Identifizierung von Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit Hefetoxizität und Suppressor-Screens gezielt werden
25. Oktober 2019
Bakterielle Krankheitserreger sezernieren Proteine in den Wirt, die auf entscheidende biologische Prozesse abzielen. Die Identifizierung der Wirtswege, auf die bakterielle Effektorproteine abzielen, ist der Schlüssel zur Bekämpfung der molekularen Pathogenese. Hier wird eine Methode beschrieben, bei der ein modifizierter Hefesuppressor und ein Toxizitäts-Bildschirm verwendet werden, um Wirtswege aufzuklären, die von toxischen bakteriellen Effektorproteinen angegriffen werden.
Intrazelluläre Bakterien sezernieren Effektorproteine in den Wirt, die biologische Wege manipulieren können, um das Überleben von Krankheitserregern zu fördern. Das Aufdecken von Wirtszielen von Effektoren ist für das Verständnis intrazellulärer Krankheitserreger wie Chlamydia trachomatis unerlässlich. Hefetoxizität und Suppressor-Bildschirme können wichtige Erkenntnisse über das natürliche biologische Ziel von bakteriellen Effektorproteinen liefern und können besonders nützlich sein, wenn ein Bindungspartner unbekannt ist.
Wir zeigen die Hefetoxizität und Suppressor-Assays hier für das Screening auf Chlamydia trachomatis Effektorproteine, aber diese Technik wurde auch für die Charakterisierung von Legionella pneumophila und Coxiella burnetii Effektoren verwendet. Beginnen Sie mit der Impfung von fünf Millilitern einzelner Aussetzerbrühe mit der einzigen Hefekolonie, die mit dem mit Plasmid haltigen Effektorprotein transformiert wird. Verwenden Sie Hefe, die mit dem Vektor allein als Negativkontrolle transformiert wurde, und inkubieren Sie das Inokulum über Nacht bei 30 Grad Celsius beim Schütteln.
Am nächsten Tag 180 Mikroliter steriles Wasser in die A2-Brunnen einer 96-Well-Platte geben. Wirbel nieren Sie die Nachtkultur und fügen Sie 180 Mikroliter Hefe zu gut A1 hinzu. Dann die Hefe in den Brunnen mit Wasser verdünnen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipetten, um fünf Mikroliter jeder Verdünnung auf einzelne Aussetzerglukose und einzelne Aussetzer-Galaktose-Agarplatten zu erkennen und die Platten 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius zu bebrüten.
Bewerten Sie nach der Inkubation die Toxizität visuell, indem Sie das Wachstum von Hefe, das das effektor-Protein ausdrückt, das auf den Galaktose-haltigen Medien angebaut wird, mit dem Wachstum von Hefe vergleichen, die den Vektor allein ausdrückt. 100 Milliliter der einzelnen Aussetzerbrühe mit einem Milliliter des zuvor vorbereiteten Hefebestandes impfen und 16 bis 24 Stunden bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 150 U/min bebrüten. Am nächsten Tag die gesamten 100 Milliliter der Nachtkultur auf 900 Milliliter vorgewärmter Einzelbrühe hinzufügen und den Kolben vier bis fünf Stunden bei 30 Grad Celsius beim Schütteln bebrüten.
Nach der Inkubation pellet die Kultur bei 6.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 250 Milliliter sterilem Wasser wieder auf. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand.
Dann das Pellet in 250 Millilitern eines Millimolaren-Lithiumacetats wieder aufsetzen. Pellet die Kultur durch Zentrifugation, entfernen Sie das Lithiumacetat, und setzen Sie das Pellet in 9,6 Milliliter von 50%PEG 3350. Fügen Sie dann Transformationsreagenzien hinzu, wie im Manuskript beschrieben, und passen Sie das Volumen auf 15 Milliliter an, wobei steriles Wasser sanft invertieren wird, um es zu mischen.
Inkubieren Sie die Mischung bei 30 Grad Celsius für 30 Minuten. Dann 750 Mikroliter DMSO hinzufügen und in einem Wasserbad bei 42 Grad Celsius für weitere 30 Minuten brüten. Das Hinzufügen des DMSO vor einem Hitzeschock ist entscheidend, um eine hohe Transformationseffizienz zu erreichen.
Nach der Inkubation die Hefe durch Zentrifugieren bei 3.000 mal g für fünf Minuten pellet. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 10 Milliliter sterilem Wasser, dann wiederholen Sie die Zentrifugation, um die Hefe zu pellet. Das Pellet in acht Milliliter Wasser wieder aufhängen.
