Name: Kultur der kleinen Kolonie Variante von Pseudomonas aeruginosa und Quantitation seines Alginats (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Lernen Sie die Kultur kleiner Kolonie-Varianten von Pseudomonas aeruginosa und deren Alginat-Quantifizierung mittels ELISA. Diese Methode ermöglicht präzisere Ergebnisse als traditionelle Verfahren.

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Diese Arbeit wurde von den Nationalen Instituten für Gesundheit (NIH) Stipendien R44GM1113545 und P20GM103434 unterstützt.

1. SCV-Wachstumsbedingungen und physiologische Aktivierung des Bergungsweges
<ol><li>Erkennung von SCV.<ol>
<li>Streichen Sie die P. aeruginosa-Stämme PAO1,PAO1-PyrD, PAO581 und PAO581-pyrD auf vorgewärmten Pseudomonas-Isolationsagarplatten (PIA) und wachsen bei 37 °C für 48 h. Auf der Wachstumsplatte ein einzelnes Kolonieisolat mit dem SCV-Phänotyp (Koloniegröße von 1 x 3 mm im Gegensatz zur normalen Koloniegröße von 3 x 5 mm) zu identifizieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 1.1.1, um ein reines Isolat des SCV zu erhalten. HINWEIS: Das Wachstum kann aufgrund der langsamen Wachstumsrate der SCV-Kolonien bis zu 72 h erfordern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Physiologische Aktivierung des Bergungsweges.<ol>
<li>Mit einer sterilen Impfschleife, pflücken Sie die SCV-Kolonie von der PIA-Platte und streifen auf einer vorgewärmten PIA mit 0,1 mM Uracil ergänzt. Anbauplatte bei 37 °C für 24 x 48 h. HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten PIA-Platten enthalten 20 ml/L Glycerin, die der Mischung vor dem Autoklavieren zugesetzt werden. Nach dem Autoklavieren und nach dem Mischen liegt die Temperatur unter 55 °C, bevor die Platten 11,21 mg/L Uracil (0,1 mM) in die flüssigen Medien gegossen werden. Diese Methode würde helfen, Pyrimidin-Mutationen zu identifizieren, die SCV-Phänotyp in P. aeruginosaverursachen. Wenn der SCV-Phänotyp ein Ergebnis dieser Mutation ist, dann würde ein normales Koloniewachstum und eine normale Größe (3-5 mm) auf den uracil ergänzten PIA-Platten beobachtet werden. Wenn Stämme die Fähigkeit hatten, Alginat zu produzieren, dann wird der Mukoid-Phänotyp auch nach Uracil-Supplementierung zurückkehren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Uronsäure Carbazol Assay
<ol><li>Aus einer reinen Kultur der gewünschten Sorte getestet werden, identifizieren Sie eine einzelne Kolonie. Mit einem sterilen Zahnstocher, wählen Sie die Kolonie, und legen Sie den Zahnstocher in einem Kultur-Reagenzglas mit 5 ml Pseudomonas Isolationbrühe (PIB). Wachsen Sie in einem Shaker-Inkubator bei 37 °C für 24 h. HINWEIS: Die folgenden Stämme PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carBund PAO581pyrD wurden auf PIA-Platten oder PIA-Platten angebaut, die mit 0,1 mM Uracil ergänzt wurden, um Alginat zur Messung zu ernten.</li>
	<li>Auf eine vorgewärmte PIA-Platte 150 l kultivierte PIB-Brühe (für 15 mm x 100 mm Platten) oder 450 l Brühe (für 15 mm x 150 mm Platten) geben. Mit einem sterilen Zellstreuer die Brühe über die Platte verteilen. Wachsen Sie die Platte bei 37 °C für 24 h. HINWEIS: Saugen Sie überschüssige Flüssigkeit, falls vorhanden, von der Platte mit einer Pipette, indem Sie die Platte auf eine Seite kippen. Sowohl PIB- als auch PIA-Platten, die im Protokoll verwendet werden, enthalten 20 ml/L Glycerin, die von Zellen als Kohlenstoffquelle zur Unterstützung der Alginatproduktion verwendet werden.</li>
	<li>Mit einem Pipettenregler und einer sterilen 50 ml Pipette, fügen Sie 0,85% NaCl auf den Rasen gewachsen wachsen und proben durch Verschrottung der Platte mit einem Zellstreuer zu sammeln. Die Probe mit einer frischen 50 ml Pipette in ein 50 ml Sammelrohr ansaugen. Wirbeln Sie die Probe auf hoch zu mischen und legen Sie die Proben auf Eis. HINWEIS: Das Volumen der hinzugefügten 0.85% NaCl variiert je nach Größe der Platte. Verwenden Sie für 15 mm x 100 mm Platten 10 x 30 ml und für 15 mm x 150 mm Platten 20 x 50 ml.</li>
	<li>Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) der Proben, indem Sie 1 ml der Probe zu einer Einwegküvette hinzufügen und die OD mit einem Spektralphotometer lesen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um eine Dreifache der Lesevorgänge für jedes Beispiel zu erhalten.</li>
	<li>3 ml der Schwefelsäure/Borat-Lösung in Kulturröhren geben und auf Eis sitzen lassen. Fügen Sie 350 l der gesammelten Probe SLOWLY in die Säuremischung in den Reagenzgläsern und Wirbel auf niedrig kurz.<ol>
