Steuerung der Durchflussgeschwindigkeiten von Mikrotubuli-basierten 3D-Aktivflüssigkeiten mithilfe der Temperatur

Aktive Materie wurde in verschiedenen Anwendungen wie molekularen Schatten verwendet. Um die Anwendung auf die nächste Stufe zu bringen, müssen wir die Fähigkeit entwickeln, die aktive Materie lokal zu kontrollieren. Wir bieten eine einfach zu bedienende Methode, die keine Änderung der aktiven Flüssigkeit erfordert.

Auch nicht die Notwendigkeit, den optischen Pfad des Mikroskops zu ändern, um die lokale Kontrolle der aktiven Flüssigkeit zu erreichen. Unsere Methode kann auf eine Breite von Systemen angewendet werden, bei denen die Hauptreaktionen dem falschen Gesetz folgen, wie z. B. dem Mikrotubuli-Gleittest oder enzymbasierten Systemen. Bei der Einrichtung handelt es sich um ein Wasserkreislaufsystem.

Wenn Lecks auftreten, kann Wasser das Mikroskop beschädigen. Daher ist es vor der Annahme unseres Protokolls wichtig, sicherzustellen, dass das System undicht ist. Unser Protokoll erfordert die Montage der Glasprobe auf einer Temperaturstufe.

Während das Manuskript das Montageverfahren beschreibt, fehlt es ihm an mechanischen Feinheiten wie der Sicherung der Probe auf der Bühne. Die Demonstration des Verfahrens werden Teagan Bate, Edward Jarvis und Megan Varney sein. Teagan und Edward sind Doktoranden, und Megan ist Studentin eines Labors.

Zur Herstellung von Aktivenflüssigkeiten in einem Eppendorfer Röhrchen mischen Sie 16 Punkt sieben Mikroliter mit acht Milligramm pro Milliliter Mikrotubuli mit sechs Punkt sieben Mikroliter neines Punkt simoligen Kinesin-Motorcluster und einem Punkt einen Mikroliter 500 Millimolar DTT in hochsalzigen M2B. Bündeln Sie Mikrotubuli, indem Sie 11 Punkt vier Mikroliter mit sieben Gewichtsgewicht Polyethylenglykol hinzufügen. Aktivieren Sie dann Kinesinmotoren, indem Sie zwei Punkt-Acht-Mikroliter von 50 Millimolar ATP hinzufügen.

Halten Sie die ATP-Konzentrationen aufrecht, indem Sie zwei Punkt-Acht-Mikroliter Pyruvatkinase/Laktat-Dehydrogenase hinzufügen und 13 Punkt drei Mikroliter 200 Millimolarphosphenolpyruvat. Reduzieren Sie den Photobleicheffekt, indem Sie 10 Mikroliter 20 Millimolar Trolox, einen Punkt ein Mikroliter von drei Punkt fünf Milligramm pro Milliliter Katalase, einen Punkt ein Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Glukoseoxidase und einen Punkt ein Mikroliter 300 Milligramm pro Milliliter Glukose hinzufügen. Verfolgen Sie die Bewegung der Flüssigkeit, indem Sie einen Punkt sechs Mikroliter Nullpunkt Null zwei fünf Prozent Volumen pro Volumen Tracer Partikel hinzufügen.

Fügen Sie Hochsalz-M2B hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern zu erreichen. Als nächstes spülen Sie einen polyacrylamidbeschichteten Glasschlitten und decken Sie einen Gleit mit DI-Wasser ab. Trocknen Sie die Gläser mit Druckluft.

Legen Sie die Gläser auf eine saubere, flache Oberfläche. Schneiden Sie einen drei Millimeter breiten Kanal in die Wachsfolie. Die Gesamtbreite ist die gleiche Breite wie die Glasabdeckung rutschen bei 20 Millimetern.

Legen Sie das Wachs zwischen den Schlitten und den Deckelschlupf ein, um einen Durchflusszellkanal für Flüssigkeit zu bilden. Das Glas an der Wachsfolie anbringen, indem Sie den Glaswachskomplex auf eine 80 Grad Celsius heiße Platte legen, um das Wachs zu schmelzen. Während des Schmelzens den Deckel vorsichtig mit einer Pipettenspitze schieben, um den Wachsfilm gleichmäßig an den Glasoberflächen zu befestigen.

