Name: Erfassung der Herzverletzungsreaktion von gezielten Zellpopulationen über cleared Heart Three-Dimensional Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Erfahren Sie die dreidimensionale Bildgebung geclearter Herzen zur Analyse zellulärer Dynamiken nach Herzinjektion. Diese Methode mit passivem CLARITY ermöglicht die Verfolgung von Zellpopulationen während der kardialen Regeneration.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Finanzierung dieses Projekts wurde von der UW School of Medicine and Public Health aus dem Wisconsin Partnership Program (A.I.M.) und einem American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.) bereitgestellt.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Guide for the Use and Care of Laboratory Animals und in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee in der School of Medicine and Public Health der University of Wisconsin-Madison durchgeführt. Alle Methoden wurden auf Wildtyp C57BL/6J (B6) und transgenen Mauslinien von Jackson Laboratories durchgeführt.
1. Koronare Arterienokklusion (Myokardinfarkt) Induziert durch Ligation der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) in 1-Tage-alten Neonatalen Mäusen6
<ol><li>Trennen Sie die ein Tage alten neugeborenen Welpen von der Mutter, indem Sie sie zusammen mit einem Teil des ursprünglichen Nistmaterials in einen sauberen Käfig legen.</li>
	<li>Legen Sie die Hälfte des Käfigs auf ein Heizkissen, das auf mittlere Hitze eingestellt ist. Die Welpen sollten auf der unbeheizten Seite des Käfigs bleiben und erst nach der Operation auf die beheizte Seite gelegt werden.</li>
	<li>Erstellen Sie einen sterilen Operationsbereich unter einem Operationsmikroskop. Sammeln Sie sterilisierte chirurgische Geräte (Tabelle 1).</li>
	<li>Anästhetisieren Sie den Welpen über Unterkühlung: Wickeln Sie den Welpen in Gaze, um direkten Hautkontakt mit Eis zu vermeiden und begraben Sie ihn in einem Eisbett für ca. 3-4 min. Überprüfen Sie die Unterkühlung der Mäuse periodisch durch eine Zehenklemme. Neonate vertragen Hypothermie gut, jedoch kann eine längere Exposition gegenüber Unterkühlung zu Erfrierungen und anschließender Sterblichkeit führen.</li>
	<li>Nach der Beägung legen Sie die Maus in der Rückenlage auf den Operationsbereich und sichern Sie die Arme und Beine mit Klebeband. Sterilisieren Sie den operationsfolgenden Bereich der Maus mit einer antiseptischen Lösung.</li>
	<li>Suchen Sie den unteren Brustbereich und machen Sie einen Querschnitt in der Haut mit einer kleinen Sezierenderin. Um die chirurgische Sicht auf die Rippen zu erweitern, trennen Sie die Haut vom Muskel, indem Sie die Haut sanft mit einem Paar Verbandszange heben und vorsichtig gegen die interkostalen Muskeln drücken, wobei die kleine Schere in geschlossener Position ist.</li>
	<li>Suchen Sie den vierten interkostalen Raum (Abbildung 1A) und machen Sie eine kleine, oberflächliche Punktion mit scharfen Zangen, wobei Sie darauf achten, keine inneren Organe zu durchstechen. Führen Sie eine stumpfe Sezierung durch Erweiterung des Bereichs zwischen den interkostalen Muskeln mit Verbandszangen. Die richtige anatomische Positionierung des Einschnitts ist für einen angemessenen Zugang zum Herzen unerlässlich.</li>
	<li>Führen Sie das Herz vorsichtig aus der Brusthöhle, indem Sie einen Finger setzen und zunehmenden Druck auf die linke Seite des Bauches ausüben, während Sie den interkostalen Raum mit Ankleidezangen offen halten (Abbildung 1B). Sobald das Herz außerhalb der Brust ist, entfernen Sie die Verbandszange, entlasten Druck, und lassen Sie das Herz auf den interkostalen Muskeln ruhen.</li>
	<li>Suchen Sie den LAD als den Bereich des Herzens, der weniger gepooltes Blut hat und sich in der richtigen anatomischen Position befindet (Abbildung 1C). Der LAD ist nur unter dem Mikroskop zu sehen, wenn das Herz innerhalb weniger Minuten nach Beginn der Operation zugänglich ist.</li>
	<li>Führen Sie LAD Ligation durch Nahn der LAD mit einer 6-0 Naht (Abbildung 1D). Binden Sie einen quadratischen Knoten zweimal, um Myokardinfarkt zu induzieren (Abbildung 1E). Die Tiefe der Naht in das Myokard kann variieren, jedoch ist die richtige anatomische Positionierung der LAD-Ligation entscheidend für die Reproduzierbarkeit. Beim Ligan der LAD sollte die Naht fest gezogen werden, aber sorgfältig, um den LAD nicht zu trennen. Blanchieren an der Spitze des Herzens wird sofort zu sehen sein (Abbildung 1E)</li>
	<li>Lassen Sie das Herz wieder in die Brusthöhle rutschen; dieser Prozess kann mit Abrichtzangen schonend erleichtert werden. Dicht die Rippen zusammen mit einem Chirurgenknoten gefolgt von einem quadratischen Knoten, mit stumpfer Zange, um den oberen Satz von Rippen zu heben, während eine 6-0 Naht durch den oberen und unteren Satz von Rippen passieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Band, das verwendet wurde, um die Hinterbeine des Welpen zu sichern.</li>
	<li>Die Haut zusammenhalten, indem Sie eine kleine Menge Hautkleber auf den Oberbauch legen. Dann greifen Sie die Haut des Unterbauchs mit feinen Zangen und bedecken Sie den exponierten Brustbereich. Begrenzen Sie die Menge an überschüssigem Kleber, der auf den Welpen verbleibt, da dies die Wahrscheinlichkeit einer Ablehnung und Kannibalismus durch die Mutter erhöhen kann.</li>
	<li>Erleichtern Sie sofort die Erholung von der Anästhesie, indem Sie den Welpen auf ein Heizkissen auf mittlere Rhitze setzen. Wechseln Sie regelmäßig die Platzierung der Neonate, um alle Körperteile gleichmäßig zu erwärmen.</li>
	<li>Lassen Sie das Neugeborene 10–15 min direkt auf dem Heizkissen bleiben. Typischerweise wird die Bewegung innerhalb von 5 min wieder auf DieWärme gebracht.</li>
	<li>Reinigen Sie das Restblut und kleben Sie mit einem Alkoholtuch.</li>
	<li>Bedecken Sie fremde Düfte auf Neonaten, indem Sie den ganzen Körper mit Bettwäsche aus dem ursprünglichen Käfig reiben. Legen Sie den Welpen auf der beheizten Seite in den Käfig, während andere Operationen durchgeführt werden.</li>
	<li>Sobald alle Operationen abgeschlossen sind und Welpen warm und mobil sind, übertragen Sie den Wurf zusammen mit dem ursprünglichen Nistmaterial in den Käfig der Mutter.</li>
	<li>Überwachen Sie die Mäuse 30–60 min nach der Operation und achten Sie auf die Akzeptanz der Welpen durch Verschachtelung und/oder Pflege durch die Mutter.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Mäuse am Morgen nach der Operation. Wenn die Mutter in Bedrängnis ist und die Welpen nicht verschachtelt hat, betrachten Sie eine Pflegemutter für die Welpen.</li>
</ol>2. Löschen des Mausherzes mit Passive CLARITY21,22,23