<li>Bereiten Sie Boratbrühe vor, indem Sie 10,099 g Kaliumhydroxid (KOH)-Pulver zu 45 ml Wasser hinzufügen. 24,74 g Borsäure (H3BO3) in das Gemisch geben und Volumen auf 100 ml bringen.</li>
		<li>1 L Flasche in ein Waschbecken mit Eis geben und Flasche mit 500 ml konzentrierter Schwefelsäure füllen. SLOWLY 15 ml des vorbereiteten Boratbestandes hinzufügen. Die Flasche abkühlen lassen.</li>
		<li>Fügen Sie weitere 10 ml Borat-Lager für insgesamt 25 ml hinzu. Sobald die Flasche abgekühlt ist, bringen Sie das Volumen auf 1 L. VORSICHT: Diese Methode beruht auf der Verwendung von hochkonzentrierter Schwefelsäure. Es sollten geeignete persönliche Schutzausrüstungen verwendet werden, um die Sicherheit zu gewährleisten, und das ordnungsgemäße Entsorgungsprotokoll der Probe sollte eingehalten werden. HINWEIS: Für eine Positivkontrolle eine bekannte Konzentration von D-Mannuronsäure und/oder einer bekannten bakteriellen Alginatproben, die durch Alginat produzierende Stämme von P. aeruginosa geerntet und gereinigt werden (z. B.: PAO581-PAO1mucA25). Für eine negative Kontrolle verwenden 0.85% NaCl-Lösung und/oderPAO1-algD (In-Frame-Deletion des AlgD-Gens, das die Bakterien völlig unfähig macht, Alginat zu produzieren). Aus jeder Probe können mehrere Rohre hergestellt werden, um die Anzahl der technischen Wiederholungen zu erhöhen, um die statistische Analyse zu unterstützen. Bereiten Sie 3-5 Tuben jeder Probe vor.</li>
	</ol></li>
	<li>Fügen Sie 100 l 0,1% Carbazol in Ethanollösung in die Säure-/Probenmischung ein. Kappen Sie das Rohr und den Wirbel auf mittlerer Einstellung für 5 s. Legen Sie in einem trockenen Bad bei 55 °C für 30 min.</li>
	<li>Nach der Inkubation die Rohre und den Wirbel kurz auf hoch entfernen und 5 min abkühlen lassen. HINWEIS: Farbe zu sehen wäre ein Farbton von lila. Die Farbe bleibt für die Messung für 1 x 2 h stabil.</li>
	<li>Lesen Sie die OD530 jedes Rohres, indem Sie 1 ml des Gemischs zu einer sauberen Küvette hinzufügen und die OD der Proben bei 530 nm auf einem Spektralphotometer lesen. Verwenden Sie das Rohr mit 0,85% NaCl als Leerling zum Spektralphotometer.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Standardkurve vor, indem Sie die OD530 der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von D-Mannuronsäure (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml und 8 g/ml) messen. 2x wiederholen. Extrahieren Sie eine lineare Gleichung aus diesen Messwerten. HINWEIS: Die Standardkurve muss nur einmal durchgeführt werden. Die daraus extrahierte lineare Gleichung kann für spätere Tests verwendet werden.<ol>
<li>Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe mit der Standardkurve und teilen Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD600 auf, um die Gesamtmenge an Alginat pro OD600zu erhalten.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ELISA für Alginat-Quantitation
<ol><li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.4, um Proben für die Alginatmessung zu erhalten. HINWEIS: Die verwendeten Stämme waren PAO1,PAO1-algDund PAO1 mit pHERD20T-algU.</li>
	<li>Mit einer Mikropipette 50 l der gesammelten Probe zu einer unbehandelten 96-Well-Platte hinzufügen. Fügen Sie den Bohrbrunnen 50 l Beschichtungspuffer (Carbonat/Bicarbonatpuffer pH 9.6) hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2 h. HINWEIS: Für eine Positivkontrolle kann eine bekannte Konzentration von D-Mannuronsäure und/oder einem bekannten stabilen Alginat produzierenden Stamm (z. B.: PAO581-PAO1mucA25) verwendet werden. Für eine negative Kontrolle verwenden 0.85% NaCl-Lösung und/oderPAO1-algD (in-Frame-Deletion des AlgD-Gens macht die Bakterien völlig unfähig, alginat zu produzieren). Aus jeder Stichprobe können mehrere Bohrungen hergestellt werden, um die Anzahl der technischen Wiederholungen zu erhöhen, um die statistische Analyse zu unterstützen. Bereiten Sie 3-5 Brunnen jeder Probe vor.</li>
	<li>Mit einer Spritzflasche die Plattenbrunnen 2x mit 1x Phosphatpufferkochin (PBS) mit 0,05% Tween 20 (PBS-T) waschen, indem Sie die Brunnen füllen und dann entleeren, indem Sie die Platte umdrehen.</li>
	<li>Mit einer Mikropipette fügen Sie den Brunnen 200 l Blockierpuffer (10% Magermilch in PBS-T) hinzu. Bei 4 °C über Nacht inkubieren. HINWEIS: Wrap Platte in Paraffinfolie oder Schrumpffolie, um Verdunstung im Kühlschrank zu vermeiden.</li>