Bestimmen Sie die Transformationseffizienz, indem Sie die Probe eins bis zehn verdünnen und 100 Mikroliter jeder Verdünnung auf einen doppelten Aussetzeragar plattieren. Dann 200 Mikroliter der Probe auf doppelten Aussetzer-Galactose-Agarplatten verbuchen und die Platten 48 bis 96 Stunden bei 30 Grad Celsius bebrüten oder bis Kolonien auftauchen. Sobald Kolonien erschienen sind, patchen Sie sie auf doppel ausgelassengalactose Agar und bebrüten sie für weitere 24 bis 48 Stunden.
Verwenden Sie einen Teil des Pflasters, um fünf Milliliter doppeler Aussetzerbrühe zu impfen und das Inokulum über Nacht bei 26 Grad Celsius mit Schütteln bei 150 U/min zu bebrüten. Am nächsten Tag 180 Mikroliter steriles Wasser in fünf Brunnen einer 96-Well-Platte geben, beginnend mit gut A2. Wirbel nen den Nächtlichen Kulturmix. Fügen Sie 180 Mikroliter Hefe gut A1 hinzu und verdünnen Sie sie seriell mit dem Wasser in den Brunnen A2 bis A6. Entdecken Sie fünf Mikroliter jeder Verdünnung auf einzelnen Drop-out-Glukose und einzelne Drop-out-Galactose-Agar-Platten, die sicherstellen, dass der toxische Effektor allein als Kontrolle enthalten ist.
Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für 48 Stunden und vergleichen Sie dann das Wachstum der Hefe mit toxischem Effektor allein mit dem Wachstum von Hefe mit dem potentiellen Suppressor. Um Suppressoren zu bestätigen, die eine verminderte Toxizität im Vergleich zum toxischen Effektor allein nachgewiesen haben, isolieren Sie das Plasmid nach Manuskriptanweisungen und wandeln Es wieder in die giftige Hefe um. Entleeren Sie doppelte Drop-out-Glukosebrühe mit einer Kolonie aus der Transformationsplatte.
Inkubieren Sie es über Nacht und Punkt auf doppelten Drop-out-Glukose und Galaktose-Agar, um die Unterdrückung der Toxizität zu bestätigen. Vor der Durchführung des Hefe-Suppressor-Bildschirms wurden die Effektorproteine von Interesse auf Toxizität in Hefe getestet. Das Protein von Interesse wurde in Hefe unter der Kontrolle eines Galactose induzierbaren Promotors ausgedrückt und das Wachstum auf Galaktose wurde mit dem Wachstum auf Glukose verglichen.
Als CT229 auf Toxizität getestet wurde, wurden kleinere Kolonien und Wachstumsunterdrückung beobachtet. Idealerweise sollte eine Zwei- bis Drei-Log-Abnahme beobachtet werden, um mit Hefe-Suppressor-Bildschirmen fortzufahren. Der Suppressor-Bildschirm wurde durchgeführt, indem der toxische Stamm mit der Hefe-Genombibliothek pYAP 13 transformiert und die Transformanten auf Galaktose-Agar plattiert wurden.
Die erhaltenen Suppressor-Klone wurden auf doppelausgelassenen Galactose-Agarn gesichtet, um die Unterdrückung der Toxizität zu bestätigen. Die Unterdrücker pSup1 und pSup2 unterdrückten die Toxizität des Effektorproteins, während pSup3 dies nicht tat. Diese Verfahren erfordern sorgfältige Liebe zum Detail zusätzlich zu den kritischen Vorarbeiten, einschließlich der Vorbereitung großer Mengen an Medien und Platten, die vor der Durchführung des Experiments bereitstehen.
Sobald Unterdrücker identifiziert sind, können Experimente durchgeführt werden, um Wechselwirkungen mit dem Effektor des Interesses zu überprüfen, einschließlich Pull downs, Immunfluoreszenzkolokalisierung, Effektor Knockout oder Knockdown von Host-Faktoren in den Bildschirmen identifiziert. Die Entwicklung dieser Technik für Chlamydien-Effektoren hat eine beschleunigte vorläufige Charakterisierung von Effektorproteinen ermöglicht und dazu beigetragen, unsere Bemühungen auf die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu konzentrieren, die Wirtspathogen-Wechselwirkungen vermitteln.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung von Wirts-Signalwegen, die durch toxische bakterielle Effektorproteine angegriffen werden, unter Verwendung von Hefe-Toxizitäts- und Unterdrücker-Screenings. Das Verständnis dieser Interaktionen ist entscheidend für die Bewältigung der molekularen Pathogenese bei intrazellulären Bakterien wie Chlamydia trachomatis.
