Name: Identifizierung neuartiger Regulatoren der Pflanzentranspiration durch großangelegtes Thermisches Bildgebungsscreening in Helianthus Annuus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Lernen Sie ein thermisches Bildgebungsverfahren zur Identifizierung neuer Verbindungen, die die Transpiration bei Helianthus annuus regulieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Stomataverhalten und Wassernutzungseffizienz.

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Die Arbeit wurde durch pomona College Start-up Funds und Hirsch Research Initiation Grants Fund (to FJ) sowie das Pomona College Molecular Biology Program durch das Stellar Summer Research Assistant Program (to KG) unterstützt.

1. Anbau der Pflanzen
<ol><li>Fügen Sie eine 4 cm dicke Schicht feinen Vermiculit s. auf Standard 10 in. x 20 in (254 mm x 501 mm) Pflanzenschalen ohne Löcher.</li>
	<li>Legen Sie die Saatguthalter (siehe Materialtabelle)2 cm voneinander entfernt in die Pflanzenschalen.</li>
	<li>Säwerthalter mit Vermiculit füllen.</li>
	<li>Legen Sie einen Sonnenblumenkern mit seinem spitzen Ende nach unten in jeden Samenhalter, drücken Sie nach unten, so dass die Hälfte des Samens ausgesetzt bleibt. HINWEIS: Ein Sonnenblumenkern ist asymmetrisch und das spitze Ende, von dem aus der Strahler entstehen wird, sollte nach unten zeigen. Eine richtige Saatgutplatzierung ist wichtig, da die Neuausrichtung von Wurzel und Stamm innerhalb der Samenhalter nicht möglich ist. Das abgerundete Ende des Samens sollte sich über die Oberseite des Saatguthalters erstrecken.</li>
	<li>Sobald die Samen an Ort und Stelle sind, bedecken Sie sie mit einer zusätzlichen 2 cm dicken Schicht feinen Vermiculit. Wasser durch Vernebeln von oben. Die Oberfläche sollte nach einer Stunde nass bleiben. Wenn dies der Fall ist, bedecken Sie die Schalen mit Deckeln.</li>
	<li>Wachsen Sie Pflanzen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus. Empfohlene Bedingungen sind eine Lichtintensität von 140 'mol Photonen'm-2's-1 und eine Photoperiode von 16 h Licht bei 22 °C und 9 h dunkel bei 20 °C für 5 Tage. HINWEIS: Eine Bewässerung sollte nicht erforderlich sein, es sei denn, die Oberfläche wird sichtbar trocken.</li>
</ol>2. Einrichtung des hydroponischen Systems
<ol><li>Finden Sie einen entsprechend großen Behälter, der für den hydroponischen Anbau von Pflanzen geeignet ist. Die Größe des Behälters sollte an den Platz in der Wachstumskammer oder im Gewächshaus angepasst werden. Es wird eine minimale Tiefe von 15 cm empfohlen.</li>
	<li>Füllen Sie den Behälter mit destilliertem Wasser und fügen Sie allgemeinen Hydroponikdünger, wie vom Hersteller angegeben. Die resultierende hydroponische Lösung sollte belüftet und in konstanter Bewegung erfolgen, was durch den Einsatz von Luft- und Wasserpumpen erreicht werden kann.</li>
	<li>Bereiten Sie die Hydroponik-Floater vor.<ol>
<li>Schneiden Sie ein Blatt aus 2 cm dickem expandiertem Polystyrolschaum (siehe Materialtabelle)auf die Abmessungen des Behälters. Das Blatt sollte den größten Teil der Oberfläche des Behälters abdecken, um das Algenwachstum zu begrenzen. Ein Holzverbrennungswerkzeug ist effektiv zum Schneiden von Polystyrolschaum und vielseitig genug für dieses Protokoll. VORSICHT: Dämpfe oder Dämpfe, die beim Warmschneiden von Polystyrolschaum freigesetzt werden, sind ernste Gesundheitsgefahren. Verwenden Sie den richtigen Atemschutz. Benutzer können auch Die Belüftungsanforderungen erfüllen, indem sie den Schaum unter eine Dunstabzugshaube schneiden.</li>
		<li>Machen Sie Löcher (1-2 cm Durchmesser) in der Polystyrol-Schaumplatte mit einem Holzverbrennungswerkzeug. Der Abstand zwischen den Zentren von zwei Löchern kann an die Bedürfnisse des Experiments angepasst werden. Es wird jedoch ein mindester Abstand von 2,5 cm empfohlen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Übertragung von Sämlingen auf Hydroponik und Pflanzenwachstum
<ol><li>5 Tage alte Sämlinge vorsichtig aus dem Vermiculit ziehen und sofort in einen mit Wasser gefüllten Behälter für 30 min geben. Dieser Schritt wird überschüssige Vermiculit entfernen und die verbleibenden Perikarpfen erweichen. Die entstehende primäre Wurzel sollte sichtbar sein.</li>
	<li>Entfernen Sie bei Bedarf die Pericarpwände von Hand, um die zukünftige Ausdehnung der Kotyledonen zu optimieren.</li>
	<li>Die Sämlinge innerhalb der Samenhalter auf den Polystyrolschaumschwimmer geben. Wachsen Sie die Pflanzen mit einer Lichtintensität von 140 'mol Photonen'm-2's-1, eine relative Luftfeuchtigkeit von 65% und eine Photoperiode von 16 h Licht bei 22 °C und 9 h dunkel bei 20 °C für 2 Tage.</li>
</ol>4. Vorbereitung vor der Behandlung
ANMERKUNG: Dieses Verfahren dient zur Prüfung von 20 Chemikalien aus einer kleinen Verbundbibliothek in Dreifachausführung, wobei 100 M ABA in 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) und 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) 1% (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO) als positive bzw. negative Kontrollen enthalten.