	<li>Mit einer Spritzflasche waschen Sie die Plattenbrunnen 2x mit PBS-T, indem Sie die Brunnen füllen und dann durch Umklappen der Platte entleeren.</li>
	<li>Mit einer Mikropipette 100 l verdünnten Primärantikörper (Mausantialginat monoklonaler Antikörper) in die Brunnen geben und bei 37 °C für 1 x 2 h brüten. HINWEIS: Primärer Antikörper (Maus-Anti-Alginat-Monoklonaler Antikörper) wurde in einer Konzentration von 0,5 g/ml (Verdünnung von 1:2.000 von 1 mg/ml-Lager) in einer Verdünnungsmittellösung für Antikörper (1% Magermilch in 1x PBS) bereitgestellt.</li>
	<li>Mit einer Spritzflasche waschen Sie die Plattenbrunnen 3x mit PBS-T, indem Sie die Brunnen füllen und dann durch Umklappen der Platte entleeren.</li>
	<li>Mit einer Mikropipette 100 l verdünnten Sekundärantikörper in die Brunnen geben und bei 37 °C für 1 x 2 h brüten. HINWEIS: Sekundärer Antikörper wurde verwendet, um Ziegen-Anti-Maus-Poly-HRP-Antikörper mit einer Konzentration von 0,25 g/ml (Verdünnung von 1:2.000 von 0,5 mg/ml) in einer Verdünnungslösung für Antikörper zu bohren.</li>
	<li>Mit einer Spritzflasche waschen Sie die Plattenbrunnen 3x mit PBS-T, indem Sie die Brunnen füllen und dann durch Umklappen der Platte entleeren.</li>
	<li>Mit einer Mikropipette 100 L TMB-ELISA-Lösung (Materialtabelle) hinzufügen und bei Raumtemperatur 30 min im Dunkeln brüten. HINWEIS: Die Farbe einer positiven Reaktion wäre ein Blauton.</li>
	<li>Mit einer Mikropipette 100 l Stop-Lösung (2 N Schwefelsäure) hinzufügen. HINWEIS: Die Farbe wird von blau zu gelb, wenn die Stop-Lösung hinzugefügt wird. Die Farbe ist für bis zu 30 min stabil, nachdem die Reaktion gestoppt wurde.</li>
	<li>Lesen Sie den OD mit einem Plattenleser bei 450 nm.</li>
	<li>Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die OD450 der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von D-Mannuronsäure (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml und 8 g/ml) messen. 2x wiederholen. Aus diesen Messwerten wird eine lineare Gleichung extrahiert. HINWEIS: Die Standardkurve muss nur einmal durchgeführt werden. Die daraus extrahierte lineare Gleichung kann für spätere Tests verwendet werden.<ol>
<li>Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe mit der Standardkurve und teilen Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD600 auf, um die Gesamtmenge an Alginat pro OD600zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Statistische Analyse der Alginatmessung
<ol><li>Legen Sie in einem grafischen Softwareblatt eine Spalte mit der linearen Gleichung fest, die von der Standardkurve abgeleitet ist. Legen Sie die Y-Achsenergebnisse als Alginatkonzentration und die x-Achse als OD530 für Uronsäure-Assay und OD450 für ELISA fest, um die Alginatkonzentrationen in jeder Probe zu erhalten.</li>
	<li>Um die Alginatmenge in jeder Probe auf die Menge pro 5,5 x108 KBE/ml (1 OD600)zu normalisieren, dividieren Sie die Konzentration jeder oben erhaltenen Probe durch ihren jeweiligen OD600-Wert. Wenn für jede Probe mehrere OD600 gemessen wurden, dividieren Sie durch den mittleren OD600.</li>
	<li>Führen Sie statistische Analysen mit bevorzugter statistischer Software (z. B. GraphPad Prism 7.02) durch.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software. Wählen Sie Spalte unter Neue Tabelle & Diagramm und wählen Sie den einwegs aNOVA-Datensatz.</li>
	<li>Benennen Sie jede Spalte mit der getesteten Sorte und fügen Sie die Alginatkonzentrationen darunter hinzu.</li>
	<li>Nachdem Sie alle Daten ein- und eingeteilt haben, klicken Sie im oberen Menü auf Analysieren. Dadurch wird ein Analyseeinstellungsfenster geöffnet. Wählen Sie die entsprechenden Parameter für Tests aus, und geben Sie an, ob mehrere Vergleiche ausgeführt werden müssen. HINWEIS: Nach der Analyse enthält der Datensatz einen p-Wert, der helfen würde, die statistische Signifikanz der Daten zu bestimmen. Die Daten würden als statistisch signifikant angesehen, wenn der p-Wert kleiner als der festgelegte Wert ist (normalerweise wird der Wert für p < 0,01 festgelegt).</li>
	<li>Wählen Sie unter der Registerkarte Diagramm den Bar-Graph-Typ aus. Dadurch werden die Daten mit dem angegebenen Titel aus dem Eingabedatenblatt automatisch dargestellt. Geben Sie die statistische Signifikanz der Daten nach Bedarf an, indem Sie das *-Symbol über Verbindungslinien zwischen den Balken von Interesse anzeigen.</li>
</ol>