Hauptkomponenten der Studie
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Pathogen-Wirt-Interaktionen
- Zellbiologie
Hintergrund
- Bakteriellen Krankheitserreger sezernieren Effektorproteine, die biologische Signalwege des Wirts manipulieren.
- Die Identifizierung dieser Signalwege ist wesentlich für das Verständnis von Krankheiten, die durch intrazelluläre Bakterien verursacht werden.
- Hefemodelle können verwendet werden, um die Auswirkungen dieser Effektorproteine zu untersuchen.
- Diese Methode wurde auf verschiedene Krankheitserreger angewendet, einschließlich Chlamydia trachomatis.
Zweck der Studie
- Um Wirts-Signalwege zu klären, die von toxischen bakteriellen Effektorproteinen angegriffen werden.
- Um Einblicke in die molekularen Mechanismen der Pathogenese zu geben.
- Um den Nutzen von Hefe-Toxizitäts- und Unterdrücker-Screenings in diesem Forschungsbereich zu demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Impfung von Hefe, die mit Effektorprotein-Plasmiden transformiert wurde.
- Verwendung von negativen Kontrollen mit Hefe, die nur mit dem Vektor transformiert wurde.
- Inkubation der Kulturen bei 30 Grad Celsius unter Schütteln.
- Analyse des Hefewachstums und der Toxizität zur Identifizierung von Effektorprotein-Interaktionen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung von Wirts-Signalwegen, die von Chlamydia trachomatis Effektorproteinen beeinflusst werden.
- Demonstration der Wirksamkeit von Hefe-Screenings bei der Untersuchung bakterieller Effektoren.
- Einblicke in die biologischen Ziele verschiedener bakterieller Krankheitserreger.
- Potenzielle Anwendungen dieser Methode für andere intrazelluläre Bakterien.
Schlussfolgerungen
- Hefe-Toxizitäts- und Unterdrücker-Screenings sind wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung bakterieller Effektorproteine.
- Dieser Ansatz verbessert das Verständnis von Pathogen-Wirt-Interaktionen.
- Weitere Forschung unter Verwendung dieser Methode könnte zu neuen therapeutischen Strategien gegen bakterielle Infektionen führen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Identifying host pathways manipulated by bacterial effector proteins is critical for de-risking target validation in anti-infective discovery. Yeast toxicity and suppressor screens provide a functional, phenotype-driven approach to pinpoint dysregulated host biology when traditional binding assays fail. This enables mechanistic insight into pathogen virulence factors, supporting early-stage target confidence and portfolio prioritization for intracellular pathogens.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking effector toxicity to specific host pathways through suppressor identification.
- Operational Value: Enables functional target validation when effector proteins lack detectable binding partners or interact with multifunctional host proteins.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing pathway-level perturbations rather than isolated protein interactions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated yeast strains expressing effector proteins for reproducible toxicity screening.
- Quantitative Output: Measures growth defect magnitude (e.g., two- to three-log reduction) as a threshold for proceeding to suppressor screens.
- Scalability: Uses 96-well formats and serial dilution spotting for high-throughput suppressor clone evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applies to intracellular pathogens like Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila, and Coxiella burnetii, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Identifies host factors that, when suppressed, rescue effector toxicity, enabling follow-up validation via pull-downs, colocalization, or knockout studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses efforts on effectors with confirmed pathway modulation, reducing late-stage biological attrition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to inform lead identification by connecting effector expression to host pathway disruption, enabling data-driven target selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking effector expression to growth defects in yeast, indicating pathway interference.
- Screening: Delivers assay-ready toxic strains and suppressor libraries for identifying host factors that rescue phenotype.
- Analytics: Provides quantitative growth readouts on selective media to compare effector toxicity and suppressor efficacy.
- Translational Research: Connects yeast-identified suppressors to mammalian homologs for preclinical validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening effector libraries across multiple intracellular pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through functional pathway interrogation.
- Operational Value: Standardized toxicity and suppressor screening workflows with defined growth thresholds.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by filtering effectors lacking measurable host pathway impact.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of effector targets based on validated pathway modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast molecular cloning, galactose-inducible expression, and plasmid library transformation.
- Dependent on instrumentation for sterile culture handling, centrifugation, and incubation at 30°C with shaking.
- Necessitates cross-team standardization of media preparation, plate spotting, and toxicity scoring criteria.
- Adaptation considerations include promoter compatibility, effector toxicity thresholds, and suppressor validation in mammalian systems.
- Practical limitations include the need for large volumes of media and plates, and potential false negatives if effector expression is toxic to yeast library strains.
