Imaging Dpp Release von einer Drosophila Wing Disc
30. Oktober 2019
Der Zeitpunkt der Exposition gegenüber Liganden kann sich auf ihre Entwicklungsfolgen auswirken. Hier zeigen wir, wie man die Freisetzung eines Drosophila-Knochenmorphogenetischen Proteins (BMP) namens Dpp aus Zellen der Flügelscheibe abbilden kann.
DPP beeinflussen das Zellschicksal, indem sie Rezeptoren bindet und ein Signal intrazellulär sendet, um die Transkription zu beeinflussen. Wenn DPP produziert, aber nicht veröffentlicht wird, hat es keinen Zugriff auf Rezeptoren und kann daher seine Rollen nicht ausführen. Diese Technik ermöglicht es, die DPP-Freisetzung zu visualisieren und ermöglicht es den Forschern zu untersuchen, welche genetischen und ökologischen Faktoren die DPP-Freisetzungsdynamik verändern.
Der BMP-Signalweg wird von Fliegen zum Menschen konserviert, so dass wir erwarten, dass der Mechanismus, der die DPP-Freisetzung vorschreibt, auch für die menschliche Entwicklung und Regeneration relevant sein wird. Beginnen Sie mit der Überquerung von 30 bis 40 jungfräulichen weiblichen DPP GAL4-Fliegen mit 10 bis 15 männlichen UAS-DPP-GFP-Fliegen. Fördern Sie die Eiablage, indem Sie eine kleine Menge Hefepaste zu einer frischen Durchstechflasche mit Lebensmitteln hinzufügen.
Um die Eier zu sammeln, kippen Sie die gekreuzten Fliegen in die Durchstechflasche und lassen Sie sie für drei bis vier Stunden liegen, bevor Sie sie entfernen. Halten Sie die Eiersammelfläschchen bei 25 Grad Celsius für ca. 144 Stunden, bis die Larven im dritten Instar-Stadium sind. Wählen Sie dann die entsprechenden Larven für die Zerlegung aus.
Wählen Sie zunächst Larven, die nicht TB sind, die normale Länge statt kurz und fett sein wird. Um das DPP-GFP zu wählen, das Larven exzessiiert, sehen Sie sie unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Alle Nicht-TB-Larven haben eine gewisse Fluoreszenz, aber das GFP ist auf die Flügelscheiben beschränkt und ist weniger hell auf den DPP-GFP-Larven.
Bereiten Sie modifizierte HL3-Medien nach Manuskriptanweisungen vor, die die Flügelscheiben für die Bildgebung am Leben erhalten. Stellen Sie den pH-Wert mit HEPES auf 7,1 ein und filtern Sie ihn dann durch einen 0,22-Mikrometer-Filter. Legen Sie zwei Stücke farbloser doppelseitiger Bandbreite weise über ein Mikroskopschlitten und lassen Sie einen Abstand von etwa fünf Millimetern zwischen sich und stellen Sie sicher, dass die Enden des Bandes mit den Rändern des Dias gespült liegen.
Verwenden Sie eine flache Kante, um das Band fest auf die Folie zu drücken. Fügen Sie 25 Mikroliter des modifizierten HL3-Mediums zwischen die beiden Bandstücke. Wenn die Flügelscheibe in den Medien montiert ist, verhindern die Bandstücke, dass sie durch den Deckelbeschlag zerquetscht wird.
Um die Larve zu sezieren, legen Sie sie in das modifizierte HL3-Medium und zerreißen Sie sie vorsichtig mit zwei Zangenpaaren. Entsorgen Sie die hintere Hälfte, dann greifen Sie die Mitte der vorderen Hälfte mit einem Paar Zange und verwenden Sie das andere Paar, um die Mundhaken zurück in die Larve zu drücken, bis sie vollständig invertiert ist. Achten Sie auf die scharfen Biegungen in den beiden dunkleren primären Zweigen der Luftröhre, die beide Seiten der Larve verlaufen.
Die Flügelscheiben liegen direkt darunter. Entfernen Sie die Scheiben vorsichtig und legen Sie sie in das HL3-Medium auf dem vorbereiteten Dia, um sicherzustellen, dass noch keine Luftröhre an den Scheiben befestigt ist. Ordnen Sie die Flügelscheiben so an, dass die Peripodial-Seite des Flügelbeutels nach oben zeigt und die Scheibe flach liegt.
Bedecken Sie den Flügel mit einem Deckelund Dichtung mit Nagellack. Sobald die Politur trocken ist, gehen Sie sofort mit der Bildgebung fort. Stellen Sie die montierte Flügelscheibe mit einem konfokalen Laserscanmikroskop mit einem 40-fachen Ölobjektiv und einem 488-Nanometer-Laser auf.