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</ol>

Der Autor Hongwei D. Yu ist Chief Science Officer und Mitbegründer von Progenesis Technologies, LLC.

Sowohl SCV als auch Alginat sind wichtige Krankheitsmarker, die an mehreren chronischen Infektionen beteiligt sind. Daher ist die Fähigkeit, SCV zu züchten sowie die Regulation und Produktion von Alginat durch P. aeruginosa zu untersuchen, ein wesentlicher Bestandteil der Entdeckung neuartiger Behandlungen für diese chronischen Krankheiten.
SCV-Stämme sind aufgrund ihrer langsamen Wachstumsrate4 im Vergleich zu anderen P. aeruginosa-Stämmen, die in ihr...

Chronische Lungeninfektionen mit Pseudomonas aeruginosa sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Patienten mit Mukoviszidose (CF). In der frühen Kindheit werden die Patienten von mehreren bakteriellen Krankheitserregern besiedelt, einschließlich nichtmucoiden Isolaten von P. aeruginosa1,2. Die Entstehung der kleinen Kolonievariante (SCV) Isolate sowie Schleimhautisolate ist ein Marker für den Beginn chronischer Infektionen. SCV-Isolate sind aufgrund ihrer langsamen Wachstumsratenhochresistent3 , was sie zu einer schweren Abschreckung in den Behandlungsregimentern und anderen chronischen Infektionen5 von P. aeruginosamacht. Arbeiten von Al Ahmar et al.6 zeigten einen Zusammenhang zwischen SCV und Schleimhaut, der durch de novo pyrimidin Biosynthese verbunden ist. Pyrimidin-Hunger aufgrund von Mutationen in Genen, die an der Pyrimidinproduktion beteiligt waren, führte zu Einem SCV-Phänotyp im Nichtmucoid-Referenzstamm PAO1 und dem Schleimhautderivat PAO581 (PAO1mucA25).
Obwohl Alginat-Überproduktion ein wichtiger Krankheitsmarker für chronische Lungeninfektionen bei CF ist, ist es nicht klar, ob es einen direkten Zusammenhang zwischen der Menge an Alginat und Lungenpathologie gibt, und es ist unklar, ob Alginat als Prognosemarker fürdieBehandlung 7 verwendet werden kann. Die Alginatproduktion wird hauptsächlich durch zwei Operonen reguliert, einen regulatorischen Operon (algUmucABCD)8,9 und den biosynthetischen Operon (algD operon)10,11. Die Alginatproduktion wird durch den Sigma-Faktor AlgU9,12 (auch bekannt als AlgT) und den Abbau des Anti-Sigma-Faktors MucA13streng reguliert. Die Fähigkeit, die Produktion von Alginat vor Ort aus den Sputumproben der Patienten zu überwachen, kann bei der Entwicklung neuer therapeutischer Optionen helfen.
Hier beschreiben wir einen Wachstumszustand, der das Vorhandensein von SCV erkennt, das durch Mutanten verursacht wird, die pyrimidin de novo nicht synthetisieren können. Die Ergänzung von Uracil und/oder Cytosin, der stickstoffhaltigen Basis von Pyrimidinnukleotid, zum Medium aktiviert den Bergungsweg und stellt so das normale Wachstum von Mutanten wieder her. Diese Wachstumsmethode für diese spezifischen SCV-Mutationen kann als Screening-Methode zur Identifizierung von Pyrimidin-Mutationen in Patientenproben verwendet werden. Darüber hinaus diskutieren wir zwei Methoden zum Nachweis und zur Messung von Alginat, das von P. aeruginosahergestellt und abgesondert wurde. Die erste ist die traditionelle Methode14,15,16 der Abbau des Polysaccharids mit einer hohen Konzentration von Säure und dann Hinzufügen eines kolorimetrischen Indikators, um die Konzentration in der Probe zu quantitieren. Die zweite Methode, die in unserem Labor entwickelt wurde, nutzt den Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) mit einem von QED Biosciences entwickelten monoklonalen Antialginat-Antikörper (mAb). Die ELISA-Methode erweist sich als spezifischer und empfindlicher als der Uronsäure-Assay und ermöglicht eine sicherere Anwendung durch die Vermeidung der hochkonzentrierten Schwefelsäure. Mit der Fähigkeit des ELISA, direkt auf Patientensputumproben verwendet zu werden, um Alginat zu messen, kann es als Überwachungs-Diagnose-Tool entwickelt werden, um die Menge an Alginat in der Lunge in verschiedenen Perioden der Infektion zu verfolgen.

<table><tbody><tr><td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol (200 Proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Molekularer Bio-Grade</td></tr><tr><td>Accu Block Digital Dry Bath Labnet</td><td></td><td>NC0205808</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Assay-Platten 96-Well</td><td>CoStar</td><td>2021-12-20</td><td></td></tr><tr><td>Tischgerät Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>G560</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Research Products International Corp.</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>Schrank-Inkubator</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>Carbazol</td><td>Sigma</td><td>C-5132</td><td></td></tr><tr><td>Karbonat-Bicarbonat-Puffer</td><td>Sigma</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (50 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Kulturreagenzgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-6D</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Küvette Polystyrol (1,5 mL)</td><td>Fisher</td><td>Scientific 14955127</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cytosin</td><td>Acros Organics</td><td>71-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Impfschleifen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannuronsäure-Natrium-Sigma-Aldrich</td><td></td><td>SMB00280 FMC-Alginat</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FMC</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>für Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Maus Anti-Alginat Monoklonaler Antikörper</td><td>QED Biosciences</td><td>N / A</td><td>Lot # : 15725/15726</td></tr><tr><td>Phosphat gepuffertes Kochsalzpulver (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Goat Anti-Maus Poly-HRP Antikörper</td><td>Thermo Scientific</td><td>32230</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>1310-58-3</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas Isolation Agar (PIA)</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas Isolation Broth (PIB)</td><td>Alpha Biosciences</td><td>P16-115</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Runde Zahnstocher</td><td>Diamant</td><td></td><td>Jede Marke</td></tr><tr><td>Algenalginat (Protanal CR 8133)</td><td>FMC Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magermilch</td><td>Difco</td><td>232100</td><td>über Fisher</td></tr><tr><td>Scientific SmartSpec Plus Spektralphotometer</td><td>BioRad</td><td>170-2525</td><td>oder bevorzugter Anbieter</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x Multi-Mode MicroPlate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>i3x</td><td>oder bevorzugter Anbieter</td></tr><tr><td>Sterile Petrischale 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>über Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A298-212</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure in technischer Qualität (2 Normal-Stopp-Lösung)</td><td>R& D Systems</td><td>DY994</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Acros Organics</td><td>66-22-8</td><td></td></tr></tbody></table>

kultur der kleinen kolonie variante von pseudomonas aeruginosa und quantitation seines alginats

