Integration von Bioinformatik-Ansätzen und experimentellen Validierungen, um die Rolle der Notch-Signalisierung bei Eierstockkrebs zu verstehen
12. Januar 2020
Bioinformatik ist eine nützliche Möglichkeit, große Datensätze zu verarbeiten. Durch die Umsetzung von Bioinformatik-Ansätzen können Forscher schnell, zuverlässig und effizient aufschlussreiche Anwendungen und wissenschaftliche Entdeckungen erhalten. Dieser Artikel zeigt den Einsatz von Bioinformatik in der Eierstockkrebsforschung. Es validiert auch erfolgreich bioinformatische Erkenntnisse durch Experimente.
Bioinformatik ist eine nützliche Möglichkeit, Informationen aus Datensätzen zu extrahieren. Experimente sind für die Validierung gleichermaßen wichtig. Wir kombinieren beide Ansätze, um die Rolle der Kerbsignalisierung bei Eierstockkrebs zu untersuchen.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Forscher die Informationen aus den Bioinformatik-Datenbanken nutzen können, um ihre Forschungsrichtung vor der Durchführung eines Experiments zu planen. Mit akkumulierten Bioinformatik-Daten menschlicher Krankheiten sind Wissenschaftler nicht mehr mit verbundenen Augen verbunden. Experimente können durchgeführt werden, um spezifische Befunde zu validieren, was zu verbesserten Therapien oder zur Diagnose von Krankheiten führen kann.
Für die Meta-A-Analyse der Assoziation eines Gens von Interesse mit einer bestimmten Krebsart erstellen Sie ein Konto mit einer akademisch verbundenen E-Mail-Adresse, um auf die PRECOG-Datenbank zuzugreifen und die E-Mail-Adresse und das Passwort einzugeben, die mit dem Konto verknüpft sind, in das Login-Terminal. Klicken Sie auf Details anzeigen und geben Sie das betreffende Gen in die Suchleiste ein. Verwenden Sie dann die Scrollleiste, um den Überlebens-Z-Score für die spezifische Krebsart zu erhalten.
Um den Zusammenhang zwischen Genexpressionsniveaus und Eierstockkrebsstadien zu untersuchen, navigieren Sie zur CSIOVDB-Webseite und geben Sie den Namen des interessierenden Gens in die Suchleiste ein. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Überleben. Um Genexpressionsdaten in verschiedenen, normalen und Tumorgeweben zu bewerten, navigieren Sie zum GENT-Portal, und klicken Sie auf die Registerkarte Suchen.
Wählen Sie im Schlüsselwortabschnitt das Gensymbol für die Begriffe aus dem Dropdown-Menü aus, geben Sie das Gensymbol des betreffenden Gens ein, und wählen Sie Für die Typoption Gewebe aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen. Zusammenfassungsdiagramme der Genexpression in Normal- und Tumorgeweben verschiedener Krebsarten, basierend auf den Plattformen U133A und U122 Plus 2, werden angezeigt.
Klicken Sie dann auf den Link Ergebnisdatendownload, um auf die detaillierten Informationen zu den Genexpressionswerten, Gewebetypen und Datenquellen zuzugreifen. Um nach genetischen Veränderungen und Signalnetzwerken zu suchen, öffnen Sie die Webseite des CBIO-Portals, und klicken Sie auf die Zielseite, klicken Sie unter Abschnitt Studien auswählen auf die von Interesse interessierten Organe oder Gewebe, wählen Sie die jeweilige Studie aus, und klicken Sie auf Abfrage nach Gene. Wählen Sie im Abschnitt Genomprofile auswählen die Mutationen, die Änderungen der vermeintlichen Kopiernummer aus GISTIC oder die MRNA-Expressionsoption aus.
Wählen Sie die entsprechenden Daten aus dem Menü Patienten/Fallsatz auswählen aus, und geben Sie die Zielgensymbole in das Abfragefeld von Enter Genes ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abfrage senden, und öffnen Sie die Registerkarte Netzwerk, um das gewünschte Gennetzwerk abzurufen. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Datei, und wählen Sie Als Bild PNG speichern zum Herunterladen von Netzwerkbildern aus.
Um Fliegen mit NICD oder NICD und Mam-Überexpression zu erstellen, bereiten Sie die entsprechenden Fliegenbestände vor und wenden sie die zeitliche und regionale Genexpressions-Targeting-Technik an, um die raumzeitliche Genexpression gemäß Standardprotokollen zu steuern. Heben Sie die Fliegen bei 18 Grad Celsius bis zum Erwachsenenalter, bevor Sie 48 Stunden lang auf 29 Grad Celsius mit Hefe umschalten. Am Ende der 29 Grad Celsius Inkubation drei Milliliter PBS zu einer Embryo-Sammelschale hinzufügen und die Fliegenkultur mit einem Kohlendioxidpad anästhesieren.