<ol><li>Anästhetisieren Sie die Maus mit Isofluran. Führen Sie eine Zehenklemme durch, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig sediert ist.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf einen sauberen, chirurgischen Bereich in der Supine-Position, die Arme und Beine mit Klebeband zu sichern.</li>
	<li>Bewahren Sie isoflurane Sedierung auf der Maus mit einem Nasenkegel, bis das Herz extrahiert wird.</li>
	<li>Öffnen Sie die untere Brust, indem Sie das Fell knapp unterhalb des xiphoiden Prozesses mit Gewebezangen halten und einen Schnitt machen, der die Breite des Brustkorbs mit der großen Sezierschere überspannt.</li>
	<li>Schneiden Sie neben den distalen Teilen des Rippenkäfigs mit chirurgischer Schere.</li>
	<li>Setzen Sie den Membranmuskel aus, indem Sie den xiphoiden Prozess mit Gewebezangen erfassen. Lösen Sie die Membran mit gekrümmten Zangen.</li>
	<li>Unter Beibehaltung des Griffs des xiphoiden Prozesses ziehen Sie das Gewebe kranially, bis das schlagende Herz zugänglich ist.</li>
	<li>Greifen Sie das Herz an der Basis mit gekrümmten Zangen und sezieren Sie das Herz aus der Brusthöhle, indem Sie die Aorta und überlegene Vena cava mit einer Iridektomieschere schneiden.</li>
	<li>Während das Herz noch schlägt, legen Sie das Herz in eine Petrischale mit PBS gefüllt, so dass das Herz pumpt das Blut im Inneren, wie es weiter schlägt. Myokardinfarkt kann durch die Überprüfung bestätigt werden, ob sich die Platzierung der Naht in der richtigen anatomischen Position für die LAD-Ligation befindet.</li>
	<li>Drücken Sie das Herz vorsichtig mit Einer Zange, damit das Herz das Restblut vertreiben kann.</li>
	<li>Übertragen Sie das Mausherz in eine Einweg-Glasschale mit 2 ml PBS. Waschen Sie Restblut weg, indem Sie das Herz auf einem Shaker für 10 min bei Raumtemperatur (RT) mehrmals inkubieren. Ändern Sie die PBS-Lösung jedes Mal, bis PBS klar bleibt.</li>
	<li>Entsorgen Sie die PBS und füllen Sie die Durchstechflasche mit 2 ml kaltem 4% Paraformaldehyd (PFA). 4 Stunden bei RT inkubieren (Abbildung 2A).</li>
	<li>Nach der Inkubation die PFA und die Durchstechflasche mit 2 ml PBS entsorgen. Waschen Sie das Herz auf einem Shaker für 10 min bei RT. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal, entleeren und füllen Sie die Durchstechflasche mit neuen PBS jedes Mal vollständig wegwaschen überschüssigePFA.</li>
	<li>PBS entsorgen und die Durchstechflasche mit 2 ml 4% Acrylamid und 0,5% VA-044 Lösung füllen. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Führen Sie am nächsten Tag die Polymerisation durch, indem Sie die Durchstechflasche für 3 Stunden auf einen Beisekblock übertragen, der bei 37 °C eingestellt ist.</li>
	<li>Übertragen Sie das Herz in eine neue Glasschalendurchstechflasche und wiederholen Sie Schritt 2.12 (PBS Waschzyklus).</li>
	<li>PBS entsorgen und die Durchstechflasche mit 2 ml Clearing Solution füllen (Tabelle 2). Bei 37 °C inkubieren, bis das Herz gereinigt ist. Wechseln Sie die Lösung aus und füllen Sie sie alle 2–3 Tage mit einer frischen Clearing-Lösung auf. Der Clearingprozess kann mehrere Wochen dauern (Abbildung 2B-C). HINWEIS: P1-Herzen dauern in der Regel etwa 3 bis 5 Tage, während P21-Herzen fast einen Monat dauern können, bevor die Inkubation der Clearing-Lösung abgeschlossen ist.</li>
	<li>PBS entsorgen und die Durchstechflasche mit 2 ml PBS füllen und Schritt 2.12 (PBS-Waschzyklus) wiederholen. Die Durchstechflasche mit frischem PBS nachfüllen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Wenn eine Immunfärbung durchgeführt wird, überspringen Sie die Schritte 2.21–2.22 und fahren Sie mit Abschnitt 3 für die Immunfärbung fort. Wenn Sie sich ausschließlich auf die endogene Fluoreszenz verlassen, fahren Sie mit den Schritten 2.21–2.22 fort und überspringen Sie Abschnitt 3.</li>
	<li>Verwerfen Sie PBS, und ändern Sie die Lösung in Rfractive Index Matching Solution (RIMS) (Tabelle 3). Über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Nach der Inkubation kann das gereinigte Gewebe in RIMS-Lösung bei RT gelagert werden. Gewebe kann in der Mitte weiß und undurchsichtig erscheinen, wenn es zuerst in RIMS übertragen wird; Gewebe sollte transparent werden, nachdem es mehrere Wochen lang in RIMS bei Raumtemperatur inkubiert wurde (Abbildung 2D).</li>
</ol>3. Optional: Immunohistochemie Färbung des Ganz-Mount-Mausherzes
<ol><li>Entfernen Sie das gereinigte Herz aus der RIMS-Lösung und legen Sie es in eine saubere 2,5 ml Glasdurchstechflasche mit 2 ml PBST (PBS mit 0,1% Triton-X 100)</li>
	<li>Waschen Sie das Herz in PBST 3 mal auf einem Orbitalrotator mit 30 min Inkubationen bei RT.</li>
	<li>Blockieren Sie die unspezifische Antikörperbindung, indem Sie das Herz in 2 ml 20% Sperrpuffer (in PBST verdünnt) eintauchen und mit Rotation für 3 Stunden bei RT inkubieren. Über4 °C übertragen, um über Nacht mit Rotation zu färben. HINWEIS: Der Blockierpuffer besteht aus einem normalen Serum, das der Art entspricht, in der der sekundäre Antikörper aufgezogen wurde.</li>
	<li>Waschen Sie das Herz in PBST 3 mal mit Rotation für 5 min Inkubationen bei RT.</li>
	<li>Tauchen Sie das Herz in primärer Antikörper ein (in 2% Blockierpuffer mit PBST verdünnt) und verhindern Sie Lichteinwirkung, indem Sie die Glasflasche in Aluminiumfolie wickeln. Inkubieren Sie mit Rotation über Nacht bei RT. HINWEIS: Von diesem Punkt an sollte Aluminiumfolie kontinuierlich verwendet werden, um die sekundäre vor Umgebungslichteinwirkung zu schützen.</li>
	<li>Weitere 24 Stunden mit Drehung bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie nach der primären Färbung Schritt 3.2 (langer PBST-Waschzyklus), um den ungebundenen Primärantikörper aus dem Gewebe zu entfernen. Verlängern Sie die Wäsche mit einer nächtlichen Inkubation mit Rotation bei RT.</li>
	<li>Arbeiten sie in einem Bereich mit begrenzter Beleuchtung, um eine Sekundärlichtexposition zu verhindern, tauchen Sie das Herz in sekundären Antikörper (verdünnt in 2% Sperrpuffer mit PBST) und inkubieren sie mit Rotation für 3 Stunden bei RT. Übertragen Sie auf 4 °C, um über Nacht mit Rotation zu färben.</li>
	<li>Wiederholen Sie am nächsten Tag Schritt 3.2 (langer PBST-Waschzyklus), um ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Lösung durch 2% Sperrpuffer (in PBST verdünnt). Entfernen Sie den verbleibenden ungebundenen Antikörper, indem Sie über Nacht mit Rotation bei RT waschen.</li>
	<li>Überprüfen Sie am nächsten Tag, ob überschüssiger sekundärer Antikörper mit der konfokalen Mikroskopie entfernt wurde. Erweitern Sie die Wäsche nach Bedarf und ersetzen Sie täglich die 2%-Blockierpufferlösung. Gehen Sie einmal wenig bis keine unspezifische sekundäre vorhanden ist.</li>
	<li>Das immunbefleckte Herz in PBS bei 4 °C aufbewahren.</li>