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, ein opportunistischer gramnegativer bakterieller Erreger, kann ein Exopolysaccharidalginat überproduzieren, was zu einem einzigartigen Phänotyp namens Schleimhaut führt. Alginat ist mit chronischen Lungeninfektionen verbunden, was zu einer schlechten Prognose bei Patienten mit Mukoviszidose (CF) führt. Das Verständnis der Wege, die die Produktion von Alginat regulieren, kann bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien helfen, die auf die Alginatbildung abzielen. Ein weiterer krankheitsbedingter Phänotyp ist die kleine Kolonievariante (SCV). SCV ist auf das langsame Wachstum von Bakterien zurückzuführen und oft mit einer erhöhten Resistenz gegen antimikrobielle Mittel verbunden. In diesem Beitrag zeigen wir zunächst eine Methode zur Kultivierung einer genetisch definierten Form von P. aeruginosa SCV aufgrund von Pyrimidin-Biosynthesemutationen. Ergänzung der stickstoffhaltigen Basen, Uracil oder Cytosin, gibt das normale Wachstum zu diesen Mutanten, zeigt das Vorhandensein eines Bergungsweges, der freie Basen aus der Umwelt auffängt. Als nächstes diskutieren wir zwei Methoden zur Messung von bakteriellem Alginat. Das erste Verfahren beruht auf der Hydrolyse des Polysaccharids auf sein Uronsäuremonomer, gefolgt von der Derivatisierung mit einem chromogenen Reagenz, Carbazol, während das zweite Verfahren einen ELISA verwendet, der auf einem kommerziell erhältlichen, alginatspezifischen mAb basiert. Beide Methoden erfordern eine Standardkurve für die Quantifizierung. Wir zeigen auch, dass die immunologische Methode spezifisch für die Alginatquantifizierung ist und für die Messung von Alginat in den klinischen Proben verwendet werden kann.

Abbildung 1 zeigt Platten von PAO1 und PAO581 mit oder ohne Inframe-Deletion im PyrD-Gen (ein Gen im Pyrimidin-Biosyntheseweg), das zu SCV6führt. Die PAO1 SCV Mutante wurde auf normales Wachstum als Reaktion auf Uracil-Supplementierung wiederhergestellt (Abbildung 1A,B). Darüber hinaus wurde die PAO581-pyrD-SCV-Mutation mit der gleichen Uracil-Behandlung in die Schleimhaut zurückg...

Hier beschreiben wir einen Wachstumszustand, um die kleine Kolonievariante von Pseudomonas aeruginosazu kulturen. Wir beschreiben auch zwei separate Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung des von P. aeruginosa hergestellten Exopolysaccharidalginats mit einem traditionellen Uronsäure-Carbazol-Assay und einem alginatspezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) basierenden ELISA.

Kultur der kleinen Kolonie Variante von Pseudomonas aeruginosa und Quantitation seines Alginats