Verwenden Sie ein Sezieren des Mikroskops, um eine anästhesierte weibliche Fliege zu identifizieren, und verwenden Sie ein Paar sezierende Zangen, um vorsichtig den unteren Thorax der Fliege zu greifen. Tauchen Sie die Fliege in der PBS innerhalb der Embryo-Entnahmeschale, und verwenden Sie ein zweites Paar Zange, um den Unterbauch zu kneifen, ziehen sanft, um die inneren Organe zu lösen. Suchen und lösen Sie das Paar eierstöcke vom Fliegenkörper, und brechen Sie die Muskelhülle, die sich am hinteren Ende der Eierstöcke befindet, um die Ovarials zu trennen.
Dann legen Sie die isolierten Eierstöcke in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr, das 500 Mikroliter PBS enthält, auf Eis. Wenn alle Eierstöcke gesammelt wurden, ersetzen Sie die PBS durch 500 Mikroliter 4%Formaldehyd, und legen Sie das Rohr für 10 Minuten auf einen Nutator. Am Ende der Inkubation die Fixierung entsorgen und die Eierstöcke mit drei, 15-minütigen Spülungen in einem Milliliter PBT pro Wäsche waschen.
Nach der letzten Wäsche die Eierstöcke 10-15 Minuten lang mit 150 Mikrolitern zu je 10 Mikroliter dAPI auf dem Nutator beschriften. Am Ende der Inkubation die Eierstöcke einmal 10 Minuten mit einem Milliliter PBT waschen, gefolgt von zwei 10-minütigen Wäbungen in PBS. Nach der zweiten Wäsche alle bis auf die letzten 300 Mikroliter PBS entfernen und eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze verwenden, um die Eierstöcke mehrmals zu triteratieren, um die Eierkammern zu befreien.
Als nächstes sedimentieren Sie das Eierstockgewebe vorsichtig durch eine schnelle Drehung in einer Mikrozentrifuge und entfernen Sie so viel PBS wie möglich, ohne das Eierstockpellet zu stören. Mit einer 1.000 Mikroliter-Pipettenspitze etwa drei Tropfen Montagelösung auf das Rohr übertragen und eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit ca. 0,33 Millimetern vom Ende gestutzt verwenden, um die gesamten 120 Mikroliter eiervaryhaltigen Montagelösung auf ein Glasmikroskopschlitten zu übertragen. Legen Sie ein Abdeckglas vorsichtig über die Montagelösung und versiegeln Sie die Kanten mit transparentem Nagellack.
Verwenden Sie dann ein konfokales Mikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung mit einer 0,8 Blende, um Bilder der gebeizten und montierten Eierstöcke zu erfassen. Mit dem PRECOG-Portal können die Z-Scores von NOTCH2, NOTCH3 und MAML1 bei Eierstockkrebs ermittelt werden. Die negativen Z-Score-Werte deuten auf das schlechte Gesamtüberleben von Patienten mit hohem Expressionsniveau der drei Gene hin.
Die Verwendung der CSIOVD-Datenbank zur Bestätigung dieser Befunde zeigt weiter, dass eine hohe Expression von NOTCH2, NOTCH3 und MAML1 mit einem schlechten Gesamt- und krankheitsfreien Überleben korreliert. Weitere Permutationstests deuten darauf hin, dass NOTCH2, NOTCH3 und MAML1 stark in Tumorgeweben exprimiert werden. Basierend auf diesen drei Kerngenen kann ein Signalnetzwerk erstellt werden, um die 50 am häufigsten veränderten Nachbargene bereitzustellen, die sich ebenfalls im selben Pfad mit den höchsten Mutationsraten befinden.
Von Interesse ist, dass die Überexpression des Drosophila-Äquivalenten NOTCH-Gens, NICD, allein, keine Tumore bei Drosophila induziert. Während die Überexpression von NICD und Mam zusammen Tumore in Fruchtfliegen induziert, wie das Vorhandensein mehrerer Epithelschichten und angesammelter Zellen zeigt. Weitere Experimente validierung kann den Weg für die Identifizierung von potenziellen neuen drogentherapeutischen Zielen, Krankheitbiomarkern und personalisierten Behandlungen ebnen.