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass genügend Pflanzen bereit für die Behandlung sind. Pflanzen, die zur Behandlung bereit sind, sollten reif genug sein, um vollständig entfaltete Kotyledonen zu haben, aber jung genug, dass die seitliche Wurzelproliferation minimal ist. Für ein Standard-Screening werden 69 solcher Anlagen benötigt.</li>
	<li>Entfernen Sie die 96-Well-Platte, die die kleinen Verbindungen enthält, aus dem Gefrierschrank -80 °C. Bei Raumtemperatur auftauen.</li>
	<li>Bereiten Sie 80 ml 10 mM MES-KOH Puffer auf einen pH-Wert von 6,2 mit 1 M KOH eingestellt.</li>
	<li>Etikettenkappenlose 2 ml Mikroröhren. Bereiten Sie mindestens sechs Röhrchen für die Negativkontrollbehandlung vor (10 mM MES-KOH (pH = 6,2) mit 1% (v/v) DMSO). Verwenden Sie drei Röhren für die ABA-Behandlung (100 M ABA in 10 mM MES-KOH pH = 6,2), Positivkontrolle). Verwenden Sie die restlichen 60 Rohre, um die Wirkung der 20 Chemikalien in DreifacherSäure zu analysieren.</li>
	<li>Übertragen Sie 10 l jeder Chemikalie (10 mM in DMSO) in jedes der drei entsprechend gekennzeichneten Rohre. Pipetten Sie 10 l von 10 mM ABA in DMSO in drei Röhren und 10 l DMSO in die sechs Steuerrohre gelöst. VORSICHT: Von Natur aus können einige Verbindungen schwerwiegende gesundheitliche Auswirkungen haben und Benutzer müssen geeignete Schutzmaßnahmen ergreifen.</li>
	<li>Fügen Sie jedem der 69 Röhren 990 l von 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) hinzu. Geben Sie den MES-Puffer mit genügend Kraft aus, um die Chemikalie mit dem MES-Puffer zu mischen, aber achten Sie sehr darauf, nicht so viel Kraft zu verwenden, dass die Chemikalien und der MES-Puffer aus dem Rohr spritzen. Alternativ kann man bei niedriger Geschwindigkeit wirbeln.</li>
</ol>5. Richten Sie die Wärmebildkamera ein
<ol><li>Montieren Sie die Wärmebildkamera auf einem Kopierständer. Schließen Sie alle Kabel an einen Laptop an. HINWEIS: Die Aufzeichnung erfolgt unter Temperaturbedingungen (20 °C bis 25 °C), Luftfeuchtigkeit (50 % bis 70 %) und Lichtqualität (110 bis 140 mol Photonen-2s-1) ähnlich denen, die zum Anbau der Pflanzen verwendet wurden.</li>
	<li>Schalten Sie die Kamera dann den Laptop ein und öffnen Sie die Wärmebildanalysesoftware. HINWEIS: Die nachfolgenden Anweisungen für die Aufzeichnung gelten für eine bestimmte verwendete Software (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Passen Sie die Aufnahmeeinstellungen an.<ol>
<li>Bewegen Sie die Maus über die rote Aufnahmetaste oben im zentralen Fenster. Ein Dropdown-Menü wird angezeigt. Klicken Sie auf das Schraubenschlüsselsymbol Record Settings.</li>
		<li>Wählen Sie den entsprechenden Datensatzmodus und die entsprechenden Optionen aus. Die Option "Aufzeichnung" in regelmäßigen Abständen, wobei ein Frame pro Minute erfasst und ein manueller Stopp verwendet werden kann. Beachten Sie das Dateiziel, an dem die Software das Video speichert. Schließen Sie das Fenster Datensatzeinstellungen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Pflanzenvorbereitung und -behandlung
<ol><li>Legen Sie die kappenlosen Rohre, die die Chemikalien enthalten, in Rohrregale. Alternativ kann ein Polystyrolschaumblech mit einem Holzverbrennungswerkzeug geschnitten und gestochen werden, wie in Schritt 2.3 beschrieben, um ein individuelles Rohrgestell herzustellen. Der Durchmesser jedes Loches sollte sehr nahe am Außendurchmesser der kappenlosen Rohre liegen, um sie fest zu halten. HINWEIS: Das Sichtfeld der Kamera ist ein begrenzender Faktor, der bei der Entscheidung, wie die kappenlosen Rohre an Ort und Stelle gehalten werden sollen, berücksichtigt werden sollte.</li>
	<li>Gleichmäßig verteilen Sie die positiven und negativen Kontrollrohre sowie die Versuchsrohre in den Racks, um eine positionsbezogene Verzerrung zu berücksichtigen17.</li>
	<li>Bereiten Sie neben den hydroponisch angebauten Pflanzen folgende Materialien vor: Mikrodissektionsschere, eine flache Schale mit Wasser, zarte Aufgabentücher, die 69 kappenlosen Rohre, die die verschiedenen Chemikalien enthalten.</li>
	<li>Wiederholen Sie die folgenden Schritte für jede zu behandelnde Pflanze. Der Sonnenblumensprosse bleibt immer im Samenhalter.<ol>