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

Die kleine Kolonievariante oder SCV-Technik ermöglicht die Auswahl und das Wachstum kleiner Kolonievarianten von Pseudomonas aeruginosa. Die Methode ist sehr definitiv und ermöglicht eine einfachere Auswahl als normale Methoden. Dieses Protokoll beschreibt auch eine sicherere, empfindlichere ELISA-Methode zur Alginatquantifizierung im Vergleich zur Standard-Uronsäure-Carbazol-Methode, die eine direkte Alginatquantifizierung in Proben ohne Kautery oder Probenmanipulation ermöglicht.Das Verfahren wird Brandon Kirby, ein Labortechniker, und Roy Al Ahmar, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Um die kleine Kolonievariante oder SCV zu erkennen, streift zuerst der P.aeruginosa-Stamm PAO1 Delta PYRD auf vorgewärmten PIA-Platten. Wachsen Sie die Stämme bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden.Identifizieren Sie auf der Wachstumsplatte ein einzelnes Kolonieisolat, das den SCV-Phänotyp hat, der sich durch eine Koloniegröße von ein bis drei Millimetern im Gegensatz zur normalen Koloniegröße von drei bis fünf Millimetern auszeichnet. Die ausgewählten Kolonien werden erneut entdeckt, um ein reines Isolat des SCV zu erhalten. Um die physiologische Aktivierung des Bergungswegs durchzuführen, verwenden Sie eine sterile Impfschleife, um die SCV-Kolonie aus der PIA-Platte zu wählen.Streichen Sie die ausgewählte Kolonie auf einer vorgewärmten PIA-Platte, ergänzt mit 0,1 Millimolar Uracil. Wachsen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden. Um den Uronsäure-Carbazol-Test zu beginnen, identifizieren Sie eine einzelne Kolonie aus einer reinen Kultur der gewünschten Sorte, die getestet werden soll, und wählen Sie die Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher.Legen Sie den Zahnstocher in ein Kultur-Reagenzglas mit fünf MilliliterPIB. Wachsen Sie in einem Shaker-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Nach der Inkubation ein Aliquot der kultivierten PIB-Brühe auf eine vorgewärmte PIA-Platte geben.Mit einem sterilen Zellstreuer, verteilen Sie die Brühe über den Teller und wachsen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Mit einem Pipettenregler und einer sterilen 50-Milliliter-Pipette 0,85% Natriumchlorid auf den erwachsenen Rasen geben und die Probe sammeln, indem sie die Platte mit einem Zellstreuer kratzen. Die Probe mit einer frischen 50-Milliliter-Pipette ansaugen und in ein 50-Milliliter-Sammelrohr geben.Wirbeln Sie die Probe auf hoch zu mischen und legen Sie die Proben auf Eis. Um die OD600 der Proben zu messen, leeren Sie zunächst das Spektralphotometer mit einem Milliliter 0,85% Natriumchlorid. Dann fügen Sie einen Milliliter der Probe zu einer neuen Einweg-Küvette und lesen Sie die OD. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um eine Dreifache der Lesevorgänge für jedes Beispiel zu erhalten.Nun drei Milliliter der Schwefelsäureboratlösung in Kulturröhren geben und auf Eis sitzen lassen. 350 Mikroliter der gesammelten Probe langsam in die Säuremischung in den Reagenzgläsern geben. Nach einem kurzen Wirbeln auf niedrigem Niveau 100 Mikroliter 0,1% Carbazol und Ethanollösung in das Säureprobengemisch geben.Kappen Sie das Rohr und den Wirbel für fünf Sekunden auf der Medium-Einstellung. Dann in einem trockenen Bad bei 55 Grad Celsius für 30 Minuten. Nach der Inkubation die Rohre kurz auf hoch wirbeln und fünf Minuten abkühlen lassen.Verwenden Sie das Rohr mit 0,85% Natriumchlorid als Rohling zum Spektralphotometer. Dann einen Milliliter der Mischung zu einer sauberen Küvette geben und die OD der Proben bei 530 Nanometern auf einem Spektralphotometer lesen. Bereiten Sie eine Standardkurve vor, indem Sie die OD530 der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von d-Mannuronsäure messen.Wiederholen Sie dies zweimal, und extrahieren Sie eine lineare Gleichung aus diesen Messwerten. Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe unter Verwendung der Standardkurve und teilen Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD600 auf, um die Gesamtmenge an Alginat pro OD600 zu erhalten. Mit einer Mikropipette 50 Mikroliter der gesammelten Probe zu einer unbehandelten 96-Well-Platte hinzufügen.Dann 50 Mikroliter ELISA-Beschichtungspuffer in die Brunnen geben. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Mit einer Spritzflasche die Plattenbrunnen zweimal mit PBS-T waschen, indem Sie die Brunnen füllen und dann entleeren, indem Sie die Platte umdrehen.200 Mikroliter Sperrpuffer mit einer Mikropipette in die Brunnen geben und über Nacht bei vier Grad Celsius brüten. Am nächsten Tag den Teller zweimal wie bisher mit PBS-T waschen. Dann 100 Mikroliter verdünnter Primärantikörper in die Brunnen geben und bei 37 Grad Celsius ein bis zwei Stunden brüten.Nach der Inkubation die Plattenbrunnen dreimal wie bisher mit PBS-T waschen. Als nächstes 100 Mikroliter verdünnter Sekundärantikörper in die Brunnen geben und bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden brüten. Nachdem Sie die Platte dreimal wieder gewaschen haben, verwenden Sie eine Mikropipette, um 100 Mikroliter TMB ELISA-Lösung hinzuzufügen.Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln, indem Sie die Platte in eine Schublade legen oder in Folie wickeln. Dann 100 Mikroliter Stop-Lösung hinzufügen. Verwenden Sie einen Plattenleser, um die OD bei 450 Nanometern zu messen.Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die OD450 der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von d-Mannuronsäure messen. Wiederholen Sie die Messungen zweimal, und extrahieren Sie eine lineare Gleichung. Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe mit der Standardkurve und teilen Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD600 auf, um die Gesamtmenge an Alginat pro OD600 zu erhalten.Gezeigt werden hier Proben von PAO581 und PAO581 mit Mutationen in Genen, die Pyrimidin de Novo Biosynthese regulieren, die auf PIA angebaut werden, und PIA, ergänzt mit 0,1 Millimolar Uracil. Die Daten zeigen, dass das Vorhandensein von Uracil in den Medien zur Umwandlung des mutierten Stammes zurück in die Schleimhaut führt, wie die wiederhergestellte Alginatproduktion zeigt. Hier werden Ergebnisse für den monoklonalen Antikörper-basierten Antikörper-basierten Antikörper-Basierten ELISA gezeigt.Kolonien werden auf PIA-Platten mit Arabinose zur Induktion des PBAD-Promotors und des pHERD-20T-Plasmids angebaut. Gezeigt werden PAO1, PAO1 mit dem Expressionplasmid pHERD-20T mit dem wichtigsten Alginat-spezifischen Sigma-Faktor AlgU und PAO1 mit einer In-Frame-Deletion des AlgD-Gens bei der Codierung des wichtigsten Alginat-Biosyntheseenzyms GDP-Mannose-Dehydrogenase. Diese Daten vergleichen die nicht-mukoiden Alginatspiegel, gemessen für PAO1 und PAO1 Delta algD, mit den für PAO1 gemessenen Alginat-Mukoid-Spiegeln mit pHERD-20T algU.Antialginat-ELISA wurde auch an Patienten-Sputum-Proben ohne vorheriges Wachstum auf Platten getestet. Drei CF-Sputumproben mit einem Wachstum von Mukoid P.aeruginosa zeigten nachweisbares Alginat im Vergleich zu zwei Patienten-Sputumproben, die entweder nicht-mukoid P.aeruginosa oder kein P.aeruginosa-Wachstum enthielten. Die Vorbereitung der Standardkurven für die Alginatquantifizierung ist sehr wichtig, da dies eine präzise und genaue Messung von Alginat innerhalb der Probe ermöglicht.Die säurehaltige Lösung, die in der Carbazol-Methode verwendet wird, ist sehr gefährlich, so dass die richtige persönliche Schutzausrüstung und Vorsichtsmaßnahmen verwendet werden müssen, um die Sicherheit zu gewährleisten. Nach der Isolierung von SCVs kann eine weitere genetische Profilierung durchgeführt werden, um auftretende Mutationen und die pathogene Ität, die mit solchen Mutationen verbunden ist, besser zu verstehen. Die ELISA-Methode kann angepasst werden, um chronische Lungeninfektionen bei Patienten mit Mukoviszidose zu überwachen.Darüber hinaus könnte unsere Wachstumsmethode helfen, Infektionen zu diagnostizieren, die durch bestimmte ScVs verursacht werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Papier beschreibt verschiedene Methoden der...

