Quantifizierung der Tumorzelladhäsion in Lymphknoten-Kryosektionen

Die häufigsten Stellen für Metastasen sind die ursprünglichen Lymphknoten. Somatids können verwendet werden, um die Klebstoffaffinität zwischen den Lymphknotenabschnitten von Tumorzellen in vitro zu erkennen. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass frische Lymphknotenabschnitte eine natürliche Komplexität des ursprünglichen Gewebes bieten, die nicht mit gereinigten Proteinen nachbilden könnte.

Diese Methode könnte für molekulare Onkologiestudien nützlich sein, die versuchen, Gene oder Therapien zu identifizieren, die die Adhäsion von Tumorzellen an metastasierenden Zielorganen wie Lymphknoten stören. Um die Lymphknoten innerhalb von dreißig Minuten nach dem Opfer zu ernten, legen Sie die erwachsene Wistar-Ratte in dorsaler Rekumbency auf ein sauberes Dissektionsbrett bei Raumtemperatur und sprühen Sie das Fell mit 70% Isopropylalkohol. Mit sterilisierten Instrumenten, heben Sie die Bauchhaut und machen einen medialen Hautschnitt, um die Bauchviszera auszusetzen.

Extrahieren Sie den Darm, bis die brust- und abdominalen Lymphknoten sichtbar werden. Mit einer stumpfen Spitzenschere die Lymphknoten sorgfältig verbrauchen, ohne die zugrunde liegende obere mesenterische Arterie zu verletzen, und legen Sie den Lymphknoten in ein 15 ml-Rohr, das 5 ml steriles PBS enthält. Wenn alle Lymphknoten geerntet sind, legen Sie einen Lymphknoten pro Kryomold mit dem Gesicht nach unten auf die Basis jeder Form und fügen Sie gerade genug optimale Schneidtemperaturmedium hinzu, um das Gewebe zu bedecken.

Nach dem Einfrieren des Drucks verwenden Sie einen Kryostat, um 5 bis 8 Mikrometer dicke Abschnitte bei 22 Grad Celsius zu erfassen und die Abschnitte auf Glasmikroskop-Dias zu sammeln. Hochwertige Kryosektionen aus aufeinanderfolgenden Scheiben desselben Lymphknotens sind entscheidend für die Minimierung von Unterschieden zwischen den Scheiben und die Erleichterung konsistenter Zellhaftungsraten. Für die Tumorzellbeschriftung die interessenschonenden Zellen aus einer entsprechend inszenierten Zellkultur ernten und die Zellen bei 1 x 10 zu den 6 Zellen pro ml-Konzentration und serumfreiem Medium wieder suspendieren.

Übertragen Sie 1 ml Zellen in ein neues 15 ml konisches Rohr und beschriften Sie die Zellen mit 2 Mikrogramm pro ml DiI(C18) für zehn Minuten bei 37 Grad Celsius, mit sanfter Erregung bei fünf Minuten, um eine Zellsedimentation zu vermeiden. Am Ende der Inkubation pellet die Zellen durch Zentrifugierung und waschen Sie die markierten Zellen zweimal mit 10 ml frischem serumfreiem Medium, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Nach der zweiten Wäsche die Zellen bei 1 x 10 auf die 6 Zellen pro ml serumfreies Medium wieder aussetzen, ergänzt durch 0,1% Rinderserumalbuminkonzentration.

Durch das Fortschreiten der markierten Tumorzellen auf die geernteten Lymphknotengewebeabschnitte, waschen Sie die Abschnitte vorsichtig zweimal in PBS, gefolgt von einer Rehydratation in frischem PBS für fünfzehn Minuten bei Raumtemperatur. Blockieren Sie am Ende der Inkubation jede unspezifische Bindung mit 2,5% Rinderserumalbumin für dreißig Minuten bei 37 Grad Celsius, bevor Sie einen Wattestäbchen verwenden, um die Rutschen zu trocknen. Verwenden Sie einen hydrophoben Pen, um eine Barriere um jeden Abschnitt zu ziehen und fügen Sie 100 Mikroliter markierter Zellen auf jeden eingekreisten Lymphknoten hinzu.

Nach ein bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer alle nicht haftenden Zellen mit vier sanften Waschungen in PBS entfernen und die verbleibenden haftenden Fluoreszenzzellen mit 3,7% Formaldehyd in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Für die Quantifizierung des Klebstoffindex verwenden Sie das 10-fache Objektiv auf einem Fluoreszenzmikroskop, um individuelle TIFF-Bilder von jedem Abschnitt in den hellen und roten Fluoreszenzfeldern zu erhalten. Dann benennen und speichern Sie die Bilder systematisch, bevor Sie die Bilder in Fidschi öffnen.

Nachdem Sie den Maßstab gesetzt haben, wählen Sie mit dem polygonalen Werkzeug den zu quantifizierenden Interessenbereich aus. Wählen Sie diese Option aus, um den Lymphknotenbereich zu quantifizieren. Die Daten werden in Quadratmillimetern ausgedrückt.

Als Nächstes wählen Sie Plugins, Analysieren, Zellenzähler und klicken Sie auf das Foto, um quantifiziert zu werden. Klicken Sie auf Initialisieren, und wählen Sie Zählertyp aus. Klicken Sie dann auf die Zellen im Foto.

Der Lymphknoten-Adhäsionsindex wird als Anzahl der anhaftenden Tumorzellen pro abgedeckter Lymphknotenfläche ausgedrückt. Um das nächste Foto zu initialisieren, öffnen Sie das nächste Foto, und wiederholen Sie die Quantifizierung wie gezeigt. Wie beobachtet, ist die Morphologie der anhaftenden Zellen in Form gerundet, und die Zellen sind heterogen über den Lymphknoten von Interesse verteilt.

Der Lymphknoten-Adhäsionsindex ist in NDRG4-negativen Brustkrebszelllinien zwei- bis dreimal höher als bei entsprechenden NDRG4-positiven Zellen. Dieses Verfahren kann angepasst werden, um Haftraten in anderen metastasierenden Zielgeweben, wie Gehirn oder Lunge, zu unterstützen, um die sekundären bevorzugten Haftstellen für inseminierte Tumorzellen zu bewerten. Denken Sie daran, dass sowohl frische als auch gefrorene Gewebe als biogefährlich betrachtet werden sollten und unter verwendung sorgsam mit Biosicherheitsvorkehrungen behandelt werden sollten.