Nach der Haftung den Glaskomplex auf Raumtemperatur abkühlen. Die vorbereiteten Aktivflüssigkeiten mit der Pipettenspitze in einem Winkel von der Kanalöffnung und in Kontakt mit der Glasschiebefläche in den Strömungskanal laden. Versiegeln Sie den Kanal mit UV-Kleber.

Legen Sie nach dem Aufbau einer Temperaturregelung die aktive Flüssigkeitsprobe auf die Saphiroberfläche, wobei die Schiebeseite die Oberfläche ankortiert. Sichern Sie die Glasfolie mit Papierband. Befestigen Sie den ThermoSensor mit Kupferband an der Deckbelegoberfläche.

Um das Setup auf einer Mikroskopbühne zu montieren, mit dem Deckel-Rutschen in Richtung der Ziele, sichern Sie das Setup mit Mikroskop-Bühnennadelklemmen. Schalten Sie den Temperaturregler und die Fischtankpumpe ein. Folgen Sie der Herstelleranleitung, um die Zieltemperatur festzulegen.

Aktivieren Sie die Temperaturregelung. Und zeichnen Sie ThermoSensor-Temperaturdaten auf. Stellen Sie die Probe mit einem konstanten Zeitintervall auf einer fluoreszierenden Mikroskopie dar, die mit einem GFP-Filterwürfel ausgestattet ist, um die Alexa 488-markierten Tracerpartikel im aktiven Mix zu überwachen.

Passen Sie das Zeitintervall an, damit die Tracerverschiebung zwischen Frames innerhalb von neun Pixeln liegen kann. Für bildgebende Tracer, die sich mit 10 Mikrometern pro Sekunde bewegen und ein vierfaches Ziel verwenden, wird empfohlen, das Zeitintervall ein bis fünf Sekunden zu betragen. Speichern Sie die Bilder als TIF-Dateien, benennen Sie die Dateien basierend auf der Framenummer, und speichern Sie sie in einem separaten Ordner.

Für diese kinesingetriebenen Mikrotubuli-basierten Aktivenflüssigkeiten wurde die Temperatur bei 10, 20, 30 und 40 Grad Celsius gesteuert. Die Temperaturschwankungen lagen vier Stunden lang innerhalb von Nullpunkt eins bis null Punkt drei Grad Celsius und zeigten die Stabilität und Zuverlässigkeit dieses Temperaturregelungs-Setups. Die Tracer wurden alle zwei Sekunden abgebildet, was die sequenziellen Bilder zur Verfolgung von Tracer-Trajektorien ermöglichten.

Die mittleren Geschwindigkeiten, die bei 20 bis 36 Grad Celsius gemessen wurden, schienen bei null bis zwei Stunden nahezu zeitunabhängig zu sein. Bei 10 und 40 Grad Celsius verfielen die mittleren Geschwindigkeiten schnell, verursacht durch Mikrotubuli-Depolymerisation unter 16 Grad Celsius und die Kinesin-Cluster über 36 Grad Celsius. Wenn sich die Systemtemperaturen alle 30 Minuten zwischen 20 und 30 Grad Celsius abwechselten, beschleunigten und verlangsamten sich die mittleren Geschwindigkeiten der aktiven Flüssigkeiten nicht nur entsprechend, sondern reagierten auch auf den Temperaturwechsel innerhalb von 10 Sekunden.

Aktive Flüssigkeiten beginnen zu fehlamwerden, wenn sie unter 16 abgekühlt oder über 36 Grad erhitzt werden. Stellen Sie also beim Bearbeiten des Temperaturreglers sicher, dass die Temperatur zwischen 16 und 36 Grad liegt. Die Fähigkeit, aktive Flüssigkeit lokal zu optimieren, ermöglicht die Steuerung der Fluidleistung, wie z. B. die Lieferung von Ladungen von Punkt A nach Punkt B oder die Entwicklung eines Mikrofluiditätsgeräts, das kein physikalisches Ventil erfordert.

Das Acrylamid, das zur Beschichtung von Glaswaren verwendet wird, ist ein Neurotoxin, das durch die Haut absorbieren kann. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstungwie Handschuhe, Labormäntel und Schutzbrillen, um das Risiko zu minimieren.