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Quelle: Al Ahmar, R., et al. Kultur einer kleinen Kolonievariante von Pseudomonas aeruginosa und Quantifizierung ihres Alginats. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt einen kolorimetrischen Assay zur Quantifizierung von Alginat, das von Pseudomonas aeruginosa produziert wird, wobei Carbazol zum Nachweis von Uronsäuren nach saurer Hydrolyse verwendet wird. Die Methode ermöglicht eine vergleichende Analyse der Alginatproduktion, normiert auf bakterielle Biomasse in Forschung und klinischen...

Quantifizierung von bakteriellem Alginat mit dem Uronsäure-Carbazol-Assay

Quelle: Al Ahmar, R., et al. Kultur einer kleinen Kolonievariante von Pseudomonas aeruginosa und Quantifizierung ihres Alginats. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt einen kolorimetrischen Immunoassay zur Quantifizierung von Alginat, einem schützenden Exopolysaccharid, das von Pseudomonas aeruginosa produziert wird. Bei dem Verfahren wird eine Mikroplatte mit der Probe beschichtet, spezifische Antikörper aufgetragen und eine Enzym-Substrat-Reaktion verwendet, um eine messbare Farbveränderung...

Quantifizierung von bakteriellem Alginat mit einem Antikörper-basierten enzymgebundenen Immunsorbent-Assay

Hier beschreiben wir ein Protokoll, mit dem Mini-himar1 mariner Transposon-vermittelte Mutagenese zur Erzeugung einer hohen Dichte Insertionsmutante Bibliothek-Bildschirm, zu isolieren und zu identifizieren Roman Alginat-Regulatoren in der prototypischen Pseudomonas aeruginosa Stamm PAO1.

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