	<li>Direkt vor der Vollmontagemikroskopie das Herz in RIMS-Lösung über Nacht bei 37 °C inkubieren. Verlängern Sie die Inkubation um weitere 24 Stunden, wenn das Gewebe noch nicht vollständig gereinigt ist.</li>
	<li>Bewahren Sie das vollständig gereinigte und immunbefleckte Herz in RIMS bei RT auf.</li>
</ol>4. Visualisierung von Nicht-Myozytenpopulationen in 3D mit Single-Photon Confocal Microscopy Imaging des gelöschten Mausherzes
HINWEIS: Wenn Mausherzen embryonal geerntet werden, fahren Sie mit Abschnitt 4.1 fort. Für Mausherzen, die postnatal geerntet werden, fahren Sie mit Abschnitt 4.2 fort.
<ol><li>Imaging des gelöschten embryonalen Mausherzes<ol>
<li>Füllen Sie den Mikroskop-Depressionsschlitten mit der PBS-Lösung.</li>
		<li>Nehmen Sie das gereinigte Herz vorsichtig mit gekrümmten Zangen auf und legen Sie das Gewebe auf die Rutsche.</li>
		<li>Montieren Sie die Rutsche mit einem Glasdeckel. Das Gewebe kann nun unter einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging des gelöschten postnatalen Mausherzes<ol>
<li>Füllen Sie die Hälfte der Kammer der Depressionsrutsche mit PBS-Lösung. Um eine Kammer zu schaffen, die groß genug ist, um ein erwachsenes Mausherz zu passen, wurde ein 3D-gedrucktes Polypropylen-Vertiefungsschlitten nach Maß gefertigt (Abbildung 4).</li>
		<li>Nehmen Sie das gereinigte Herz vorsichtig mit gekrümmten Zangen auf und legen Sie das Gewebe in die Kammer. Füllen Sie das restliche Volumen der Kammer mit PBS.</li>
		<li>Füllen Sie die Kammer mit PBS, so dass die Oberfläche der Flüssigkeit eine Kuppel über der Oberseite der Kammer bildet. Montieren Sie die Abdeckungsrutsche. Das Gewebe kann nun unter einem aufrechten konfokalen Mikroskop abgebildet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart%3A+insights+from+the+fall-out%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li>
<li>Kikuchi, K., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regenerative+capacity+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac regenerative capacity and mechanisms.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).</li>
<li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+neurocardiology%3A+development%2C+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li>
<li>Savarese, G., Lund, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Public+Health+Burden+of+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+Failure+Review%22%5BJournal%5D)">Global Public Health Burden of Heart Failure.</a> Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li>
<li>Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+models+for+cardiac+regeneration+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice.</a> Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).</li>
<li>Karwowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+infarct+artery+location%2C+acute+total+coronary+occlusion%2C+and+mortality+in+STEMI+and+NSTEMI+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Polish+Archives+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients.</a> Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).</li>
<li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).</li>
<li>MAGGIC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survival+of+patients+with+heart+failure+with+preserved+or+reduced+left+ventricular+ejection+fraction%3A+an+individual+patient+data+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis.</a> European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).</li>
<li>Notari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+microenvironment+limits+the+regenerative+potential+of+the+mouse+neonatal+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart.</a> Science Advances. 4 (5), 5553(2018).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neonatal+and+adult+mammalian+heart+regeneration+by+the+miR-15+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).</li>
<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Unique+Collateral+Artery+Development+Program+Promotes+Neonatal+Heart+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration.</a> Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+neonatal+cardiac+extracellular+matrix+prevents+widespread+ventricular+remodeling+in+adult+mammals+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomateria%22%5BJournal%5D)">Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction.</a> Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).</li>
<li>Mahmoud, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerves+Regulate+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Heart+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration.</a> Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).</li>
<li>Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+lineage+tracing+methods+and+intestinal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors.</a> Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).</li>
<li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to tissue clearing.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biol. 14, 48(2014).</li>
<li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).</li>
<li>Phillips, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+passive+CLARITY+and+immunofluorescent+labelling+of+multiple+proteins+in+human+cerebellum%3A+understanding+mechanisms+of+neurodegeneration+in+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease.</a> Scientific Reports. 6, 26013(2016).</li>
<li>Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Infarction+in+Neonatal+Mice%2C+A+Model+of+Cardiac+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e54100(2016).</li>
<li>Sereti, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cardiomyocyte+clonal+expansion+during+mouse+heart+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 754(2018).</li>
<li>Lepilina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127 (3), 607-619 (2006).</li>
<li>Wang, J., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reservoir+of+Mature+Cavity+Macrophages+that+Can+Rapidly+Invade+Visceral+Organs+to+Affect+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair.</a> Cell. 165 (3), 668-678 (2016).</li>
<li>Vieira, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+lymphatic+system+stimulates+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Kardiomyozyten und Nicht-Myozytenpopulationen sind ein entscheidender Faktor dafür, ob das Herz nach verletzungen fibrosis oder repariert wird. Es wurden Entdeckungen gemacht, die zeigen, dass eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Nerven14, Epikardialzellen24, Peritonealmakrophagen25, Arteriole12,13und lymphatische Endothelzellen26</...