<li>Heben Sie den Samenhalter vorsichtig an und tauchen Sie die Wurzel schnell in die flache Schale, die Wasser enthält.</li>
		<li>Schneiden Sie die primäre Wurzel unter Wasser, um Kavitation zu verhindern. Der Schnitt sollte 0,8-1 cm unter dem basalsten Ende des Samenhalters erfolgen.</li>
		<li>Die frisch geschnittene Pflanze in eine der Schläuche, die die Chemikalien enthält, einbauen.</li>
		<li>Wenn es irgendwelche Tropfen Wasser auf den Kotyledonen gibt, leicht tumdrehen sie trocken mit einem empfindlichen Aufgabenwischen. HINWEIS: Diese vier Schritte müssen so schnell wie möglich (10 min oder weniger) durchgeführt werden, um Inkonsistenzen in der Kinetikstudie zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bewegen Sie die Pflanzen unter der Wärmebildkamera und stellen Sie sicher, dass sich alle Pflanzen im Sichtfeld der Kamera befinden. Passen Sie die Kamerahöhe und die Racks bei Bedarf an.</li>
</ol>7. Aufnahme
<ol><li>Fokussieren Sie die Kamera auf die Oberfläche der Cotyledons, indem Sie Strg + Alt + Adrücken.</li>
	<li>Bewegen Sie die Maus über die rote Taste und klicken Sie auf die Option Film aufnehmen. Ein neues Fenster, das die Aufzeichnung bestätigt, sollte geöffnet werden.</li>
	<li>Beenden Sie die Aufnahme 1-2 Stunden später. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>8. Datenerhebung
<ol><li>Gehen Sie zu Datei | Öffnen | Suchen Sie nach der richtigen . SEQ-Datei und öffnen Sie sie.</li>
	<li>Beenden Sie die Wiedergabe des Films.</li>
	<li>Klicken Sie auf der linken Seite des Hauptfensters auf Ein Symbol für den Messcursor ROI (3x3 Pixel) hinzufügen. ROI steht für Region of Interest.</li>
	<li>Bewegen Sie die Maus über die Mitte eines Cotyledon der ersten Pflanze und klicken Sie mit der linken Maustaste einmal. Der Cursor 1 ist nun an Ort und Stelle. Beschriften Sie das zweite Cotyledon der ersten Pflanze, indem Sie das Verfahren wiederholen. Die Reihenfolge der Etiketten ist zu beachten.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Vorgang. Alle Pflanzen sollten mit zwei Cursorn beschriftet werden.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Symbol ROIs bearbeiten. Klicken Sie im Hauptfenster mit der linken Maustaste auf die linke obere Ecke, und scrollen Sie in die untere rechte Ecke, um alle ROIs auszuwählen.</li>
	<li>Bewegen Sie die Maus über das Symbol Statistic Viewer, und wählen Sie Temporal Plot. Ein neues Fenster wird geöffnet.</li>
	<li>Führen Sie den Film aus. Ein Diagramm wird mit den Daten gefüllt.</li>
	<li>Klicken Sie in diesem Fenster auf den Doppelpfeil in der oberen rechten Ecke, um ein neues Menü zu öffnen.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Save-Symbol. Speichern als X- und Y-Werte im Plot (.csv). Schließen Sie die Software, sobald Daten exportiert wurden.</li>
</ol>9. Datenanalyse
<ol><li>Öffnen Sie die .csv-Datei mit einer Datenanalysesoftware (z. B. Microsoft Excel). Beachten Sie, dass die drei ersten Spalten (A bis C) Informationen über die Framenummer, die absolute Zeit und die relative Zeit enthalten. Die verbleibenden Säulen geben die Temperatur jedes ROI im Laufe der Zeit an.</li>
	<li>Entscheidung über die Art des zu verwendenden statistischen Instruments; diese Entscheidung hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich des experimentellen Entwurfs. HINWEIS: In unserem Beispiel wird für jede Stichprobe ein Standardwert oder Z-Score basierend auf dem Mittelwert der Grundgesamtheit und der Standardabweichung der Grundgesamtheit berechnet. Für jede Stichprobe wird dann ein p-Wert aus dem z-Score berechnet. Mit dieser Methode können die Positiven- und Negativkontrollen sowie die Identifizierung neuer Verbindungen weiter getestet werden.</li>
</ol>

<ol><li>Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+adaptation+to+drought+stress%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Plant adaptation to drought stress.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gate+control%3A+guard+cell+regulation+by+microbial+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Gate control: guard cell regulation by microbial stress.</a> The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).</li>