Sammeln Sie Bilder mit einer Geschwindigkeit von zwei Hertz für zwei Minuten. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie die Laserleistung gerade stark genug, um ein klares Bild der DPP-releasing Zellen zu erhalten, um über Bleichen zu vermeiden. Sammeln Sie die Bilder als Zeitreihe und exportieren Sie sie als AVI-Dateien, um ein Video der DPP-Version zu erhalten.
Wenn das Protokoll erfolgreich ist, erscheint DPP-GFP als Streifen in der Mitte der Flügelscheibe mit Kernen, die als nicht fluoreszierende Kreise sichtbar sind. Die DPP-GFP-Freisetzung ist als fluoreszierende Punkta sichtbar, die sowohl in als auch weit weg von den Zellkörpern erscheinen und verschwinden. Die deutlichen Puncta sind wahrscheinlich in Zytonen oder bei Cytoneme-Synapsen.
Die Flügelscheiben sind so montiert, dass die Bildgebung von der Peripodial-Seite aus erfolgt. Wenn die Flügelscheibe von der Rückseite abgebildet wird, erscheint die DPP-GFP-Fluoreszenz aus dem Fokus und die Auflösung wird schlecht sein. Wenn GFP nicht mit DPP verschmolzen ist, werden keine Punktzeichen außerhalb der Zellkörper beobachtet.
Diese Kontrolle zeigt, dass sich DPP-GFP anders verhält als GFP allein. Darüber hinaus erscheinen keine fluoreszierenden Puncta, wenn DPP-GFP nicht ausgedrückt wird. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, dass die Flügelscheibe peripodial Seite nach oben montiert wird.
Wenn die Flügelscheibe falsch ausgerichtet ist, erscheint DPP-GFP aus dem Fokus. Diese Methode könnte verwendet werden, um die Freisetzung von anderen entwicklungssignalen Liganden wie flügellos oder Igel zu studieren. Wir können alle verschiedenen ökologischen und genetischen Faktoren untersuchen, die die Freisetzung von DPP beeinflussen können.
Darüber hinaus können wir diese Methode anpassen, um die BMP-Freisetzung von anderen Zelltypen zu untersuchen.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Freisetzungsdynamik des Drosophila-Knochen-Morphogenese-Proteins (BMP) Dpp und verdeutlicht, wie der Zeitpunkt der Exposition die Entwicklungsergebnisse beeinflusst. Die entwickelte Methode ermöglicht die Visualisierung der Dpp-Freisetzung und liefert Einblicke in die genetischen und umweltbedingten Faktoren, die diesen Prozess beeinflussen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Zellsignalisierung
Hintergrund
- Dpp beeinflusst das Zellschicksal durch Bindung an Rezeptoren und Auslösung einer intrazellulären Signalübertragung.
- Ohne Freisetzung kann Dpp seine Rezeptoren nicht erreichen und seine Funktionen nicht ausführen.
- Diese Studie nutzt bildgebende Verfahren, um die Freisetzung von Dpp sichtbar zu machen.
- Der BMP-Signalweg ist evolutionär konserviert, was auf seine Relevanz für die menschliche Biologie hindeutet.
Zweck der Studie
- Die Freisetzung von Dpp aus Zellen der Flügelscheibe sichtbar machen.
- Untersuchen, wie genetische und umweltbedingte Faktoren die Dynamik der Dpp-Freisetzung verändern.
- Die Bedeutung der Dpp-Freisetzung für Entwicklung und Regeneration verstehen.
Verwendete Methoden
- Kreuzung von DPP-GAL4-Fliegen mit UAS-DPP-GFP-Fliegen.
- Induzierung der Eiablage mittels Hefepaste.
- Abbildungstechniken zur Visualisierung der Dpp-Freisetzung.
- Analyse genetischer und umweltbedingter Einflüsse auf die Freisetzungsdynamik.
Hauptergebnisse
- Die Studie visualisiert erfolgreich die Freisetzung von Dpp aus Zellen.
- Identifiziert Schlüsselfaktoren, die die Dynamik der Dpp-Freisetzung beeinflussen.
- Zeigt die Erhaltung der BMP-Signalwege auf.
- Liefert Erkenntnisse, die für die menschliche Entwicklung und Regeneration relevant sind.
Schlussfolgerungen
- Das Verständnis der Dpp-Freisetzung ist entscheidend für Einblicke in Entwicklungsprozesse.