Das Herz gilt seit langem als ein post-mitotisches Organ, aber neuere Beweise zeigen, dass Kardiomyozyten-Erneuerung tritt im erwachsenen menschlichen Herzen bei etwa 1% pro Jahr1. Jedoch, Diese niedrigen Raten der Kardiomyozyten Umsatz sind nicht ausreichend, um den massiven Verlust von Gewebe, die nach Verletzungen auftritt wieder aufzufüllen. Ein Herz, das einen Myokardinfarkt erlitten hat, wird etwa eine Milliarde Kardiomyozyten verlieren, die oft als Vorspiel zu Herzinsuffizienz und plötzlichem Herztod dienen2,3. Mit über 26 Millionen Menschen, die weltweit von Herzinsuffizienz betroffen sind, besteht ein unerfüllter Bedarf an Therapeutika, die die durch Herzerkrankungen verursachten Schäden umkehren können4.
Um diese Lücke in der Therapeutik zu überbrücken, haben Wissenschaftler begonnen, evolutionär konservierte Mechanismen zu untersuchen, die der endogene Regeneration nach Verletzungen zugrunde liegen. Ein Modell zur Untersuchung der Herzregeneration von Säugetieren ist die Neonatalmaus. In der Woche nach der Geburt haben neonatale Mäuse eine robuste regenerative Reaktion nach Herzschäden5. Wir haben bereits gezeigt, dass neonatale Mäuse ihr Herz durch Kardiomyozytenproliferation nach einer apikalen Resektionregenerierenkönnen 5 . Obwohl diese Technik die Herzregeneration bei den Neonaten hervorrufen kann, fehlt es der Operation an klinischer Relevanz für menschliche Herzverletzungen. Um eine menschliche Verletzung im neonatalen Mausmodell nachzuahmen, haben wir eine Technik entwickelt, um einen Myokardinfarkt durch einen koronaren Arterienverschluss6zu induzieren. Diese Technik erfordert eine chirurgische Ligation der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD), die für die Abgabe von 40%–50% des Blutes an das linksventrikuläre Myokard6,7verantwortlich ist. So führt die Operation zu einem Infarkt, der einen erheblichen Teil der linken ventrikulären Wand trifft. Diese Schädigung des Myokards stimuliert die Kardiomyozytenproliferation und Herzregeneration bei Neonaten5.
Die koronare Arterienverschlusschirurgie bietet eine hochreproduzierbare und direkt translationale Methode, um das Innenleben der Herzregeneration aufzudecken. Die neonatale Chirurgie parallel koronare Arterien-Atherosklerose im menschlichen Herzen, wo Ansammlung von Plaque in den inneren Wänden der Arterien kann eine Okklusion und nachfolgenden Myokardinfarktverursachen 8. Aufgrund einer Lücke in der therapeutischen Behandlung von Herzinsuffizienz-Patienten ist ein Okklusion im LAD mit Sterblichkeitsraten verbunden, die innerhalb eines Jahres nach der Verletzung9bis zu 26% erreichen, und wurde daher als "Witwenmacher" bezeichnet. Fortschritte in der Therapeutik erfordern ein Modell, das die komplexen physiologischen und pathologischen Auswirkungen von Herzverletzungen genau widerspiegelt. Unser chirurgisches Protokoll für neonatale Mausherzverletzungen bietet eine Plattform, die es Forschern ermöglicht, die molekularen und zellulären Hinweise zu untersuchen, die die Herzregeneration von Säugetieren nach einer Verletzung signalisieren.
Jüngste Forschungen zeigen die dynamische Beziehung zwischen der extrazellulären Umgebung und sich ausbreitenden Kardiomyozyten. Beispielsweise kann das postnatale regenerative Fenster erweitert werden, indem die Steifigkeit der extrazellulären Matrix um das Herz10verringert wird. Biomaterialien aus der neonatalen extrazellulären Matrix können auch die Herzregeneration in erwachsenen Säugetierherzen nach einer Herzverletzung fördern11. Auch die begleitende Proliferation von Kardiomyozyten ist eine angiogene Reaktion12,13; Kollateralarterienbildung, die nur für das regenerierende Herz der Neonatalmaus einzigartig ist, erwies sich als wesentlich für die Stimulierung der Herzregeneration12. Darüber hinaus hat unser Labor gezeigt, dass die Nervensignalisierung die Proliferation der Kardiomyozyten und die Herzregeneration durch Modulation der Wachstumsfaktorspiegel sowie die Entzündungsreaktion nach Derverletzung14reguliert. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, nicht-Myozyten-Zellpopulationen als Reaktion auf Herzverletzungen zu verfolgen. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir das Cre-lox-Rekombinationssystem in transgenen Mäuselinien genutzt, um die konstitutive oder bedingte Expression fluoreszierender Reporterproteine für die Linienverfolgung zu integrieren. Darüber hinaus können wir fortschrittliche Methoden verwenden, um die klonale Expansionsmusterung mit der Regenbogen-Mauslinie zu bestimmen, die auf der stochastischen Expression der cre-abhängigen, mehrfarbigen fluoreszierenden Reporter beruht, um die klonale Expansion von Zielzellpopulationen zu bestimmen15. Die Verwendung von Linienverfolgung enden mit der neonatalen koronaren Arterienverschlusschirurgie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die komplizierten zellulären Mechanismen der Herzregeneration zu sezieren.
Die Verfolgung der Abstammung fluoreszierend markierter Zellen mit dreidimensionaler (3D) Ganzkörperbildgebung ist mit der traditionellen Schnitt- und Rekonstruktionstechnik schwer zu erreichen – insbesondere dann, wenn Zellpopulationen zerbrechlich sind, wie Nervenfasern oder Blutgefäße. Während eine direkte Ganzkörperbildgebung des Organs durch optische Steilerstellung oberflächliche Zellpopulationen erfassen kann, bleiben Strukturen, die tief im Gewebe liegen, unzugänglich. Um diese Barrieren zu umgehen, wurden Geweberäumtechniken entwickelt, um die Opazität ganzer Organgewebe zu reduzieren. In jüngster Zeit wurden signifikante Fortschritte bei Clear Lipid-ausgetauschten Acrylamid-hybridisierten Rigid Imaging-kompatiblen Tissue hYdrogel (CLARITY)-basierten Methoden gemacht, die festes Gewebe über die Lipidextraktion16ablöschen. Es werden auch Schritte unternommen, um den Brechungsindex zu homogenisieren und anschließend die Lichtstreuung während der Bildgebung zu reduzieren17. Eine solche Methode ist die aktive CLARITY, die die Lipidzersetzung durch Elektrophorese beschleunigt, um das Waschmittel im gesamten Gewebe zu durchdringen18. Obwohl diese Geweberäummethode wirksam ist, erfordert sie teure Geräte und kann Gewebeschäden verursachen, wodurch der Ansatz mit empfindlichen Zellpopulationen wie den Herznerven 19 unvereinbarist. So verwenden wir den passiven CLARITY-Ansatz, der auf Wärme angewiesen ist, um das Eindringen von Reinigungsmitteln sanft zu erleichtern und so bei der Retention komplizierter Zellstrukturen zu helfen20,21.
Passive CLARITY wird in der Regel als weniger effizient als aktive CLARITY18, da die Technik wird oft von zwei Haupthindernissen begleitet: die Unfähigkeit, die gesamte Organtiefe zu löschen und die große Menge an Zeit benötigt, um erwachsene Gewebe zu löschen. Unser passiver CLARITY-Ansatz überwindet diese beiden Barrieren mit einem beschleunigten Clearing-Prozess, der in der Lage ist, neonatales und erwachsenes Herzgewebe vollständig zu beseitigen. Unsere passive CLARITY Gewebeclearing-Technik hat eine Effizienz erreicht, die die Visualisierung einer Vielzahl von Herzzellpopulationen ermöglicht, einschließlich seltener Populationen, die im erwachsenen Herzen verteilt sind. Wenn das gelöschte Herz mit konfokaler Mikroskopie abgebildet wird, kann die Architektur der zellspezifischen Musterung während der Entwicklung, Krankheit und Regeneration beleuchtet werden.