<li>Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+Plant%27s+Dilemma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Revisiting the Plant's Dilemma.</a> Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).</li>
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<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+PP2C+phosphatase+activity+function+as+abscisic+acid+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors.</a> Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).</li>
<li>Cao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ABA-mimicking+ligand+that+reduces+water+loss+and+promotes+drought+resistance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants.</a> Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).</li>
<li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+dimeric+ABA+receptors+elicits+guard+cell+closure%2C+ABA-regulated+gene+expression%2C+and+drought+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).</li>
<li>Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+agrochemical+ligands+for+engineered+abscisic+acid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors.</a> Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetics+reveals+negative+regulation+of+abscisic+acid+signaling+by+a+plant+immune+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway.</a> Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Abscisic+Acid+Antagonists+Identified+with+Chemical+Array+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).</li>
<li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Chemical+Inhibitor+of+ABA+Signaling+Targets+All+ABA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).</li>
<li>Takeuchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designed+abscisic+acid+analogs+as+antagonists+of+PYL-PP2C+receptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions.</a> Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).</li>
<li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+modification+of+sunflower+oil+to+expand+its+industrial+value%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).</li>
<li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies%3A+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).</li>
<li>Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermography+to+explore+plant-environment+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Thermography to explore plant-environment interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).</li>
<li>Merlot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+infrared+thermal+imaging+to+isolate+Arabidopsis+mutants+defective+in+stomatal+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation.</a> The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Anzahl der Verbindungen, die an einem bestimmten Tag getestet werden können, hängt hauptsächlich von (i) dem umweltkontrollierten Raum ab, der für den Anbau der Pflanzen und die Durchführung des Bildschirms zur Verfügung steht, sowie von (ii) von der Anzahl der Personen, die an Schritt 6 des Protokolls beteiligt werden können. Wir empfehlen die Verwendung von drei experimentellen Replikaten, um die Interpretation der Ergebnisse nach der statistischen Behandlung zu konsolidieren. An einem typischen Tag können ein bis ...

Die Stresstoleranz bei Pflanzen ist ein polygener Merkmal, das durch eine Vielzahl molekularer, zellulärer, entwicklungs- und physiologischer Merkmale und Mechanismen beeinflusst wird1. Pflanzen in einer schwankenden Umgebung müssen ihre stomatoalen Bewegungen kontinuierlich modulieren, um den photosynthetischen Kohlenstoffbedarf auszugleichen und gleichzeitig ausreichend Wasser zu erhalten und eine Invasion von Krankheitserregern zu verhindern2; die Mechanismen, mit denen diese "Entscheidungen" zwischen diesen Kompromissen getroffen werden, werden jedoch schlecht verstanden3. Die Einführung bioaktiver Moleküle in Pflanzen kann ihre Physiologie modulieren und bei der Untersuchung neuer Regulationsmechanismen helfen.
