Name: Steuerung der Durchflussgeschwindigkeiten von Mikrotubuli-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten mithilfe der Temperatur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Lernen Sie die Steuerung von Fließgeschwindigkeiten in 3D-aktiven Fluiden durch Temperaturmanipulation. Diese Methode ermöglicht die dynamische Regulierung ohne Modifikation des Fluids oder des Mikroskops.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Plasmid K401-BCCP-H6 war ein Geschenk von Dr. Zvonimir Dogic. Diese Forschung wurde vom Start-up-Fonds von Dr. Kun-Ta Wu im Worcester Polytechnic Institute unterstützt. Wir danken Dr. Zvonimir Dogic für die Protokolle zur Reinigung und Kennzeichnung von Tubulin und zur Synthese von Aktivenflüssigkeiten. Wir danken Dr. Marc Ridilla für seine Expertise in der Proteinexpression und -reinigung. Wir danken Dr. William Benjamin Roger für die Unterstützung beim Bau der temperaturgeregelten Bühne. Wir würdigen Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) für die Nutzung der Biological Materials Facility (BMF). Wir würdigen die Royal Society of Chemistry für die Anpassung der Figuren von Bate et al. auf Soft Matter33.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Kontrolle der aktiven Materie vor Ort öffnet die Tür zur gerichteten Selbstorganisation der aktiven Materie4,5,24,28,54. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll zur Verwendung von Temperatur zur Steuerung von kinesingetriebenen, MT-basierten Aktivenflüssigkeiten vor Ort vor, basierend auf der Arrhenius-Kennlinie des Systems29<su...

