Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung
28. Mai 2020
Hier wird ein Protokoll zur Ganzmontage-IN-situ-RNA-Hybridisierungsanalyse in Zebrafischen und Rohrbildungs-Assay in patientenabgeleiteten induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Endothelzellen vorgestellt, um die Rolle von Endoglin bei der Gefäßbildung zu untersuchen.
Die Vollmontage, In-situ-Hybridisierung, WISH, bietet eine hohe Auflösung und ein niedriges Hintergrundergebnis im Vergleich zu herkömmlichen Methoden. Außerdem verbessern U-Diaplatten den Fokus bei gleicher Brennweite, indem weniger WISH auf Mausembryonen, Drosophila-Embryonen und anderes schwer zu handhabendes Gewebe angewendet werden kann. Der Rohrbildungstest kann auf Stammzelldifferenzierte Androgenzellen angewendet werden.
WISH macht es leicht, die funktionale Bedeutung der Mutationskorrektur zu verstehen. Die Person, die das Verfahren demonstrieren wird, ist Yong Wang, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor. Verwenden Sie das FemtoJet-System, um zwei Nanogramm Morpholinos und 500 Piktogramme MRNA in einzellige Embryonen zu injizieren.
Üben Sie die Mikroinjektion von Morpholinos viele Male, bis Sie es erfolgreich in die Zellen injizieren und die Integrität der Eier zu halten. Inkubieren Sie die Zygoten, bis sie dechorioniert sind und den Entwicklungsstand erreichen, der dem beabsichtigten Experiment entspricht. Wie in Tabelle 1 des Manuskripts beschrieben.
Als nächstes verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um 20 bis 40 Embryonen in ein 1,5-Milliliter-Rohr zu übertragen. Fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitete 4%PFA Lösung bei Raumtemperatur hinzu. Nach der Fixierung, dem Waschen und Derhydrieren der Embryonen, wie im Manuskript beschrieben, legen Sie die Embryonen in ein Sieb mit Nylongewebe am Boden.
Hydratisieren Sie die Embryonen, indem Sie sie jeweils fünf Minuten lang in 75%50% und 25%methanol sukzessive waschen. Nach dem Waschen der Embryonen mit PBST 50 Mikroliter Proteinase K mit den Embryonen in die Röhre geben. Nach der Verdauung die Proteinase K entfernen und die Embryonen dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBST waschen.
Fügen Sie 50 bis 100 Mikroliter gemischter Zielsonden mit den Embryonen in jedes Rohr. Die Embryonen über Nacht bei 40 Grad Celsius bebrüten. Nach dem Waschen der Embryonen, wie im Manuskript beschrieben, verwenden Sie 4%Paraformaldehyd, um die Embryonen für 30 Minuten bei Raumtemperatur zu fixieren.
Dann waschen Sie die Embryonen in 2x SSCT-Lösung dreimal für 15 Minuten jedes Mal bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die SSCT-Lösung und ersetzen Sie sie durch 50 Mikroliter Amp 1. Dann die Embryonen bei 40 Grad Celsius bebrüten.
Waschen Sie die Embryonen nach 30 Minuten dreimal 15 Minuten bei Raumtemperatur in 2x SSCT-Lösung. Entfernen Sie die SSCT-Lösung und fügen Sie 50 Mikroliter Amp 2 hinzu. Nach der Inkubation für 15 Minuten und waschen Sie den Embryo wie zuvor getan, fügen Sie 50 Mikroliter Von Amp 3 und tippen Sie auf das Rohr sanft.
Inkubieren Sie die Embryonen bei 40 Grad Celsius. Nach 30 Minuten die Embryonen wie zuvor beschrieben waschen. Dann 50 Mikroliter Amp 4 tropfenweise hinzufügen und vorsichtig auf die Röhre tippen.
Dann die Embryonen bei 40 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren und dreimal mit SSCT waschen. Nachdem Sie die Embryonen für die Bildgebung vorbereitet haben, wie im Manuskript beschrieben, verwenden Sie ein DAB-Peroxidase-Substrat-Kit, um die Probe zu färben. Fügen Sie je 50 Mikroliter der Farbreagenzien A, B und C zu einem Milliliter destilliertem Wasser hinzu.