Das groß angelegte Screening kleiner Moleküle ist eine effektive Strategie, die bei der Entdeckung von Krebsmedikamenten und pharmakologischen Assays verwendet wird, um die physiologischen Wirkungen von Hunderten bis Tausenden von Molekülen in kurzer Zeit zu testen4,5. In der Pflanzenbiologie hat das Hochdurchsatz-Screening seine Wirksamkeit beispielsweise bei der Identifizierung des synthetischen Moleküls Pyrabactin6sowie bei der Entdeckung des lang ersehnten Rezeptors von Abscisinsäure (ABA)7,8gezeigt. Seitdem wurden Agonisten und Antagonisten von ABA-Rezeptoren und kleinen Molekülen identifiziert, die in der Lage sind, die Expression von ABA-induzierbaren Reportergenen zu modulieren9,10,11,12,13,14,15. Derzeit verfügbare Hochdurchsatz-Screening-Ansätze zur Identifizierung kleiner Verbindungen, die die stomatole Blendung modulieren können, haben einige Nachteile: (i) Protokolle, die sich um den ABA-Signalweg drehen, können die Identifizierung neuartiger ABA-unabhängiger Mechanismen verhindern, und (ii) In-vivo-Strategien zur Identifizierung bioaktiver kleiner Moleküle beruhen in erster Linie auf deren physiologischen Auswirkungen auf die Samenkeimung oder das Sämlingswachstum und nicht auf die Regulierung der Pflanzentranspiration.
Darüber hinaus gibt es viele Möglichkeiten, Pflanzen mit bioaktiven Molekülen zu behandeln, aber die meisten von ihnen sind nicht gut für eine groß angelegte Studie der stomatoalen Bewegung geeignet. Kurz gesagt, die drei häufigsten Techniken sind Blattanwendung durch Sprühen oder Tauchen, Behandlung des Wurzelsystems und Wurzelbewässerung. Die Blattanwendung ist nicht mit den gebräuchlichsten und schnellsten Methoden zur Messung der stomatalen Blende kompatibel, da das Vorhandensein von Tröpfchen an der Blattoberfläche die großangelegte Datenerfassung beeinträchtigt. Die Haupteinschränkungen der Wurzelbewässerung sind die großen Probenvolumenanforderungen, die potenzielle Retention der Verbindungen durch Elemente in der Rhizosphäre und die Abhängigkeit von aktiver Wurzelaufnahme.
Hier stellen wir eine groß angelegte Methode zur Identifizierung neuer Verbindungen vor, die die Pflanzentranspiration regulieren, die nicht unbedingt ABA- oder bekannte Trockenheitsreaktionsmechanismen beinhalten und eine effiziente und zuverlässige Behandlung von Anlagen ermöglichen. In diesem System werden Helianthus Annuus-Pflanzen mit einem Wurzelfütterungsansatz behandelt, der darin besteht, die Primärwurzel von hydroponisch angebauten Sämlingen zu schneiden und die schnittstelle in die Probenlösung zu tauchen. Nach der Behandlung wird die Wirkung jeder Verbindung auf die Transpiration von Pflanzen mit einer Infrarot-Wärmebildkamera gemessen. Da eine wesentliche Determinante der Blattoberflächentemperatur die Verdunstungsrate des Blattes ist, können Wärmebilddaten direkt mit der stomatalischen Leitfähigkeit korreliert werden. Die relative Veränderung der Blatttemperatur nach chemischer Behandlung bietet somit eine direkte Möglichkeit, die Pflanzentranspiration zu quantifizieren.
H. annuus ist eine der fünf größten Ölsaaten pflanzen in der Welt16 und Entdeckungen direkt auf dieser Pflanze gemacht kann zukünftige Transfer von Technologie zu erleichtern. Darüber hinaus haben H. annuus Sämlinge große und flache Kotyledonen, sowie eine dicke Primärwurzel, die ideal für die Entwicklung dieses Protokolls war. Diese Methode kann jedoch leicht an andere Pflanzen und eine Vielzahl von Verbindungen angepasst werden.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Moleküle effektiv zu identifizieren, die in der Lage sind, stomatale Verschluss zu lösen oder die stomasale Öffnung zu fördern, was erhebliche Auswirkungen auf das Verständnis der Signale hat, die die stomatole Leitfähigkeit und Die Anpassung der Anlage an die Umwelt regulieren. Betont.