Aktive Materie unterscheidet sich von konventioneller Passivmaterie aufgrund ihrer Fähigkeit, chemische Energie in mechanische Arbeit umzuwandeln. Ein Material, das eine solche Fähigkeit besitzt, kann aus lebenden oder nicht lebenden Wesen wie Bakterien, Insekten, Kolloiden, Körnern und Zytoskelettfilamenten1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Diese materiellen Entitäten interagieren mit ihren Nachbarn. In größerem Maßstab organisieren sie sich entweder in turbulenten Wirbeln (aktive Turbulenzen) oder Materialflüsse11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Ein Verständnis der Selbstorganisation von aktiver Materie hat zu verschiedenen Anwendungen in molekularen Shuttles, optischen Geräten und paralleler Berechnung21,22,23geführt. Um Anwendungen auf die nächste Stufe zu bringen, bedarf es einer Kontrolle über die Selbstorganisation hinaus. Zum Beispiel entwickelten Palacci et al. ein Hämatit-verkapseltes Kolloid, das nur selbstgetrieben wurde, wenn es manuell kontrolliertem blauem Licht ausgesetzt wurde, was zur Entstehung lebender Kristalle führte24. Morin et al. etablierten die Steuerung der rollenden Quincke-Kolloide durch die Verwendung eines abstimmbaren externen elektrischen Feldes, was zu kolloidalen Beflockungen in einem Rennstrecken-ähnlichen Kanal25führte. Diese früheren Arbeiten zeigen die Rolle der lokalen Kontrolle in Anwendungen und fördern die Wissensbasis der aktiven Materie.
In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Steuerbarkeit von kinesingetriebenen, mikrotubuli (MT)-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten. Die Flüssigkeiten bestehen aus drei Hauptkomponenten: MTs, Kinesin-Molekularmotoren und Depletanten. Die Erschöpfungskräfte induzieren eine Erschöpfungskraft, um die MTs zu bündeln, die später durch Motorcluster überbrückt werden. Diese Motoren laufen entlang der MTsgegenüber des Plus-Ends. Wenn ein Paar überbrückte MTsis antiparallel, die entsprechenden Motoren gehen in entgegengesetzte Richtungen. Die Motoren sind jedoch in einem Cluster gebunden und können nicht auseinandergehen, so dass sie kooperative MT-Paare auseinanderschieben (Interfilament-Gleiten, Abbildung 1A). Diese Gleitdynamik akkumuliert, wodurch sich die MTsto-Bündel bis zum Erreichen ihres Knickinstabilitätspunkts ausdehnen und brechen (Extensile-Bündel, Abbildung 1B)26. Die gebrochenen Bündel werden durch die Erschöpfungskraft geglüht, die sich anschließend wieder ausdehnt, und die Dynamik wiederholt sich. Während des Prozesses der sich wiederholenden Dynamik rühren die Bündelbewegungen die nahe flüssigkeitsnahe und induzierenden Ströme, die durch Doping mit Mikron-Tracern visualisiert werden können (Abbildung 1C). Sanchez et al. und Henkin et al. haben die mittleren Geschwindigkeiten von Tracern charakterisiert und festgestellt, dass die Geschwindigkeiten durch Variation der Konzentrationen von Adenosintriphosphat (ATP), Depletanten, Motorclustern und MTs19,27abstimmbar waren. Eine solche Tunabilität existierte jedoch erst vor der aktiven Flüssigkeitssynthese. Nach der Synthese ging die Tunability verloren und die Flüssigkeiten selbst organisiert auf ihre eigene Weise. Um die aktive Flüssigkeitsaktivität nach der Synthese zu steuern, berichtete Ross.et al. über eine Methode, bei der die lichtaktivierte Dimerisierung von motorischen Proteinen verwendet wurde, so dass die Flüssigkeitsaktivität mit Licht28ein- und ausgeschaltet werden konnte. Während die Lichtsteuerung in Bezug auf die lokale Aktivierung der Flüssigkeiten praktisch ist, erfordert die Methode eine Neugestaltung der Strukturen von motorischen Proteinen sowie die Änderung der optischen Pfade im Mikroskop. Hier bieten wir eine einfach zu bedienende Methode zur lokalen Steuerung von Flüssigkeitsströmen ohne Mikroskopmodifikation unter Beibehaltung der Motorstruktur.
Unsere Methode der lokalen Abstimmung des aktiven Flüssigkeitsflusses basiert auf dem Arrhenius-Gesetz, da die Kinesin-MT-Reaktion mit der Temperatur29,30,31,32zunimmt. Unsere früheren Studien zeigten, dass die Temperaturabhängigkeit der mittleren Geschwindigkeit eines aktiven Flüssigkeitsflusses der Arrhenius-Gleichung folgte: v = A exp(-Ea/RT), wobei A ein präexponentieller Faktor ist, R die Gaskonstante ist, Ea die Aktivierungsenergie und T die Systemtemperatur33. Daher ist die Flüssigkeitsaktivität empfindlich auf die Temperaturumgebung, und die Systemtemperatur muss konsistent sein, um die Motorleistung und damit die Flüssigkeitsdurchflussgeschwindigkeit34zu stabilisieren. In diesem Artikel zeigen wir die Verwendung der Temperaturabhängigkeit des Motors, um die Fließgeschwindigkeiten von aktiven Flüssigkeiten kontinuierlich zu optimieren, indem die Systemtemperatur eingestellt wird. Wir zeigen auch die Herstellung einer aktiven Flüssigkeitsprobe, gefolgt von der Montage der Probe auf einer Mikroskopstufe, deren Temperatur über Computersoftware gesteuert wird. Die Erhöhung der Temperatur von 16 °C auf 36 °C beschleunigt die mittleren Durchflussgeschwindigkeiten von 4 auf 8 m/s. Zusätzlich ist die Tunbarkeit reversibel: Immer wieder erhöht und verringert die Temperatur sequentiell beschleunigt und verlangsamt den Durchfluss. Die demonstrierte Methode ist auf eine Breite von Systemen anwendbar, bei denen die Hauptreaktionen dem Arrhenius-Gesetz gehorchen, wie z. B. der MT-Gleittest29,30,31,32.