<table><tbody><tr><td>1-Thioglycerol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 Prolene Nähte</td><td>Ethicon</td><td>8889H</td><td>Polypropylen Nähte</td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>Excelta</td><td>16-050-146</td><td>Halb gebogen, gezahnt, 4 Zoll</td></tr><tr><td>Verbandzange</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-39</td><td>Präparieren, 4,5-Zoll-Glasfläschchen</td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-26A</td><td>12 x 35 mm Fläschchen mit Kappe</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Dichtegradient mittel</td></tr><tr><td>Iridektomie-Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>2 mm Schneide</td></tr><tr><td>Große Präparierschere</td><td>Fisherbrand</td><td>08-951-20</td><td>Gerade, 6 Zoll</td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Fisherbrand</td><td>08-966</td><td>Mayo-Hegar, 6 Zoll</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Phosphat-Puffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scharfe Pinzette</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z168777</td><td>feine Spitze, gerade, 4,25 Zoll</td></tr><tr><td>kleine Präparierschere</td><td>Walter Stern Inc</td><td>25870-002</td><td>30 mm Schneide</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecyl Sulfat (SDS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebezange</td><td>Excelta</td><td>16050133</td><td>mittleres Gewebe, 1X2 Zähne</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals</td><td></td><td>Wasserlöslicher Azoinitiator</td></tr></tbody></table>