<table><tbody><tr><td>1020 Kunststoff-Anzuchtschalen ohne Abflusslöcher</td><td></td><td></td><td>Standard 10 x 20 Zoll Schalen</td></tr><tr><td>2,0 mL Mikroröhrchen, ohne Kappe</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-283NC</td><td></td></tr><tr><td>Abscisinsäure (ABA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>Luftpumpe</td><td>Active Aqua</td><td>AAPA7.8L</td><td>2 Ausgänge, 3W, 7,8 L/min</td></tr><tr><td>Ausströmer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bibliothek für chemische Verbindungen</td><td>MicroSource Discovery</td><td></td><td>Natural Product</td></tr><tr><td>Collection Creative Versa-Tool (Holzbrennwerkzeug)</td><td>Nasco</td><td>9724549</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO), Pflanzenzellkultur getestet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Zwerg-Sonnenflecken-Sonnenblumenkerne</td><td>Outsidepride.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erythrosin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>200964</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokultur-Düngerset (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro)</td><td>Allgemeine Hydrokultur</td><td>GL51GH1421.31.11</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Laptop</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodissektionsschere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>ResearchIR Software</td><td>FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R-Tech Hartpolystyrolschaumplatte</td><td>Insulfoam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saatguthalter</td><td>Araponics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Super Tub (Kunststoffwanne)</td><td>Maccourt</td><td>ST3608</td><td>36 x 24 x 8 Zoll große Badewanne für Hydrokultur</td></tr><tr><td>T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld-Wärmebildkamera</td><td>FLIR</td><td>FLIR-T62101</td><td>Kommt mit dem erforderlichen Ladekabel und dem USB-Kabel, das für den Anschluss an den Laptop</td></tr><tr><td>erforderlich ist Vermiculit-Wasserfilter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SunSun</td><td>HW-304B Pro Kanisterfilter</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung neuartiger regulatoren der pflanzentranspiration durch großangelegtes thermisches bildgebungsscreening in helianthus annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Die Anpassung der Pflanzen an biotische und abiotische Belastungen wird durch eine Vielzahl von Faktoren bestimmt, unter denen die Regulierung der stomatalen Öffnung als Reaktion auf Wasserdefizit oder Krankheitserreger eine entscheidende Rolle spielt. Die Identifizierung kleiner Moleküle, die die stomasale Bewegung regulieren, kann daher dazu beitragen, die physiologische Nergrundlage zu verstehen, auf der sich Pflanzen an ihre Umgebung anpassen. Groß angelegte Screening-Ansätze, die zur Identifizierung von Regulatoren der stomatalen Bewegung verwendet wurden, haben potenzielle Einschränkungen: Einige verlassen sich stark auf den Signalweg des Abbscisinsäure(ABA)-Hormons, wodurch ABA-unabhängige Mechanismen ausgeschlossen werden, während andere auf die Beobachtung indirekter, langfristiger physiologischer Effekte wie Pflanzenwachstum und -entwicklung angewiesen sind. Das hier vorgestellte Screening-Verfahren ermöglicht die großflächige Behandlung von Anlagen mit einer Bibliothek von Chemikalien in Verbindung mit einer direkten Quantifizierung ihrer Transpiration durch Wärmebildgebung. Da die Verdunstung von Wasser durch Transpiration zu einer Blattoberflächenkühlung führt, bietet die Wärmebildgebung einen nicht-invasiven Ansatz, um Veränderungen der stomataalen Leitfähigkeit im Laufe der Zeit zu untersuchen. In diesem Protokoll werden Helianthus annuus Sämlinge hydroponisch angebaut und dann durch Wurzelfütterung behandelt, bei der die Primärwurzel geschnitten und in die zu prüfende Chemikalie getaucht wird. Die Wärmebildgebung mit anschließender statistischer Analyse von kotyledonären Temperaturänderungen im Laufe der Zeit ermöglicht die Identifizierung bioaktiver Moleküle, die die stomamale Öffnung modulieren. Unsere Proof-of-Concept-Experimente zeigen, dass eine Chemikalie innerhalb von 10 Minuten von der geschnittenen Wurzel zum Kotyledon des Sonnenblumensämlings getragen werden kann. Darüber hinaus kann bei der Behandlung von Pflanzen mit ABA als Positivkontrolle innerhalb von Minuten ein Anstieg der Blattoberflächentemperatur festgestellt werden. Unsere Methode ermöglicht somit die effiziente und schnelle Identifizierung neuartiger Moleküle, die die stomatole Öffnung regulieren.