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat, 98%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC216550050</td><td></td></tr><tr><td>3,2mm Innendurchmesser Tygon Tubing R-3603</td><td>HACH</td><td>2074038</td><td>Wasserschläuche</td></tr><tr><td>31,75 mm Durchmesser unbeschichtet, Saphirfenster</td><td>Edmund Optics</td><td>43-637</td><td>Saphirscheibe</td></tr><tr><td>3M 1181 Kupferband - 1/2 Zoll Breite x 18 YD Länge - 2,6 MIL Gesamtdicke - 27551</td><td>R.S. HUGHES</td><td>054007-27551</td><td>Kupferband</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamidlösung (40%/Elektrophorese), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1402-1</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin-5'-Triphosphat-Dikaliumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS-Ester (Succinimidylester)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20006</td><td>Hellroter Fluoreszenzfarbstoff. Alexa 647 kann vor dem Mischen mit Mikrotubuli in Dimethylsulfoxid (DMSO) vorsuspendiert werden (1.3.3.2.)</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Zentrifugalfiltereinheit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC801024</td><td>Zentrifugalfilterrohr. Cutoff-Molekulargewicht: 10 kDa</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat, 100 g, MP Biomedicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN802829</td><td>APS</td></tr><tr><td>Ampicillin Natriumsalz (kristallines Pulver), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td>Ampicillin</td></tr><tr><td>Antivibrationstisch</td><td>Nikon</td><td>63-7590S</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-E Zentrifuge</td><td>Beckman Schar</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar Lötmittel, BD Diagnostics</td><td>VWR</td><td>90000-760</td><td>Agar</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Alfa Aesar A14207</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eimer-Kunststoff weiß - 2 Gallonen</td><td>Bon</td><td>84-715</td><td>Wassereimer</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Katalase aus Rinderleber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td><td>Nikon</td><td>MRD00045</td><td>4x Luftobjektiv</td></tr><tr><td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td><td>Nikon</td><td>96372</td><td>GFP Filterwürfel</td></tr><tr><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>TE Technology</td><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>Thermoelektrischer Kühler (TEC)</td></tr><tr><td>Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Kühlblock</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Custom gefrästes Aluminium</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td><td>Bio-Rad</td><td>1610400</td><td>Triphenylmethan-Farbstoff</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (zertifiziert ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, für Biochemie, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165680050</td><td>DTT</td></tr><tr><td>DOWSIL 340 Kühlkörperverbindung</td><td>Dow</td><td>1446622</td><td>Wärmeleitpaste</td></tr><tr><td>ETHYLALKOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON Poly Cube</td><td>Pharmco by Greenfield</td><td>Global 111000200CB05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-TETRAESSIGSÄURE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>EGTA</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Fisher BioReagenzien Mikrobiologie Medien Additive: Trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421</td><td>Trypton</td></tr><tr><td>Fisher BioReagenzien Mikrobiologie Medien Additive: Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td>Hefeextrakt</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Mikrosphären, Kalibriergrad 3,00 & Mikro; m</td><td>Polysciences</td><td>18861</td><td>Tracer-Partikel</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase aus Aspergillus niger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>GpCpp</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td>Guanosin-5'[ (&alpha;,&beta;)-Methyleno]triphosphat (GMPCPP)</td></tr><tr><td>GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 Fuß, 99,9 % verseiltes sauerstofffreies Kupfer OFC, rot/schwarz 2-adriges gebundenes Zip-Kabel Strom-/Lautsprecher-Elektrokabel für Auto, Audio, Heimkino</td><td>Amazon</td><td>B07428NBCW</td><td>Kupferdraht</td></tr><tr><td>Guanosin 5'-Triphosphat-Natriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>GTP</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z805939</td><td>Reinigungsmittel</td></tr><tr><td>HEPES Natriumsalz (weißes Pulver), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP410</td><td>NaHEPES</td></tr><tr><td>Hochleistungs-Mischmaschine</td><td>AIMORES</td><td>AS-UP1250</td><td>Mixer</td></tr><tr><td>His GraviTrap</td><td>GE Healthcare</td><td>11003399</td><td>Schwerkraftsäule</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid</td></tr><tr><td>Isopropylalkohol 99%</td><td>Pharmco by Greenfield Global</td><td></td><td>231000099 Isopropanol</td></tr><tr><td>JA-10 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure Kaliumsalzmonohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>K-Glutamat</td></tr><tr><td>Lysozym aus Hühnereiweiß</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>MgCl2&bull; 6H2O</td></tr><tr><td>MES Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure</td></tr><tr><td>Natriumsalz MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>3-(N-Morpholino)propansulfonsäure</td></tr><tr><td>MP-3022</td><td>TE Technology</td><td>MP-3022</td><td>Thermoelement</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin 99%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC138450500</td><td>TEMED</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c UV-VIS Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E112352</td><td>Spektrometer</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E Nikon Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>Norland Optischer Klebstoff 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA81</td><td>UV-Kleber</td></tr><tr><td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC5800</td><td>Protein Standard</td></tr> Leiter<tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,5 mm, 10-well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Gel Optima L-90K Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm PM996 Wrap, 4" breit; 125 Ft/Rolle</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06720-40</td><td>Wachsfilm</td></tr><tr><td>Pe 300 ultra Beleuchtungssystem Single Band, 3mm Lichtleitersteuerung Pod Netzteil</td><td>Nikon</td><td>PE-300-UT-L-SB-40</td><td>Cooler LED-Strahler</td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Phosphoenolpyruvinsäure Monokaliumsalz, 99%</td><td>BeanTown Chemisches</td><td>129745</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Proteaseinhibitor Mini-Tabletten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32953</td><td></td></tr><tr><td>ROHRE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td>1,4-Piperazindiethansulfonsäure</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300</td><td>PEG. Durchschnittliches Molekulargewicht 20.000 Da</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>KOH</td></tr><tr><td>PowerEase 300W Netzteil (115 VAC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PS0300</td><td>DC Netzteil der Gelbox</td></tr><tr><td>PS-12-8.4A</td><td>TE Technology</td><td>PS-12-8.4A</td><td>DC Netzteil des Temperaturreglers</td></tr><tr><td>Pyruvat-Kinase/Milchsäuredehydrogenase-Enzyme aus Kaninchenmuskeln</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0294</td><td>PK/LDH</td></tr><tr><td>Quiet One Lifegard Springbrunnenpumpe, 296 Gallonen pro Stunde</td><td>Amazon</td><td>B005JWA612</td><td>Aquarienpumpe</td></tr><tr><td>Rosetta 2(DE3)pLysS Kompetente Zellen - Novagen</td><td>Millipore Sigma</td><td>71403</td><td>Kompetente Zellen</td></tr><tr><td>Sharp Mikrowelle ZSMC0912BS Sharp 900W Arbeitsplatten-Mikrowellenherd, 0,9 Kubikfuß, Edelstahl</td><td>Amazon</td><td>B01MT6JZMR</td><td>Mikrowelle zum Kochen von Wasser</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (kristallin/ACS-zertifiziert), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>Streptavidin Protein</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21122</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>TC-720</td><td>TE Technology</td><td>TC-720</td><td>Temperaturregler</td></tr><tr><td>Tris Base, Molekularbiologie - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648310</td><td>Tris-HCL</td></tr><tr><td>Typ 45 Ti Rotor</td><td>Beckman Schar</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Typ 70 Ti Rotor</td><td>Beckman Schar</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>Typ 70.1 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>VWR Allzweck-Labor-Beschriftungsband</td><td>VWR</td><td>89097-916</td><td>Papierbänder</td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Gläser, quadratisch, Nr. 1 1/2</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>Glasdeckgläser</td></tr><tr><td>VWR Plain und Frosted Micro Dias, Premium</td><td>VWR</td><td>75799-268</td><td>Glasdias</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Gelbox</td></tr><tr><td>ZYLA 5.5 USB3.0 Kamera</td><td>Nikon</td><td>ZYLA5.5-USB3</td><td>Monochrome CCD-Kamera</td></tr></tbody></table>