erfassung der herzverletzungsreaktion von gezielten zellpopulationen über cleared heart three-dimensional imaging

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Herz-Kreislauf-Erkrankungen übertreffen alle anderen Todesursachen und sind für unglaubliche 31 % der Todesfälle weltweit verantwortlich. Diese Krankheit manifestiert sich bei Herzverletzungen, in erster Linie in Form eines akuten Myokardinfarkts. Mit wenig Resilienz nach Verletzungen wird das einst gesunde Herzgewebe durch faseriges, nicht kontraktiles Narbengewebe ersetzt und ist oft ein Vorspiel zu Herzinsuffizienz. Um neue Behandlungsmöglichkeiten in der regenerativen Medizin zu identifizieren, konzentrierte sich die Forschung auf Wirbeltiere mit angeborenen regenerativen Fähigkeiten. Ein solcher Modellorganismus ist die Neonatalmaus, die auf Herzverletzungen mit robuster Myokardregeneration reagiert. Um eine Verletzung bei der neonatalen Maus zu induzieren, die klinisch relevant ist, haben wir eine Operation entwickelt, um die linke vordere absteigende Arterie (LAD) zu verdecken, die einen Myokardinfarkt widerspiegelt, der durch Arteriosklerose im menschlichen Herzen ausgelöst wird. In Verbindung mit der Technologie, um Veränderungen sowohl innerhalb von Kardiomyozyten als auch innerhalb von Nicht-Myozytenpopulationen zu verfolgen, bietet uns dieses Modell eine Plattform, um die Mechanismen zu identifizieren, die die Herzregeneration leiten. Einblicke in Veränderungen der Herzzellpopulationen nach Verletzungen stützten sich einst stark auf Methoden wie Gewebeschnitt und histologische Untersuchung, die sich auf zweidimensionale Analysen beschränken und dabei oft das Gewebe schädigen. Darüber hinaus ist es diesen Methoden nicht in der Lage, Veränderungen in Zelllinien nachzuverfolgen, anstatt lediglich eine Momentaufnahme der Verletzungsreaktion bereitzustellen. Hier beschreiben wir, wie technologisch fortschrittliche Methoden in Linienverfolgungsmodellen, ganzer Organreinigung und dreidimensionaler (3D) Vollmontagemikroskopie eingesetzt werden können, um Mechanismen der Herzreparatur aufzuklären. Mit unserem Protokoll für die Operation an Myokardinfarktoperationen der Neonatalen Maus, die Gewebereinigung und die 3D-Gesamteorganbildgebung können die komplexen Wege, die die Kardiomyozytenproliferation induzieren, entwirrt werden, was neue therapeutische Ziele für die Herzregeneration enthüllt.