Ein Experiment mit dem roten Farbstoff Erythrosin B (0,8 kDa) zeigt die Fähigkeit von Chemikalien, durch eine geschnittene Wurzel innerhalb von 10 Minuten sichtbar durch eine geschnittene Wurzel in die Kotyledonen eines Sonnenblumensämlings aufgenommen zu werden (Abbildung 1).
Wenn Pflanzen mit ABA behandelt werden, wird innerhalb weniger Minuten ein Anstieg der Blatttemperatur in Sonnenblumen-Cotyl...

Wir bieten eine Methode zur Identifizierung von Modulatoren der Blatttranspiration durch großangelegtes Screening einer zusammengesetzten Bibliothek.

Identifizierung neuartiger Regulatoren der Pflanzentranspiration durch großangelegtes Thermisches Bildgebungsscreening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Dieses Protokoll verwendet Wärmebildgebung, um neue Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, die Pflanzentranspiration zu regulieren. Diese Technik ist vielseitig in Bezug auf die Pflanzenarten, die getestet werden können, die Art der Verbindung, und die Art der Bildgebung. Um die Pflanzen für den Anbau aufzustellen, fügen Sie zunächst eine vier Zentimeter dicke Schicht feinen Vermiculits zu Standard 10 mal 20 Zoll Pflanzenschalen ohne Löcher hinzu und legen Sie Die Samenhalter zwei Zentimeter voneinander entfernt in die Schalen.Füllen Sie die Samenhalter mit Vermiculit und legen Sie ein Sonnenblumenkernspitzein dein Ende in jeden Halter, so dass die Hälfte des Samens freigelegt bleibt. Wenn alle Samen plattiert sind, bedecken Sie sie mit weiteren zwei Zentimeterfeiner Vermiculit und Nebel mit Wasser von oben. Nach einer Stunde die Schalen mit Deckeln bedecken und die Pflanzen in einer Wachstumskammer in einem Gewächshaus platzieren.Um das Hydroponiksystem einzurichten, füllen Sie einen entsprechend großen Behälter, der für den Anbau von Pflanzen hydroponisch mit destilliertem Wasser geeignet ist, und fügen Sie den vom Hersteller angegebenen allgemeinen Hydroponikdünger hinzu. Verwenden Sie dann Luft- und Wasserpumpen, um die resultierende Hydroponiklösung mit konstanter Bewegung zu belüften. Um die Hydroponik Schwimmer vorzubereiten, schneiden Sie ein Blatt von zwei Zentimeter dicke expandiertem Polystyrolschaum auf die Abmessungen des Behälters und verwenden Holzverbrennungswerkzeug, um Ein bis zwei Zentimeter Durchmesser Löcher im Schaum zu machen.Dann legen Sie die Schwimmer in das Hydroponiksystem. Fünf Tage nach der Pflanzung die Sämlinge vorsichtig aus dem Vermiculit ziehen. Die Sämlinge sofort 30 Minuten lang in einen Behälter mit Wasser geben, um überschüssigevermiculit zu entfernen und die restlichen Perikarpfen zu erweichen.Wenn die entstehenden Primärwurzeln sichtbar sind, entfernen Sie die Perikarpfen bei Bedarf von Hand. Die Sämlinge innerhalb der Samenhalter in die vorbereiteten Polystyrolschaumschwimmer im Hydroponiksystem geben. Wachsen Sie die Pflanzen in Hydroponik für zwei Tage.Lassen Sie die Chemikalien aus der kleinen Verbundbibliothek bei Raumtemperatur auftauen. Etikettieren Sie sechs kaplose Zwei-Milliliter-Mikroröhren für die Negativkontrollbehandlung, drei Röhren für die ABA-Behandlung und die abschließenden 60 Tuben zur Analyse der Auswirkungen der 20 Chemikalien, die für Triplicate von Interesse sind. Fügen Sie 10 Mikroliter jeder Chemikalie in jedes der Reagenzgläser, 10 Mikroliter 10 Millimolar ABA und Dimethylsulfoxid in die drei ABA-Röhren und 10 Mikroliter Dimethylsulfoxid in die sechs Kontrollröhrchen.Dann 990 Mikroliter 10 Millimolar MES Kaliumhydroxid sorgfältig in jede Röhre mischen. Legen Sie die Rohre in ein Rohrgestell mit der positiven und negativen Kontrolle und Experimentelle Norden gleichmäßig innerhalb des Racks verteilt, um positionbezogene Verzerrung zu berücksichtigen. Um die Wärmebildkamera einzurichten, montieren Sie die Kamera zuerst an einem Kopierständer und schließen Sie alle Kabel an einen Laptop an.Schalten Sie die Kamera ein, bevor Sie