steuerung der durchflussgeschwindigkeiten von mikrotubuli-basierten 3d-aktivflüssigkeiten mithilfe der temperatur

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

Wir stellen eine Methode zur Temperaturoptimierung der Fließgeschwindigkeiten von kinesingetriebenen, mikrotubulienbasierten dreidimensionalen (3D) aktiven Flüssigkeiten vor. Diese Methode ermöglicht es, die Geschwindigkeiten vor Ort zu optimieren, ohne dass neue Proben hergestellt werden müssen, um unterschiedliche gewünschte Geschwindigkeiten zu erreichen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die dynamische Steuerung der Geschwindigkeit. Durch das Radfahren der Temperatur fließen die Flüssigkeiten in regelmäßigen Abständen schnell und langsam. Diese Steuerbarkeit basiert auf der Arrhenius-Eigenschaft der Kinesin-Mikrotubuli-Reaktion, die einen kontrollierten mittleren Durchflussgeschwindigkeitsbereich von 4–8 m/s demonstriert. Die vorgestellte Methode öffnet die Tür zum Design mikrofluidischer Geräte, bei denen die Durchflussraten im Kanal lokal abstimmbar sind, ohne dass ein Ventil erforderlich ist.

Die Vorbereitung der kinesingetriebenen, MT-basierten Aktivenflüssigkeiten erfordert sowohl Kinesin als auch MTs. Die MTs wurden aus markierten Tubulinen (Schritte 1.3 und 1.4) polymerisiert, die von Rinderhirnen gereinigt wurden (Schritt 1.1, Abbildung 2A), gefolgt von Recycling zur Verbesserung der Reinheit (Schritt 1.2, Abbildung 2B). Die Kinesin-Motorproteine wurden in E. coli exprimiert und gereinigt (Schritte 2.1 ...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Temperatur zu verwenden, um die Fließgeschwindigkeiten dreidimensionaler aktiver Flüssigkeiten zu steuern. Der Vorteil dieser Methode ermöglicht nicht nur die Regelung der Durchflussgeschwindigkeiten vor Ort, sondern auch eine dynamische Steuerung, wie z. B. die regelmäßige Abstimmung der Durchflussgeschwindigkeiten nach oben und unten.

Steuerung der Durchflussgeschwindigkeiten von Mikrotubuli-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten mithilfe der Temperatur