Und gut mischen, um eine komplette DAB-Arbeitsflüssigkeit zu erhalten. Fügen Sie die Flüssigkeit in die Probe und decken Sie für zehn Minuten. Nachdem Sie die Proben gründlich gewaschen haben, verwenden Sie ein optisches Mikroskop, um sie abzubilden.
Um mit der Kultivierung und Steuerung von HHT iPSCs zu beginnen, fügen Sie die Kellermembranmatrix zu sechs Bohrkörperkulturplatten hinzu, um den Boden der Brunnen zu bedecken. Die Teller eine Stunde bei 37 Grad Celsius bebrüten. Als nächstes entfernen Sie die verwendete Kellermembran-Matrixlösung aus den Brunnen und fügen Sie jeweils zwei Milliliter mTeSR 1 Medium in jeden Brunnen ein.
Dann platte die iPSCs aus dem letzten Durchgang etwa ein mal zehn bis sechs Zellen pro Brunnen geerntet. Nach der Kultivierung der iPSCs für ca. vier Tage, tauschen Sie das Zellkulturmedium mit ergänztem BEL-Medium aus. Wachsen Sie die Zellen für drei Tage, um Mesodermzellen zu erzeugen.
Um vaskuläre Endothelzellen zu erweitern, ersetzen Sie das Medium vier Tage lang durch ein zusätzliches BEL-Medium. Und dann behandeln Sie die Zellen mit dem gleichen Medium und Kultur für weitere drei bis vier Tage. Reinigen Sie die reifen vaskulären Endothelzellen mit CD31 Dynabeads gemäß Kit-Anleitung.
Dann sammeln Sie die CD31-positiven Zellen durch Elutionspuffer. Pflege und Erweiterung der gereinigten Endothelzellen in EC-SFM-Medium, das VEGF165, bFGF und FBS enthält. Um die Endothelzellen zu verkleben, beginnen Sie mit der Zugabe von 10 Mikroliter Nalginmembranmatrix pro Brunnen zu den Angiogeneseplatten.
Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Ernten Sie die Endothelzellen und setzen Sie sie im endotheliaalen Wachstumsmedium 2 durch wiederholtes Pipetieren wieder aus. Fügen Sie 50 Mikroliter dieser Zellsuspension in jeder Bohrung in die erstarrte Matrix und inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 Grad Celsius.
Nach drei bis fünf Stunden Inkubation verwenden Sie ein hochauflösendes Mikroskop, um die Bildung von Endothelrohren zu bewerten. Erfassen Sie Bilder von mindestens zehn Bereichen für jede Gruppe. Prüfen Sie die gesamte Rohrlänge, rohrnummer und Zweigpunkte.
CISH und WISH wurden durchgeführt, um die Expression von Endoglin in 24 Stunden Nachbefruchtungsembryonen zu bestimmen. Ein hämogener Endothelmarker und ein endotheliale Vorläufermarker wurden verwendet, um die Wirkung von Endoglin-Silencing zu untersuchen. Die roten Pfeile zeigen Bereiche an, in denen die Expression dieser Marker, aplnrna und npr1a, signifikant abgenommen hat.
Der endotheliale Röhrenbildungstest wurde an der Endoglin-Mutation durchgeführt und kontrollierte iPSC-abgeleitete Endothelzellen. Die Rohrbildung wurde nach drei Stunden bewertet und fotografiert. Rohrlänge, Rohrnummer und Verzweigung wurden mit der ImageJ-Software quantifiziert.
Mutante Endothelzellen bildeten weniger Zweige als die Kontrolle von Endothelzellen. Und die Zweige in mutierten Endothelzellen nahmen nach der Stimulation mit dem vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor signifikant zu. Diese Methode kann auch für die iPS-Generierung aus peripherem Blut verwendet werden.
Und durch die Methode klärt die Rolle der endokrinen in der Vaskulären Bildung in vitro und in vivo. Da sie wissen, dass die Korrektur der Mutation einen Unterschied in der Angiogenese machen kann, ist es möglich, die Zellen wieder in Patienten für eine mögliche Stammzelltherapie zu transplantieren.
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Übersicht
Dieser Artikel präsentiert ein Protokoll für die Whole-Mount-In-Situ-RNA-Hybridisierungsanalyse bei Zebrafischen und einen Röhrchenbildungstest an endothelialen Zellen, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen von Patienten abgeleitet wurden. Die Studie konzentriert sich auf das Verständnis der Rolle von Endoglin bei der Gefäßbildung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Gefäßbiologie
Hintergrund
- Whole-Mount-In-Situ-Hybridisierung (WISH) liefert hochauflösende Ergebnisse.