Oft führen die beiden anspruchsvollsten Schritte das Herz aus der Brusthöhle und ligan den LAD. Um diese Schritte zu beheben, können Anpassungen bei der Platzierung der anfänglichen Punktion zwischen den vierten interkostalen Muskeln vorgenommen werden; Wenn die Punktion und die stumpfe Sezierung zu nah am Brustbein sind, kann das Herz die Brusthöhle möglicherweise nicht verlassen (Abbildung 1A).
Zusätzlich kann ein erhöhter Druck auf den linken B...

Die Proliferation von Cardiomyozyten nach einer Verletzung ist ein dynamischer Prozess, der eine Symphonie extrazellulärer Hinweise aus Nicht-Myozyten-Zellpopulationen erfordert. Mit Lineage-Tracing, passiven CLARITY und dreidimensionalen konfokalen Mikroskopie-Techniken mit ganzer Montage können wir den Einfluss einer Vielzahl von Zelltypen auf die Herzreparatur und -regeneration analysieren.

Erfassung der Herzverletzungsreaktion von gezielten Zellpopulationen über cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Die endogene Herzregeneration ist ein dynamischer Prozess, bei dem mehrere Zelltypen gemeinsam zusammenarbeiten, um eine robuste regenerative Reaktion zu ermöglichen. Ein Blick in das regenerierende Gewebe mittels 3D-Bildgebung des gelöschten Herzens als Reaktion auf Verletzungen kann bei der Rekonstruktion der zellulären Dynamik helfen, die diese kardiale regenerative Reaktion leiten. Unser Protokoll wurde speziell entwickelt, um Zellen während der Entwicklung und Regeneration zu verfolgen.Wir sehen keine Einschränkungen bei der allgemeinen Anwendung unserer Räum-, Färbe- und Bildgebungstechniken auf andere Organtypen vor. Für LAD-induzierte koronare Arterienverschluss, sterilisieren Sie zuerst den chirurgischen Bereich eines anästhesierten eintägigen neonatalen Welpen mit antiseptischer Lösung. Machen Sie einen queren Hautschnitt im Brustbereich.Um die Haut vom Muskel zu trennen, verwenden Sie ein Paar Anziehzange, um die Haut vorsichtig zu heben, während Sie die Schere vorsichtig gegen die Interkostalmuskulatur in einer geschlossenen Position drücken. Suchen Sie den vierten interkostalen Raum und verwenden Sie kleine Zangen, um eine kleine oberflächliche Punktion zu machen, die darauf achtet, die inneren Organe zu vermeiden. Mit stumpfer Sezierung und den Ankleidezangen, erweitern Sie den Bereich zwischen den interkostalen Muskeln, bis ein Finger auf die linke Seite des Bauches aufgetragen werden kann, während sie den interkostalen Raum mit Ankleidezangen offen halten, um das Herz sanft aus der Brusthöhle zu führen.Sobald das Herz extrahiert wurde, lassen Sie das Herz auf den interkostalen Muskeln ruhen und lokalisieren Sie die LAD als die Region des Herzens mit weniger gepoolten Blut. Um einen Myokardinfarkt auszulösen, verwenden Sie eine 6-0 Naht, um einen quadratischen Knoten zweimal fest um das Gefäß zu binden, ohne die Arterie zu trennen. Das Blancnieren an der Spitze sollte sofort beobachtet werden.Es ist wichtig, bei der Nahtplatzierung entlang des LAD für eine ähnliche Infarktgröße konsistent zu bleiben. Dies wird am besten durch den schnellen Zugriff auf das Herz erreicht, während das Blut noch durch die Arterien fließt. Wenn die Naht platziert wurde, lassen Sie das Herz wieder in die Brusthöhle rutschen.Befestigen Sie die Rippen zusammen mit einem Chirurgen und einem quadratischen Knoten mit stumpfer Zange, um den oberen Satz von Rippen zu heben, während Sie eine 6-0 Naht durch den oberen und unteren Satz von Rippen passieren. Tragen Sie ein kleines Volumen von Hautkleber auf den Oberbauch auf und verwenden Sie feine Zangen, um die Haut des Unterbauchs über dem exponierten Brustbereich zu positionieren. Dann legen Sie den Welpen auf ein Heizkissen und führen Sie die Ligation auf das nächste Tier.Wenn alle Operationen durchgeführt wurden, kehren Sie die warmen und mobilen Welpen in den Hauskäfig der Mutter zurück. Für passive Klarheit des geernteten Herzgewebes, 21 Tage nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, legen Sie die Maus auf einen sauberen chirurgischen Bereich in der Supine-Position und sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Mit Tissue-Zangen, greifen Sie das Fell direkt unter dem xiphoiden Prozess und machen einen Schnitt über die Breite des Brustkorbs.Schneiden Sie neben den distalen Teilen des Brustkorbs und verwenden Sie die Zange, um den xiphoiden Prozess zu heben, um das Zwerchfell freizulegen. Lösen Sie das Zwerchfell mit gekrümmten Zangen und ziehen Sie das Gewebe kranially, bis das schlagende Herz zugänglich ist. Verwenden Sie die gekrümmten Zangen, um das Herz an der Basis zu greifen und verwenden Sie Iridectomie Schere, um die Aorta und überlegene Vena cava zu schneiden.Legen Sie das schlagende Herz in eine Petrischale aus PBS, so dass das Herz jedes zurückgehaltene Blut auspumpt. Der Myokardinfarkt kann durch eine korrekte anatomische Platzierung der LAD-Ligation bestätigt werden. Wenn das Herz aufhört zu schlagen, drücken Sie das Organ vorsichtig mit Zangen, um das Restblut zu vertreiben und übertragen Sie die Probe in eine Einweg-Glasschale Mitglas-Flasche mit zwei MilliliterPBS.Legen Sie die Durchstechflasche mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Shaker und wechseln Sie die PBS-Lösung alle 10 Minuten, bis die Lösung blutfrei bleibt. Wenn die PBS klar ist, ersetzen Sie die PBS durch zwei Milliliter kaltes 4%Paraformaldehyd für eine vierstündige Inkubation bei Raumtemperatur, gefolgt von drei 10-minütigen Wäschen am Shaker mit zwei Millilitern frischer PBS pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche die Durchstechflasche mit zwei Millilitern 4%Acrylamid füllen, ergänzt mit 0,5%VA-044 Lösung für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag die Durchstechflasche in einem 37 Grad Celsius Hitzeblock für drei Stunden platzieren. Am Ende der Polymerisation das Herz in eine neue Glasschalen-Fläschchen geben und das Herzgewebe in zwei Millilitern frischer PBS 10 Minuten gleichzeitig waschen und die PBS am Ende jeder Inkubation erfrischen. Wenn die PBS klar ist, ersetzen Sie den Waschpuffer durch zwei Milliliter Clearinglösung.Bebrüte die Probe mehrere Wochen bei 37 Grad Celsius, bis das Herz klar ist, und erfrischen Sie die Klärlösung alle zwei bis drei Tage. Wenn das Organ klar ist, waschen Sie die Probe mit PBS auf dem Shaker, wie gezeigt, bevor Sie die Durchstechflasche mit frischem PBS für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius nachfüllen. Ersetzen Sie am nächsten Tag die PBS durch RIMS für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius.Am Ende der Inkubation wird das Gewebe vollständig gerodet. Das Gewebe sollte nach einigen Wochen transparent werden. Zur Abbildung des gelöschten postnatalen Mausherzes nach der Induktion des Myokardinfarkts, füllen Sie die Hälfte einer Kammer einer maßgeschneiderten Depressionsrutsche mit PBS und verwenden Sie gekrümmte Zangen, um das gereinigte Herz vorsichtig in die Kammer zu übertragen.Füllen Sie das restliche Volumen der Kammer mit PBS. Füllen Sie dann die Kammer mit PBS, bis die Oberfläche der Flüssigkeit eine Kuppel über der Oberseite der Kammer bildet und montieren Sie den Abdeckungsschlitten, bevor Sie das Gewebe durch konfokale Mikroskopie nach Standard-Bildgebungsprotokollen bebildert. Wenn die Punktion und stumpfe Sezierung zu nah am Brustbein sind, kann das Herz die Brusthöhle möglicherweise nicht verlassen.Wenn das Herz den Hohlraum nicht leicht verlässt, druckn Sie den linken Bauch, um den Prozess zu erleichtern. Komplikationen können auftreten, wenn das Herz auf den interkostalen Muskeln ruht. Daher ist es wichtig, die stumpfe Sezierung in einer horizontalen Ausrichtung auf eine minimale Größe zu halten, um eine klare Visualisierung und Zugänglichkeit des LAD zu ermöglichen.Beachten Sie, dass eine oberflächliche Ligation in der letzten Nahtplatzierung weniger Anpassungsspielraum hat und dass die Nahtbindung um den LAD mit kontrollierten stetigen Bewegungen durchgeführt werden sollte. Am Ende des Clearing-Schritts sollte das ganze Herz konsequent undurchsichtig und ohne Verfärbungen in der Mitte sein. Nach ein paar Tagen in RIMS-Lösung bei Raumtemperatur sollte das Herz vollständig gelöscht werden und eine gewisse Gewebeausdehnung kann beobachtet werden.Wie die Proteinexpression des tdTomato-Reporters beobachtet, sind die Herznerven hauptsächlich oberflächlich, wobei einige Populationen in der Epikardialschicht leben. Wichtig ist, dass die Bestätigung der Proteinexpression des Reporters nach dem gezeigten Klarheitsprotokoll erhalten bleibt. Das Clearing und die Bildgebung des 3D-Herzens bieten eine Perspektive in die Lage und Morphologie von Herzzellpopulationen.Dies ermöglicht es uns, neue Aspekte in der Zellmusterung und Zell-Zell-Interaktionen zu identifizieren.