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Aktive Materie wurde in verschiedenen Anwendungen wie molekularen Schatten verwendet. Um die Anwendung auf die nächste Stufe zu bringen, müssen wir die Fähigkeit entwickeln, die aktive Materie lokal zu kontrollieren. Wir bieten eine einfach zu bedienende Methode, die keine Änderung der aktiven Flüssigkeit erfordert.Auch nicht die Notwendigkeit, den optischen Pfad des Mikroskops zu ändern, um die lokale Kontrolle der aktiven Flüssigkeit zu erreichen. Unsere Methode kann auf eine Breite von Systemen angewendet werden, bei denen die Hauptreaktionen dem falschen Gesetz folgen, wie z. B. dem Mikrotubuli-Gleittest oder enzymbasierten Systemen. Bei der Einrichtung handelt es sich um ein Wasserkreislaufsystem.Wenn Lecks auftreten, kann Wasser das Mikroskop beschädigen. Daher ist es vor der Annahme unseres Protokolls wichtig, sicherzustellen, dass das System undicht ist. Unser Protokoll erfordert die Montage der Glasprobe auf einer Temperaturstufe.Während das Manuskript das Montageverfahren beschreibt, fehlt es ihm an mechanischen Feinheiten wie der Sicherung der Probe auf der Bühne. Die Demonstration des Verfahrens werden Teagan Bate, Edward Jarvis und Megan Varney sein. Teagan und Edward sind Doktoranden, und Megan ist Studentin eines Labors.Zur Herstellung von Aktivenflüssigkeiten in einem Eppendorfer Röhrchen mischen Sie 16 Punkt sieben Mikroliter mit acht Milligramm pro Milliliter Mikrotubuli mit sechs Punkt sieben Mikroliter neines Punkt simoligen Kinesin-Motorcluster und einem Punkt einen Mikroliter 500 Millimolar DTT in hochsalzigen M2B. Bündeln Sie Mikrotubuli, indem Sie 11 Punkt vier Mikroliter mit sieben Gewichtsgewicht Polyethylenglykol hinzufügen. Aktivieren Sie dann Kinesinmotoren, indem Sie zwei Punkt-Acht-Mikroliter von 50 Millimolar ATP hinzufügen.Halten Sie die ATP-Konzentrationen aufrecht, indem Sie zwei Punkt-Acht-Mikroliter Pyruvatkinase/Laktat-Dehydrogenase hinzufügen und 13 Punkt drei Mikroliter 200 Millimolarphosphenolpyruvat. Reduzieren Sie den Photobleicheffekt, indem Sie 10 Mikroliter 20 Millimolar Trolox, einen Punkt ein Mikroliter von drei Punkt fünf Milligramm pro Milliliter Katalase, einen Punkt ein Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Glukoseoxidase und einen Punkt ein Mikroliter 300 Milligramm pro Milliliter Glukose hinzufügen. Verfolgen Sie die Bewegung der Flüssigkeit, indem Sie einen Punkt sechs Mikroliter Nullpunkt Null zwei fünf Prozent Volumen pro Volumen Tracer Partikel hinzufügen.Fügen Sie Hochsalz-M2B hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern zu erreichen. Als nächstes spülen Sie einen polyacrylamidbeschichteten Glasschlitten und decken Sie einen Gleit mit DI-Wasser ab. Trocknen Sie die Gläser mit Druckluft.Legen Sie die Gläser auf eine saubere, flache Oberfläche. Schneiden Sie einen drei Millimeter breiten Kanal in die Wachsfolie. Die Gesamtbreite ist die gleiche Breite wie die Glasabdeckung rutschen bei 20 Millimetern.Legen Sie das Wachs zwischen den Schlitten und den Deckelschlupf ein, um einen Durchflusszellkanal für Flüssigkeit zu bilden. Das Glas an der Wachsfolie anbringen, indem Sie den Glaswachskomplex auf eine 80 Grad Celsius heiße Platte legen, um das Wachs zu schmelzen. Während des Schmelzens den Deckel vorsichtig mit einer Pipettenspitze schieben, um den Wachsfilm gleichmäßig an den Glasoberflächen zu befestigen.Nach