelle in einem ähnlichen Muster wie bei Kalium verteilt und stellt eine gute Schätzung des zellulären Massenprofils dar. Die Zinkverteilung zeigte jedoch ein höheres Signal im Kern als im Zytosol mit einer klar definierten Trennung des Signals zwischen Zytosol und Kern. In dieser typischen Brightfield-Mikroskopie-Ansicht von gefriergetrockneten primären Maus-Hippocampus-Neuronen, die direkt auf einer Siliziumnitridmembran kultiviert werden, wie gezeigt, zeigen die Zellen eine typische neuronale Morphologie, die von ihrer Kultur oder Konservierungsmethode nicht beeinflusst wird.

Röntgenfluoreszenz-Bildgebung von tauchgefrorenen Zellen zeigt auch typische Elementarverteilungen, wie sie von diesen repräsentativen gefriergetrockneten Zellen mit einer räumlichen Auflösung von 50 bis 100 Nanometern gezeigt werden. Das Plotten des Siliziumnitridfensters ist entscheidend, um die dünnste mögliche Eisschicht von Zellen nach dem Einfrieren zu erhalten. Die Erhaltung der chemischen Integrität der Zellen auf subzellulärer Ebene ermöglicht die Erforschung des Metalloms der Zellen mit Synchrotron-Nanosonden sowie mit anderen mikroanalytischen Techniken.

Da nicht alle Synchrotron-Nanosondenanalysen bei kryogener Temperatur durchgeführt werden können, können die gefrorenen hydratisierten Zellen weiter gefriergetrocknet werden, um ihre Analyse bei Raumtemperatur zu erleichtern. Denken Sie daran, bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff geeignete persönliche Schutzausrüstungen zu verwenden und ethangas immer in einer Dunstabzugshaube zu verwenden, die von Flammen entfernt ist.