Quantifizierung von proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden

Dieses Protokoll ist nützlich für die enteroide Isolation in einer Kultur zusätzlich zur Untersuchung der Zellproliferation und des Überlebens in Enteroiden. Wissenschaftler können diese Technik auf Kulturenteroide anwenden und die Wirkung von Medikamenten und entzündlichen Zytokinen auf Darmepithelzellen in vitro untersuchen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Wassertherapie bei entzündlichen Darmerkrankungen.

Wir wenden diese Methode an, um einige therapeutische Zytokine zu finden. Diese Methode bietet Einblicke in DiedarmepithelProliferation und Überleben;zusätzlich kann es auch in Organoiden verwendet werden, kultiviert um Gewebe andere als den Darm. Um Darmkrypen zu isolieren und enteroide Kultur durchzuführen, verwenden Sie Tissue Zangen und finden Irisschere, um etwa acht Zentimeter Ileum von einer eingeschläferten acht Wochen alten Wild-Typ-Maus zu dissektieren.

Verwenden Sie eine Spritze mit einer Gavage-Fütterungsnadel, um das Ileum mit etwa 40 Millilitere eiskalte Dulbecco-Phosphat-Gepufferte Saline zu spülen, dann längs mit einer Schere schneiden und das Ileum öffnen. Das Ileum in kleine Stücke schneiden und in fünf Milliliter sterile eiskalte DPBS in einem 15 Milliliter konischen Rohr aufteilen. Dann die Probe für fünf Minuten auf Eis schaukeln.

Verwenden Sie einen Pipettenregler, um den DPBS zu saugen und durch 10 Milliliter Kaltpuffer zu ersetzen. Nach 30 Minuten Schaukeln auf Eis verwenden Sie den Pipettenregler, um Puffer eins zu aspirieren und durch 10 Milliliter Kaltpuffer zwei zu ersetzen. Dann zwei bis drei Minuten von Hand schütteln bei ca. 80 Shakes pro Minute.

Nach dem Schütteln, inspizieren Sie ein zwanzig Mikroliter Tröpfchen Puffer zwei Inhalt unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass es Krypten mit körnigen Paneth-Zellen. Filtern Sie zwei Inhalte mit einem 70 Mikron sterilen Zellsieb und sammeln Sie den gefilterten Puffer in einem 50 Milliliter konischen Rohr. Pipette 20 Mikroliter Filtrat auf die Folie, um die Krypten zu zählen.

Übertragen Sie ein ausreichendes Volumen des gefilterten Puffers zwei Inhalte, um sicherzustellen, dass es etwa 500 Krypten pro Brunnen gibt. Drehen Sie bei 150 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, und dann vorsichtig den Überstand aspirieren. Setzen Sie die Krypten in 50 Mikroliter Kellermembranmatrix pro 500 Krypten aus.

Pipette rauf und runter unter Der pflegen, um Blasen zu vermeiden. Legen Sie ein 50 Mikroliter Tröpfchen Keller Membran Matrix und Krypta mischen in der Mitte eines Brunnens einer 24 Brunnenplatte. 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die Kellermembranmatrix zu polymerisieren.

Nach 30 Minuten Polymerisation, sorgfältig 600 Mikroliter Minigut-Medien zu jedem Brunnen hinzufügen. Bringen Sie die Platte auf den 37 Grad Celsius Brutkasten zurück und beobachten Sie jeden Tag unter dem Mikroskop, indem Sie alle zwei bis drei Tage die Medien wechseln. Um die Enteroide zu durchdringen, legen Sie die Gewebekulturplatte auf Eis, aspirieren Sie die Medien und fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter kalten DPBS hinzu.

Verwenden Sie eine P1000-Spitze, um Pipette nach oben und unten zu pipette, bis keine Matrix-Stücke übrig bleiben. Geben Sie die Probe durch eine Ein-Milliliter-Insulinspritze und in eine 15 Milliliter konische Röhre. Nachdem Sie fünf Minuten bei 150 mal G und vier Grad Celsius nach unten gewirkt haben, verwenden Sie eine Pipette, um die DPBS zu entfernen.

Die Enteroide in 50 Mikroliter Neiner-Membranmatrix pro Brunnen wieder aussetzen. Legen Sie die Platte 30 Minuten lang in den 37 Grad Celsius Inkubator, damit die Kellermembranmatrix polymerisiert werden kann. Dann überlagern Sie jeden Brunnen mit 600 Mikroliter ENR-Medien und geben Sie die Platte an den Inkubator zurück.

Wachsen Sie Enteroide für fünf bis sieben Tage, bevor Sie sie in eine neue 24 Well Platte mit einem Spaltverhältnis von eins zu zwei übergeben. Fügen Sie 600 Mikroliter ENR-Medium zu jedem Brunnen hinzu, und brüten Sie dann die Enteroide für vier bis fünf Tage im 37 Grad Celsius Inkubator. Richten Sie die Kontrollgruppe der unbehandelten Enteroide und die experimentelle Gruppe der mit fünf Nanogramm pro Milliliter Interleukin-22 behandelten Enteroide ein.

Bereiten Sie mindestens drei Replikationen für jede Gruppe vor. Fügen Sie 600 Mikroliter EdU-Medium zu jedem Brunnen von Enteroiden, außer einem Gut als negative Kontrolle für Hintergrundsubtraktion zu verwenden. Inkubieren Sie die Platte für zwei Stunden in einem 37 Grad Celsius Inkubator.