der Haftung den Glaskomplex auf Raumtemperatur abkühlen. Die vorbereiteten Aktivflüssigkeiten mit der Pipettenspitze in einem Winkel von der Kanalöffnung und in Kontakt mit der Glasschiebefläche in den Strömungskanal laden. Versiegeln Sie den Kanal mit UV-Kleber.Legen Sie nach dem Aufbau einer Temperaturregelung die aktive Flüssigkeitsprobe auf die Saphiroberfläche, wobei die Schiebeseite die Oberfläche ankortiert. Sichern Sie die Glasfolie mit Papierband. Befestigen Sie den ThermoSensor mit Kupferband an der Deckbelegoberfläche.Um das Setup auf einer Mikroskopbühne zu montieren, mit dem Deckel-Rutschen in Richtung der Ziele, sichern Sie das Setup mit Mikroskop-Bühnennadelklemmen. Schalten Sie den Temperaturregler und die Fischtankpumpe ein. Folgen Sie der Herstelleranleitung, um die Zieltemperatur festzulegen.Aktivieren Sie die Temperaturregelung. Und zeichnen Sie ThermoSensor-Temperaturdaten auf. Stellen Sie die Probe mit einem konstanten Zeitintervall auf einer fluoreszierenden Mikroskopie dar, die mit einem GFP-Filterwürfel ausgestattet ist, um die Alexa 488-markierten Tracerpartikel im aktiven Mix zu überwachen.Passen Sie das Zeitintervall an, damit die Tracerverschiebung zwischen Frames innerhalb von neun Pixeln liegen kann. Für bildgebende Tracer, die sich mit 10 Mikrometern pro Sekunde bewegen und ein vierfaches Ziel verwenden, wird empfohlen, das Zeitintervall ein bis fünf Sekunden zu betragen. Speichern Sie die Bilder als TIF-Dateien, benennen Sie die Dateien basierend auf der Framenummer, und speichern Sie sie in einem separaten Ordner.Für diese kinesingetriebenen Mikrotubuli-basierten Aktivenflüssigkeiten wurde die Temperatur bei 10, 20, 30 und 40 Grad Celsius gesteuert. Die Temperaturschwankungen lagen vier Stunden lang innerhalb von Nullpunkt eins bis null Punkt drei Grad Celsius und zeigten die Stabilität und Zuverlässigkeit dieses Temperaturregelungs-Setups. Die Tracer wurden alle zwei Sekunden abgebildet, was die sequenziellen Bilder zur Verfolgung von Tracer-Trajektorien ermöglichten.Die mittleren Geschwindigkeiten, die bei 20 bis 36 Grad Celsius gemessen wurden, schienen bei null bis zwei Stunden nahezu zeitunabhängig zu sein. Bei 10 und 40 Grad Celsius verfielen die mittleren Geschwindigkeiten schnell, verursacht durch Mikrotubuli-Depolymerisation unter 16 Grad Celsius und die Kinesin-Cluster über 36 Grad Celsius. Wenn sich die Systemtemperaturen alle 30 Minuten zwischen 20 und 30 Grad Celsius abwechselten, beschleunigten und verlangsamten sich die mittleren Geschwindigkeiten der aktiven Flüssigkeiten nicht nur entsprechend, sondern reagierten auch auf den Temperaturwechsel innerhalb von 10 Sekunden.Aktive Flüssigkeiten beginnen zu fehlamwerden, wenn sie unter 16 abgekühlt oder über 36 Grad erhitzt werden. Stellen Sie also beim Bearbeiten des Temperaturreglers sicher, dass die Temperatur zwischen 16 und 36 Grad liegt. Die Fähigkeit, aktive Flüssigkeit lokal zu optimieren, ermöglicht die Steuerung der Fluidleistung, wie z. B. die Lieferung von Ladungen von Punkt A nach Punkt B oder die Entwicklung eines Mikrofluiditätsgeräts, das kein physikalisches Ventil erfordert.Das Acrylamid, das zur Beschichtung von Glaswaren verwendet wird, ist ein Neurotoxin, das durch die Haut absorbieren kann. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstungwie Handschuhe, Labormäntel und Schutzbrillen, um das Risiko zu minimieren.