den Laptop einschalten, und öffnen Sie die Wärmebildanalysesoftware. Um die Aufnahmeparameter anzupassen, rollen Sie mit der Maus über die Aufnahmetaste, um die Auswahl des Schraubenschlüsselsymbols unter Aufnahmeeinstellungen zu ermöglichen, und wählen Sie den entsprechenden Aufnahmemodus und die entsprechenden Optionen aus. Für die Behandlung der Sämlinge den Samenhalter vorsichtig anheben und die Wurzel schnell in die flache, wasserhaltige Schale tauchen.Schneiden Sie die Primärwurzel jedes Sämlings unter Wasser 0,8 bis 1 Zentimeter unter dem basalsten Ende des Saatguthalters, um eine Versenkung zu verhindern, und legen Sie die frisch geschnittene Pflanze in eine Röhre mit Chemikalien ein. Wenn alle Sämlinge übertragen wurden, stellen Sie die Pflanzen unter die Wärmebildkamera und bestätigen Sie, dass sich alle Pflanzen im Sichtfeld der Kamera befinden. Um die Kamera auf die Oberfläche der Cotyledons zu fokussieren, drücken Sie Control Alt A und klicken Sie auf Film aufnehmen.Ein neues Fenster, das die Aufzeichnung bestätigt, wird geöffnet. Beenden Sie nach ein bis zwei Stunden die Aufnahme. Öffnen Sie für die Datenanalyse die richtigen seq-Dateien, und halten Sie den Film an.Klicken Sie auf den Messcursorbereich von Interesse drei mal drei Pixel und bewegen Sie die Maus über die Mitte eines Cotyledons der ersten Pflanze. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Bild, um das Cotyledon zu beschriften. Etikettieren Sie das zweite Cotyledon der ersten Pflanze auf die gleiche Weise.Wenn alle Pflanzen mit zwei Cursorn beschriftet wurden, klicken Sie auf das Symbol "Segmente von Interesse bearbeiten", und klicken Sie mit der linken Maustaste auf "Halten" und scrollen Sie, um alle Interessenbereiche auszuwählen. Rollen Sie als Nächstes mit der Maus über das Statistik-Viewer-Symbol, und wählen Sie das zeitliche Diagramm aus. Ein neues Fenster wird geöffnet.Führen Sie den Film aus, wird ein Diagramm mit den Daten gefüllt. Klicken Sie dann im Diagrammfenster auf den Doppelpfeil, um ein neues Menü zu öffnen, und klicken Sie auf das Symbol speichern, um die Daten zu speichern. Die Verwendung des roten Farbstoffs Erythrosin B zeigt die Fähigkeit von Chemikalien, innerhalb von 10 Minuten durch eine geschnittene Wurzel sichtbar in die Cotyledons eines Sonnenblumensämlings aufgenommen zu werden.Wenn Pflanzen mit ABA behandelt werden, wird innerhalb von 30 Minuten ein Anstieg der Blatttemperatur in Sonnenblumen-Cotyledons festgestellt, der mit der Abnahme der stomataalen Blende und der stomatalen Leitfähigkeit verbunden ist. Darüber hinaus wird eine erhöhte Blatttemperatur 15 Minuten nach der Behandlung mit 10 Mikromolaren ABA und 20 Minuten nach der Behandlung mit fünf mikromolaren ABA beobachtet, die zeigen, dass die Messung der Blatttemperatur durch Wärmebildgebung ein guter Proxy für die Messung der stomataalen Blende und Leitfähigkeit ist. In diesem repräsentativen Experiment ermöglicht eine standardscorebasierte statistische Behandlung die Identifizierung von Chemikalien, die das stomatoale Schließen oder Öffnen fördern.Um die Auswirkungen von Verbindungen auf die Transpiration zu messen, ist es wichtig, Pflanzen unter optimalen Bedingungen von Licht, Feuchtigkeit und Temperatur zu züchten. Dieses Protokoll kann auf die meisten Dicots angewendet werden. Es kann auch verwendet werden, um die Wirkung neuer Verbindungen auf die photosynthetische Leistung zu bewerten, z. B. durch Messung der Chlorophyllfluoreszenz.

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Identifizierung neuartiger Regulatoren der Pflanzentranspiration durch großangelegtes Thermisches Bildgebungsscreening in Helianthus Annuus (Video) | JoVE Journal

Identifizierung neuartiger Regulatoren der Pflanzentranspiration durch großangelegtes Thermisches Bildgebungsscreening in Helianthus Annuus

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