Um Enteroide aus der Kellermembranmatrix zu ernten, verwenden Sie einen Pipettenregler, um EdU-Medium zu aspirieren und einmal mit DPBS zu waschen. Fügen Sie dann einen Milliliter DPBS hinzu. Verwenden Sie eine P1000 Pipettenspitze, um Pipetten nach oben und unten zu pipette, bis keine festen Kellermembran-Matrix-Stücke übrig bleiben.

Die Probe in ein 15-Milliliter-Rohr geben und fünf Minuten lang bei 300-fachm G nach unten drehen, bevor der Überstand entsorgt wird. Fügen Sie 500 Mikroliter Zelldissoziationsenzyme hinzu und brüten sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie dann eine P200 Pipettenspitze, um Pipetten nach oben und unten zu pipette und Enteroide in einzelne Zellen zu brechen.

Als nächstes fügen Sie drei Milliliter von Dulbeccos Modified Eagle Medium hinzu, das 10% fetales Rinderserum enthält, und wiederholt Pipette mit einer P1000 PipetteSpitze. Nach der Zentrifugierung bei 300 mal G für fünf Minuten und der Ansaugung des Überstandes setzen wir die Zellen in einem Milliliter DPBS aus. Um die Fixierung und Permeabilisierung von Zellen durchzuführen, übertragen Sie zuerst die Zellsuspension auf ein ein Punkt-Fünf-Milliliter-Rohr, drehen Sie bei 300 mal G für fünf Minuten, und entsorgen Sie den Überstand.

Wir suspendieren die Zellen in einem Milliliter 4%Paraformaldehyd und fixieren 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugierung bei 300 mal G für fünf Minuten, aspirieren Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze. Waschen Sie die Zellen einmal mit dem DPBS, und drehen Sie wieder nach unten, um den Überstand zu entfernen.

Setzen Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,5% nichtionisches Tensid wieder aus und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie die Zellen wie zuvor mit DPBS waschen. Um die EdU zu erkennen, fügen Sie 100 Mikroliter Reaktionscocktail zu jeder 1,5 Milliliter Tube hinzu. Setzen Sie die Zellen wieder auf und schützen Sie sie vor Licht, und brüten Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Zentrifugierung bei 300 mal G für fünf Minuten, vorsichtig die Reaktionslösung mit einer Pipettenspitze ansaugen Fügen Sie 0,5% nicht-ionisches Tensid penetrant in jedes Rohr, um einmal bei Raumtemperatur zu waschen. Nach der Zentrifugation wie bisher setzen wir die Zellen in einem Milliliter DPBS aus. Filtern Sie die resuspendierten Zellen mit einem 40-Mikron-Sieb und sammeln Sie die gefilterten Zellen in einem 15 Milliliter konischen Rohr.

Führen Sie so schnell wie möglich Fakten zur Maschinenerkennung aus. Wählen Sie den geeigneten Kanal und die entsprechende Spannung für die Durchflusszytometrieanalyse aus. Zeichnen Sie für die Gating-Strategie ein Pseudofarbdiagramm FSC-A versus SSC-A und verteilen Sie die meisten Zellen an den sichtbaren Bereich der Punktkarte, indem Sie die Spannung anpassen.

Wählen Sie die Zellenpopulation als R1 aus, und schließen Sie die Zellablagerungen in der linken unteren Ecke aus. Erstellen Sie aus der R1-Zellpopulation ein FSC-A-versus FSC-H-Pseudofarbdiagramm. Legen Sie das Tor fest, um einzelne Zellen auszuwählen, die als R2 gekennzeichnet sind, und zellenverlumps auszuschließen.

Legen Sie aus der R2-Zellpopulation die Fluoreszenzintensität im Vergleich zum Zellzahlendiagramm fest und verwenden Sie die negative Steuerung, um das Tor festzulegen. Der Bereich des Fluoreszenzsignals ist ein positiver Zellbereich mit der Bezeichnung R3. Vergleichen Sie das Verhältnis dieser EdU-positiven Zellen zwischen den Versuchs- und Kontrollgruppen. Kleine Darmkrypten wurden isoliert und als Enteroide in der Kellermembranmatrix kultiviert.

Enteroids begannen zwei Tage nach der Isolation Knospen zu bilden. Am sechsten Tag hatten Enteroide viele Knospen mit vielen Schutt im Lumen. Enteroide waren zu diesem Zeitpunkt bereit, durchgesieben zu werden.

Enteroide wurden 3 Tage lang mit IL-22 behandelt, danach wurde die synthetische DNA mit EdU in Rot gekennzeichnet, um auf die Zellproliferation hinzuweisen. IL-22 behandelte Enteroide zeigten eine erhöhte Anzahl von EdU-positiven Zellen. IL-22 erhöhte die Proliferierungszellen von 40,1% auf 83,5%, wie durch Durchflusszytometrie analysiert.

Die Behandlung von IL-22 erhöhte auch den Zelltod bei Enteroiden, die durch Propidiumjodidfärbung in Rot angezeigt wurden. IL-22 erhöhte abgestorbene Zellen von 4,9% auf 16,2%, wie durch Durchflusszytometrie analysiert. Während der Krypto-Isolation Fortschritt ist faires Schütteln erforderlich, nachdem Puffer hinzugefügt wird, um sicherzustellen, dass genügend Krypten abgeschüttelt werden.

Wir empfehlen, inhalte unter dem Mikroskop zu untersuchen. Nach diesem Verfahren können wir auch die differenzierten Epitheltypen und Enteroide quantifizieren, indem wir spezifische Diese Methode verwendet, die Forschern helfen wird, die darmepitheliale Differenzierung in Enteroiden zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Frage Forschern auf dem Gebiet der Gastroenterologie den Weg, die entwicklungs- oder pathologischen Fragen im Schnitt zu erforschen.