controlling-flow-speeds-microtubule-based-3d-active-fluids-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

In diesem Video beschreiben wir die Technik der Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM), um Mikrotubuli zu visualisieren, die auf einer Deckglasoberfläche in Gegenwart eines geeigneten Puffers wachsen. Bei Beleuchtung mit einfallendem Licht reflektieren die Deckglas-Puffer-Grenzfläche und die Puffer-Mikrotubuli-Grenzfläche Licht, das sich zu einem Interferenzmuster verbindet, das die Visualisierung von Mikrotubuli als kontrastreiche Bilder vor einem hellen Hintergrund ermöglicht.

Interferenzreflexionsmikroskopie zur markierungsfreien Visualisierung der Mikrotubuli-Dynamik

Der Aufbau und die Positionierung der mitotischen Spindel hängen von den kombinierten Kräften ab, die durch die Dynamik der Mikrotubuli, Motorproteine und Vernetzer erzeugt werden. Im Folgenden stellen wir unsere neu entwickelten Methoden vor, bei denen der geometrische Einschluss von sphärischen Emulsionströpfchen für die Bottom-up-Rekonstitution basischer mitotischer Spindeln genutzt wird.

Rekonstitution von Grund Mitosespindeln in Sphärische Emulsionströpfchen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine druckgeregelte Spritzenpumpe in mikrofluidischen Anwendungen verwendet werden zu konstruieren. Diese Spritzenpumpe besteht aus ein Additiv hergestellte Körper Standardhardware und OpenSource-Elektronik. Das resultierende System ist preiswert, einfach zu bauen, und liefert gut regulierte Flüssigkeitsströmung um schnelle mikrofluidischen Forschung zu ermöglichen.