- WISH kann auf verschiedene Embryonen und schwierige Gewebe angewendet werden.
- Der Röhrchenbildungstest ist nützlich für die Untersuchung der Stammzelldifferenzierung.
- Das Verständnis der Mutationskorrektur wird durch WISH erleichtert.
Zweck der Studie
- Um die Rolle von Endoglin bei der Gefäßbildung zu untersuchen.
- Um die Anwendung von WISH bei Zebrafischen zu demonstrieren.
- Um Röhrchenbildungstests an von Patienten abgeleiteten Zellen einzusetzen.
Verwendete Methoden
- Injektion von Morpholinos und mRNA in Ein-Zell-Embryonen mit dem FemtoJet-System.
- Anwendung von Whole-Mount-In-Situ-Hybridisierungstechniken.
- Röhrchenbildungstests an endothelialen Zellen, die von induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet wurden.
- Mikroskopische Analyse der Ergebnisse.
Hauptergebnisse
- Hochauflösende Bildgebung der RNA-Lokalisierung bei Zebrafischen.
- Erfolgreiche Röhrchenbildung in von Patienten abgeleiteten endothelialen Zellen.
- Erkenntnisse über die funktionellen Auswirkungen von Endoglin in der Gefäßentwicklung.
- Demonstration der Wirksamkeit von WISH in verschiedenen Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Die Studie unterstreicht die Bedeutung von Endoglin bei der Gefäßbildung.
- WISH ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Genexpression in der Entwicklungsbiologie.
- Röhrchenbildungstests können Einblicke in die Stammzelldifferenzierung liefern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of vascular targets by combining in vivo gene expression analysis in zebrafish with in vitro functional validation in patient-derived endothelial cells. It supports target confidence assessment for angiogenic pathways relevant to hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT) and related vascular disorders. The integrated approach enhances predictive confidence in early discovery by linking genetic perturbation to phenotypic outcomes across species and cell models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by linking endoglin knockdown to reduced endothelial progenitor marker expression in zebrafish embryos.
- Operational Value: Enables spatial gene expression analysis with high resolution and low background using amplified WISH and DAB staining.
- Scientific Value: Validates functional role of endoglin in angiogenesis through quantification of tube length, branch points, and network formation in iPSC-ECs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, disease-relevant endothelial cell models from HHT patient iPSCs for compound or genetic screening.
- Operational Value: Establishes reproducible tube formation assay with quantifiable morphometric outputs (tube number, length, branching) using ImageJ analysis.
- Scientific Value: Supports assay standardization across laboratories via defined endothelial maturation and matrix coating steps.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates translational continuity by showing conserved endoglin function in zebrafish embryogenesis and human iPSC-derived endothelial cells.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by confirming phenotype rescue via VEGF stimulation in mutant cells.
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into endoglin’s role in vascular development through dual-model validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, supporting hypothesis-driven progression from genetic hit to functional confirmation in vascular models.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by analyzing endoglin and downstream markers (aplnrna, npr1a) in embryonic vasculature.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized endothelial cell differentiation and tube formation quantification.
- Analytics: Enables comparative condition analysis via quantitative morphometrics (tube length, branch points) and spatial gene expression mapping.
- Translational Research: Connects zebrafish findings to human disease models via iPSC-ECs with HHT-associated endoglin mutations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying angiogenic targets across genetic and pharmacological perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating genetic loss-of-function with vascular phenotypes in two complementary systems.
- Operational Value: Promotes standardization through detailed fixation, hybridization, and amplification steps in WISH and defined endothelial assay timing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing multi-layered validation of target involvement in angiogenesis.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of vascular targets based on cross-species phenotypic conservation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection, and whole-mount hybridization techniques.
- Dependent on access to FemtoJet system, proteinase K, amplification reagents, and DAB substrate kits for WISH.
- Necessitates standardized iPSC differentiation and endothelial purification protocols using CD31 selection and VEGF/bFGF supplementation.
- Involves adaptation considerations when transferring WISH protocols between species or tissue types.
- Limited by the sensitivity of colorimetric detection versus fluorescent alternatives in certain embryonic contexts.