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Übersicht
Dieser Artikel untersucht die Integration von Bioinformatik und Experimenten zur Erforschung der Notch-Signalübertragung bei Eierstockkrebs. Durch die Nutzung von Bioinformatik-Datenbanken können Forscher ihre Experimente strategisch planen, was zu fundierteren wissenschaftlichen Erkenntnissen führt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Bioinformatik
- Forschung zum Eierstockkrebs
- Experimentelle Validierung
Hintergrund
- Bioinformatik unterstützt die Verarbeitung umfangreicher Datensätze.
- Die Kombination von Bioinformatik mit Experimenten verbessert die Forschungsergebnisse.
- Die Notch-Signalübertragung spielt eine bedeutende Rolle beim Ovarialkarzinom.
- Die Nutzung vorhandener bioinformatischer Daten kann die experimentelle Planung leiten.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Rolle der Notch-Signalübertragung beim Eierstockkrebs.
- Experimentelle Validierung bioinformatischer Befunde.
- Verbesserung der Therapien und Diagnostik beim Eierstockkrebs.
Verwendete Methoden
- Bioinformatische Analyse der Notch-Signalwege.
- Experimentelle Validierung bioinformatischer Vorhersagen.
- Integration von Daten aus bioinformatischen Datenbanken.
- Planung der Forschungsrichtung basierend auf bioinformatischen Erkenntnissen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung der wichtigsten Komponenten der Notch-Signalübertragung.
- Validierung bioinformatischer Ergebnisse durch experimentelle Untersuchungen.
- Erkenntnisse zu potenziellen therapeutischen Zielstrukturen beim Ovarialkarzinom.
- Nachweis der Wirksamkeit der Kombination von Bioinformatik mit experimentellen Methoden.
Schlussfolgerungen
- Bioinformatik ist ein leistungsfähiges Werkzeug in der Krebsforschung.
- Die experimentelle Validierung ist entscheidend, um bioinformatische Vorhersagen zu bestätigen.
- Die Kombination dieser Ansätze kann zu bedeutenden Fortschritten beim Verständnis von Eierstockkrebs führen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Integration von Bioinformatik mit experimenteller Validierung ermöglicht es Biopharma-Teams, Zielhypothesen beim Ovarialkarzinom zu entlasten, indem groß angelegte Datensätze zur Priorisierung von Zielstrukturen genutzt werden, bevor kostspielige Arbeiten im nassen Labor durchgeführt werden. Dieser kombinierte Ansatz verbessert das Vorhersagevertrauen in Komponenten der Notch-Signalübertragung als potenzielle therapeutische Zielstrukturen oder Biomarker und unterstützt fundierte Go/No-Go-Entscheidungen in der frühen Entdeckungsphase. Die Methodik fördert die translationale Kontinuität von der Zielidentifizierung bis zur präklinischen Validierung, indem sie rechnergestützte Ergebnisse mit funktionellen Belegen abstimmt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Notch2, Notch3 und MAML1 als mögliche Treiber beim Ovarialkarzinom durch bioinformatische Analyse von Überlebens-Z-Scores und Genexpressionskorrelationen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Target-Validierung, indem er die experimentelle Planung mithilfe der Portale PRECOG, CSIOVDB, GENT und CBIO leitet, um differenziell exprimierte Gene und veränderte Signalnetzwerke zu identifizieren.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die mechanistische Entlastung von Risiken, indem genetische Veränderungen und Signalnetzwerke identifiziert werden, die mit einem schlechten Überleben assoziiert sind, und dadurch die Target-Auswahl für weitere Validierungen informiert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme (z. B. Drosophila-Ovarien mit NICD/mam-Überexpression) für die anschließende Wirkstoff-Screening vor, indem Phänotyp-Genotyp-Verbindungen bei der Modulation des Notch-Signalwegs etabliert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch definierte räumliche und zeitliche Kontrollen der Genexpression sowie standardisierte Protokolle zur Isolierung, Fixierung und Bildgebung von Ovarialgewebe.
- Skalierbarkeitswert: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform über verschiedene Krebsarten hinweg, indem ein übertragbarer Arbeitsablauf zur Integration von Datenbank-Mining mit experimenteller Validierung in genetisch zugänglichen Modellen demonstriert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme, indem die Aktivierung des Notch-Signalwegs in Drosophila-Ovarien mit tumorigenen Phänotypen verknüpft wird und eine mechanistische Grundlage für therapeutische Zielstrukturen bietet.
- Operativer Wert: Berücksichtigt risikoadjustierte Fortschrittsentscheidungen, indem eine kombinatorische Überexpression (NICD + mam) zur Tumorbildung erforderlich ist, wodurch die kontextabhängige Aktivität des Signalwegs hervorgehoben wird, die für die Validierung von Zielstrukturen entscheidend ist.