- Die Ergebnisse könnten Auswirkungen auf die regenerative Medizin haben.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Techniken aufbauen, um andere BMPs zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Visualisierung der Dynamik der Ligandenfreisetzung schließt eine entscheidende Lücke bei der Target-Validierung, indem sie eine direkte Beobachtung der Signalverfügbarkeit ermöglicht, was für die Bewertung der Stärke therapeutischer Hypothesen unerlässlich ist. Diese Methode trägt zur mechanistischen Entschärfung von Risiken in der frühen Entdeckungsphase bei, indem sie klärt, ob ein Ligand in einem biologisch relevanten Kontext seinen Rezeptor aktivieren kann. Der Ansatz erhöht das Vorhersagevertrauen bezüglich Strategien zur Modulation von Signalwegen, insbesondere bei konservierten Signalnetzwerken wie BMP/TGF-β.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Ligandenfreisetzung als Voraussetzung für die Rezeptorbindung und Signaltransduktion.
- Operationaler Wert: Liefert einen direkten Nachweis der Ligandenverfügbarkeit und verringert damit die Uneindeutigkeit hinsichtlich des Wirkmechanismus des Zielmoleküls.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem bestätigt wird, dass genetische oder umweltbedingte Störungen die Zugänglichkeit des Liganden und nicht nur dessen Expression beeinflussen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare fluoreszierende Pünktchen als Proxy für Freisetzungsvorgänge und ermöglicht so den vergleichenden Screening von genetischen oder chemischen Modulatoren.
- Operativer Wert: Verwendet standardisierte Protokolle zur Dissektion und Präparation, um reproduzierbare Bildgebungsbedingungen über verschiedene Experimente hinweg sicherzustellen.
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert zeitlich aufgelöste Daten, die mit Aktivierungszuständen von Signalwegen korreliert werden können, um den Assay weiterzuentwickeln.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Nutzt die evolutionäre Erhaltung der BMP-Signalübertragung, um Hypothesen über menschliche Ligandenfreisetzungsmechanismen in Entwicklung und Regeneration abzuleiten.
- Operativer Wert: Übertragbar auf andere entwicklungsrelevante Liganden (z. B. Wingless, Hedgehog), wodurch die Anwendbarkeit auf verschiedene Signalwegklassen erweitert wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Ligandenfreisetzung in krankheitsrelevanten Systemen, indem zelluläre Dynamiken mit phänotypischen Ergebnissen verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess ein, indem sie eine Validierung der Ligandenfunktionalität in einem frühen Stadium ermöglicht, bevor Ressourcen in anschließende Screening- oder Lead-Optimierungsmaßnahmen investiert werden.
- Entdeckungsbiochemie: Überprüft die Hypothese, dass ein Ligand nicht nur exprimiert, sondern auch freigesetzt und für die Bindung an Rezeptoren verfügbar ist.
- Screening: Erzeugt quantitative, zeitlich aufgelöste Bildgebungsdaten, die für eine inhaltsreiche Analyse der Freisetzungskinetik unter wechselnden Bedingungen geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt messbare Ergebnisgrößen (Häufigkeit, Verteilung und Dauer fluoreszierender Pünktchen), die statistische Vergleiche zwischen experimentellen Gruppen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Dynamik der Ligandfreisetzung mit entwicklungsbedingten Phänotypen und unterstützt die Übertragung auf die Humangenetik mittels Erhaltung von Signalwegen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungsplattform zur Untersuchung der Freisetzungsmechanismen mehrerer Signalliganden über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem die Zugänglichkeit des Liganden bestätigt wird – ein entscheidender Schritt, der oft nur indirekt abgeleitet statt direkt gemessen wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Probenvorbereitung und Orientierungskontrollen (peripodiale Seite nach oben).
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem Ziele anhand der funktionellen Verfügbarkeit von Liganden gefiltert werden, nicht nur anhand von Expressionsniveaus.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen, deren Liganden eine regulierte Freisetzung in relevanten Geweben zeigen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Drosophila-Genetik, Dissektion und Fluoreszenzmikroskopie.
- Ist abhängig von der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie mit 40×-Öl-Objektiv und 488-nm-Laser zur optimalen Signalerfassung.
- Setzt eine standardisierte Mediumsherstellung (modifiziertes HL3, pH 7,1, HEPES-puffert, filtriert) voraus, um die Gewebeviabilität während der Bildgebung aufrechtzuerhalten.
- Erfordert eine einheitliche Probenausrichtung (Wingscheibe mit peripodialer Seite nach oben), um Fokusebenenartefakte zu vermeiden und reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten.
- Beschränkt sich auf die Ex-vivo-Gewebebildgebung; nicht anwendbar auf intakte Organismen oder Hochdurchsatz-Screening an lebenden Tieren.