Dreidimensionaler Druck von thermoplastischen Materialien erstellen automatisiert Spritzenpumpen mit Feedback-Kontrolle für mikrofluidische Anwendungen

Dieses Protokoll ist eine Anleitung zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie auf einem Standardfluoreszenzmikroskop für etikettenfreie, kontrastreiche Hochgeschwindigkeitsaufnahmen von Mikrotubuli mit In-vitro-Oberflächen-Assays.

Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie für etikettenfreie High-Speed-Bildgebung von Mikrotubuli

Wir stellen ein Protokoll zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie und der Total-Interreflexions-Fluoreszenzmikroskopie für die gleichzeitige Abbildung von dynamischen Mikrotubuli und fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli-assoziierten Proteinen vor.

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Diese Studie beschreibt die Reinigung von KIF1A (1-393LZ), einem Mitglied der Kinesin-3-Familie, unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Expressionssystems. Die In-vitro-Einzelmolekül - und Multimotor-Gleitanalyse dieser gereinigten Motoren zeigte robuste Motilitätseigenschaften, die mit Motoren aus Säugetierzelllysat vergleichbar sind. Somit ist das Sf9-Baculovirus-System in der Lage, Motorprotein von Interesse zu exprimieren und zu reinigen.

Einzelmolekülanalyse von Sf9-gereinigten superprozessiven Motoren der Kinesin-3-Familie

Wir präsentieren Protokolle für einfache mikrofluidische Aktinfilament-Assays in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie, die es ermöglichen, einzelne Aktinfilamente in Echtzeit genau zu überwachen und sie nacheinander verschiedenen Proteinlösungen auszusetzen.

Verwendung von Mikrofluidik und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Montagedynamik von einzelnen Actin-Filamenten und -Bündeln

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Bildung von Mikrotubuli-Baugruppen in Form von Tactoiden unter Verwendung von MAP65, einem pflanzlichen Mikrotubuli-Vernetzer, und PEG als Crowding-Agent vor.

Selbstorganisation von Mikrotubuli-Taktoiden

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Kristallisation von mikroskopisch kleinen Eiskristallen und Clathrathydraten in mikrofluidischen Geräten, die einen Flüssigkeitsaustausch um die gebildeten Kristalle ermöglichen. Dies bietet beispiellose Möglichkeiten, den Kristallisationsprozess und die Bindungsmechanismen der Inhibitoren zu untersuchen.

Ein mikrofluidischer Ansatz zur Untersuchung der Eis- und Clathrathydratkristallisation

Hier werden Verfahren zur Herstellung aktiver Nematika aus Mikrotubuli und Kinesinmotoren vorgestellt, einschließlich Proteinpräparation und -aufbau sowie der Verwendung von Vertiefungen für den aktiven nematischen Einschluss.

Formen, Einschließen und Beobachten von Mikrotubuli-basierten aktiven Nematiken

Dieses Protokoll beschreibt das Design und die Herstellung eines mikrofluidischen Geräts, das für die Untersuchung der Mikrotubuli-Polymermechanik geeignet ist. Die Synthese von Mikrofabrikation, automatisierter Flusskontrolle und computergestützten Modellierungstechniken ermöglicht ein flexibles System, das sich ideal für die Untersuchung des zellulären Zytoskeletts in vitro eignet.

Entwicklung eines mikrofluidikbasierten Ansatzes zur Untersuchung der Mikrotubuli-Polymermechanik

Lernen Sie die Steuerung von Fließgeschwindigkeiten in 3D-aktiven Fluiden durch Temperaturmanipulation. Diese Methode ermöglicht die dynamische Regulierung ohne Modifikation des Fluids oder des Mikroskops.

Steuerung der Durchflussgeschwindigkeiten von Mikrotubuli-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten mithilfe der Temperatur

Weitere Videos entdecken