- Translationaler Biomarker-Abgleich: Verbindet bioinformatisch abgeleitete Überlebenskorrelationen (NOTCH2/3/MAML1 Z-Scores) mit experimentellen Tumorphänotypen und unterstützt damit Bemühungen zur Qualifizierung von Biomarkern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Zielidentifizierung bis zur Leitstruktur-Optimierung, wobei Bioinformatik die Hypothesengenerierung unterstützt und die experimentelle Validierung die Arzneimittelwirksamkeit des Targets und die Relevanz des Signalwegs beim Ovarialkarzinom bestätigt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem Überlebens- und Expressionsdatenbanken durchsucht werden, um Notch-Signalwegkomponenten für die funktionelle Untersuchung zu priorisieren.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft für Assays mittels standardisierter Aufbereitung von Eierstockgewebe und konfokaler Bildgebung, wodurch quantitative Aussagen über Phänotypen der Notch-Signalwegaktivierung ermöglicht werden.
- Analysen: Betont Überlebens-Z-Scores, Genexpressionskorrelationen und Ergebnisse von Permutationstests, die es fachübergreifenden Teams erlauben, die Relevanz von Zielstrukturen und die Häufigkeit von Signalwegsveränderungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die computergestützte Priorisierung von Zielstrukturen mit der präklinischen Kontinuität, indem die durch Notch vermittelte Tumorbildung in einem genetischen Modell validiert wird, was eine Entwicklungsfortschreibung mit reduziertem Risiko unterstützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt den Arbeitsablauf als wiederverwendbare Fähigkeit für die Validierung von Zielstrukturen über verschiedene onkologische Indikationen hinweg dar, indem ein reproduzierbarer Prozess aus Datenbankanalyse gefolgt von experimenteller Bestätigung gezeigt wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielstrukturauswahl, Verringerung mechanistischer Unklarheiten bezüglich der Beteiligung des Notch-Signalwegs und verbesserte Qualität der Zielstrukturhypothesen.
- Operativer Wert: Standardisierung von Bioinformatik-zu-Experiment-Workflows, Reproduzierbarkeit der Isolierung und Bildgebung von Eierstockgewebe sowie Skalierbarkeit von Datenbank-Mining-Ansätzen.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen durch zweifache Evidenz bei der Zielstrukturvalidierung, Kapitaleffizienz durch Fokussierung der Experimente auf bioinformatisch priorisierte Zielstrukturen und Verringerung biologischer Risiken in späteren Entwicklungsstadien durch mechanistische Entlastung.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung von Notch2/3/MAML1 oder benachbarten Netzwerkkomponenten für Investitionen sowie datengestützte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf übereinstimmenden rechnerischen und experimentellen Befunden.
Durchführungsaspekte
- Notwendige Fachkenntnisse umfassen die Navigation bioinformatischer Datenbanken (PRECOG, CSIOVDB, GENT, CBIO) sowie die Interpretation von Überlebens-Z-Scores, Genexpressionsprofilen und Mutationsdaten.
- Zum benötigten Instrumentarium gehören Zugang zu akademisch verbundenen bioinformatischen Portalen, Standardwerkzeuge der Molekularbiologie für den Umgang mit Fliegen, Dissektionsmikroskope, Zentrifugen und konfokale Mikroskope für die Gewebeabbildung.
- Die Standardisierung über Teamgrenzen hinweg erfordert eine Abstimmung zwischen Bioinformatikern und Experimentatoren hinsichtlich der Kriterien zur Zielgenauswahl, der verwendeten Gensymbole und der Validierungsendpunkte, beispielsweise die Bewertung von Tumorphänotypen.
- Anpassungsmöglichkeiten beinhalten die Modifikation der Zielgene, der Krebsarten in den Datenbankabfragen und der Überexpression-Konstrukte, wobei der grundlegende Arbeitsablauf aus in silico-Vorhersage gefolgt von in vivo/in vitro-Validierung beibehalten wird.
- Praktische Einschränkungen bestehen in der Abhängigkeit von der Qualität der Datenbankannotationen, möglichen artenspezifischen Unterschieden in der Notch-Signalübertragung zwischen Drosophila und Menschen sowie dem Bedarf an einer orthogonalen Validierung in Säugetiermodellen, um die translative Relevanz zu bestätigen.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Prediction of Clinical Outcomes from Genomic Profiles (PRECOG)
1:22
Cancer Science Institute of Singapore Database (CSIOVDB) and Gene Expression Across Normal and Tumor Tissue (GENT)
2:30
cBioPortal
3:30
Drosophila Dissection and Staining
7:23
Results: Representative Bioinformatic Approaches to Understanding the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer
8:42
Conclusion