capturing-cardiac-injury-response-targeted-cell-populations-via

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Adult Herzmuskelzellen sind primäre Zellen, die aus tierischen Herzen isoliert und kultiviert für mehrere Tage. Innerhalb dieses Zeitraums Kultur adenoviralen Gentransfer können verwendet werden, um genetisch kodierte Biosensoren (GEBS) oder fluoreszierende Fusionsproteine ​​zu exprimieren. Beide Ansätze erlauben zellulären Untersuchungen mittels der konfokalen Mikroskopie.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Wir beschreiben ein Protokoll zur volumetrischen Abbildung von fluoreszierenden Protein-markierten Zellen tief in intakten embryonalen und postnatalen Herzen. Durch die Verwendung von Gewebereinigungsmethoden in Kombination mit der Whole-Mount-Färbung können einzelne fluoreszierende Protein-markierte Zellen in einem embryonalen oder postnatalen Herzen klar und genau abgebildet werden.

Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren für den 3D-Vergleich von ganzem Herzen Herzmuskelgewebe mit MRI. Dies ist für die genaue Beurteilung der intramyokardialer Injektionen in der Infarktrandzone eines chronischen Schweinemodell eines Myokardinfarkts entworfen.

3D Whole-Herz Myocardial Gewebeanalyse

Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) Technik kombiniert mit optischen Ausgleich der murine Herz zu studieren.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende Methodik zur Erzeugung von 3D-selbstorganisierten kardialen Mikrogewebe-Arrays, die aus vordifferenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen bestehen. Diese benutzerfreundliche und zellarme Technik zur Erzeugung kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und frühe Stadien der Arzneimittelentwicklung implementiert werden.

Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen

Eine verfeinerte Methode der Gewebereinigung wurde entwickelt und auf das erwachsene Mausherz angewendet. Diese Methode wurde entwickelt, um dichtes, autofluoreszierendes Herzgewebe zu beseitigen und gleichzeitig die markierte Fibroblastenfluoreszenz aufrechtzuerhalten, die einer genetischen Reporterstrategie zugeschrieben wird.

Verfeinerte CLARITY-basierte Gewebereinigung für die dreidimensionale Fibroblastenorganisation in gesunden und verletzten Mäuseherzen

Wir berichten über eine Methode zur mesoskopischen Rekonstruktion des gesamten Mausherzens durch die Kombination neuer Fortschritte in der Gewebetransformation und Färbung mit der Entwicklung eines axial gescannten Lichtblattmikroskops.

Mesoskopische optische Bildgebung des ganzen Mausherzens

Das Protokoll nutzt fortschrittliche Lichtblattmikroskopie zusammen mit angepassten Gewebereinigungsmethoden, um komplizierte kardiale Strukturen in Nagetierherzen zu untersuchen, was ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Die dreidimensionale (3D) Rekonstruktion von Herzschäden bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt (repAMI) ermöglicht eine getreue Quantifizierung und Co-Lokalisierung von assoziierten krankheitsbeeinflussenden Mustern. Hier wird ein automatisierbarer, lichtblattgeführter Bildgebungsansatz für die gleichzeitige Messung von Herzschäden, Risikobereichen und Immunzellantworten bereitgestellt.

Simultane 3D-Analyse von Herzschädigung und Immunantwort bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Der aktuelle 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Test führt ein verfeinertes TTC-Färbungsprotokoll ein, das die Analyse der Myokardinschäden mit mikroskopischer Auflösung ermöglicht und hochwertige Bilder erzeugt, die eine genaue und zuverlässige Bewertung der Infarktgröße und der Lebensfähigkeit der Kardiomyozyten auf zellulärer Ebene ermöglichen.

Ein mikroskopischer 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Test für eine genaue und zuverlässige Analyse der Myokardinverletzung

Erfahren Sie die dreidimensionale Bildgebung geclearter Herzen zur Analyse zellulärer Dynamiken nach Herzinjektion. Diese Methode mit passivem CLARITY ermöglicht die Verfolgung von Zellpopulationen während der kardialen Regeneration.

Erfassung der Herzverletzungsreaktion von gezielten Zellpopulationen über cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Weitere Videos entdecken