Sequenzierung kleiner nicht-kodierender RNA aus formalinfixierten Geweben und Serum-abgeleiteten Exosomen von kastrationsresistenten Prostatakrebspatienten

Mit Hilfe dieses Protokolls können Forscher neuartige Exome oder extrazelluläre Vesikel-basierte und gewebebasierte Mikrozellulär für fortgeschrittenen Prostatakrebs identifizieren. Die Isolierung von RNA aus F-F-B-Geweben und extrazellulären Vesikeln ist oft eine Herausforderung, da der größte Teil davon entweder de erstellt wird oder in begrenzter Menge ist Dieses Teilchen wird verschiedene Methoden zur Optimierung der R-N-A-Eingänge und C-D-N-A-Bibliotheken erarbeiten, um die spezifischsten freien und qualitativ hochwertigen Daten für die Sequenzierung der nächsten Generation zu genisieren. Next Gen Sequenzierung bietet die umfassendste Plattform zum Verständnis Molekülveränderung im Tumor, die Tumorprogression zugrunde liegt dieses Teilchen mit Prostatakrebs klinische Probe optimiert ist, und kann neue Einblicke in die zugrunde liegende Biologie von fortgeschrittenen aggressiven Prostatakrebs bieten.

Die Optimierung der C-D-N-A-Bibliotheken aus geringem Inputmaterial ist ein entscheidender Schritt für einen erfolgreichen Sequenzierungslauf, daher ist es sehr wichtig, qualitativ hochwertige C-D-N-A-Bibliotheken zu generieren, um genaue Ergebnisse zu erhalten. Nach der Durchführung Mikro-Sektion von Geweben, wie zuvor getan gehen Sie zur Isolierung Serum abgeleitet E-V Thaw Reihen von Patienten serum Proben bei vier Grad Celsius. 110 Mikroliter aufgetautes Serumprobe in ein Rohr geben und dreißig Minuten lang bei zweitausend Mal G drehen.

Wählen Sie die Super naden für die nachfolgende E-V- oder Exosome-Isolierung und entsorgen Sie das Debree-Pellet. Bei 30 Mikroletern von Serum-Exosomen-Isolationsreagenz zum Supernatenten. Eine inkubieren es vier Grad Celsius für dreißig Minuten.

Drehen Sie bei zehntausend Mal G für zehn Minuten. Wählen Sie den E-V Super nadent sorgfältig, ohne das Pellet in einem separaten 1,5-Milliliter-Rohr zu stören und speichern Sie minus 80 Grad Celsius für zukünftige Analysen. Dann das E-V-Pellet in 70 Mikroliter P-B-S in nukleasefreiem Wasser aufhängen.

Nach der Isolierung der gesamten R-N-A aus mikrosezierten Geweben und gereinigten E-V mit kommerziellen Kits führen Bibliotheksvorbereitung in fünf Mikroliter eines normalisierten vierzig Nanogramm pro Mikroliter R-N-A Probe bei einem Mikroliter von drei Prime Adapter. Den Thermocycler auf 70 Grad Celsius vorheizen und die Probe zwei Minuten lang inkubieren. Übertragen Sie die Proben sofort auf Eis.

In einem separaten Rohrmischen zwei Mikroliter Ligationspuffer, ein Mikroliter RNase-Inhibitor und ein Mikroliter T4-RNA-Ligase zwei, ein Deletionsmutant. Mix bye Pie Bettwäsche auf und ab. Dann fügen Sie vier Mikroliter der Mischung in das Rohr mit dem R-N-A 3 Prime Adapter auf Eis.

Den Thermischen Cycler auf 28 Grad Celsius vorheizen. Und legen Sie die Röhre in den thermischen Cycler für eine Stunde zu inkubieren. Danach fügen Sie einen Mikroliter Stop-Lösung in das Rohr, während die Probe auf dem thermischen Cycler zu halten.

Bei 28 Grad Celsius für weitere 15 Minuten inkubieren. Dann sofort die Röhre entfernen und auf Eis halten. In einem separaten Rohr einen Mikroliter von fünf Prime-Adapter hinzufügen.

Transfer zu einem thermischen Cycler, der auf 70 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Und zwei Minuten inkubieren. Legen Sie die Röhre sofort auf Eis, um eine Wiederbelebung der Adapter zu verhindern.

Fügen Sie einen Mikroliter von zehn Millimole A-T-P in das Rohr von D natured fünf Prime Adapter. Mix bye Pie Pedding und fügen Sie einen Mikroliter T4 R-N-A Ligase in die Mischung. Mix bye Pie Pedding.

Übertragen Sie drei Mikroliter dieser Mischung auf das Rohr mit den drei Hauptadapter ligierten R-N-A. Legen Sie das Rohr auf den thermischen Cycler, der auf 28 Grad Celsius vorgeheizt wurde, und brüten Sie eine Stunde lang. Danach die Röhre sofort auf Eis übertragen und entweder mit den Proben weiterfahren oder bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung lagern.

Um R-T-P-C-R auszuführen, verwenden Sie sechs Mikroliger jedes Adapters ligted R-N-A und fügen Sie einen Mikro-Liger R-N-A R-T Primer hinzu. Übertragen Sie das Rohr auf den thermischen Cycler vorgewärmt auf 70 Grad Celsius und inkubieren für zwei Minuten. Übertragen Sie die Röhre auf Eis.

In einem separaten Rohr mischen zwei Mikroliter 5X, Strangpuffer, 5 Mikroliter von 12,5 Milmoler DNTpTs, ein Mikroliter von 100 milmolar DTT, ein Mikroliter R-N-A-Hemmer, und ein Mikroliter Reverse Transkriptase. Fügen Sie fünf Mikroliter dieser Mischung in den Adapter ligierte RNA und übertragen Sie es auf den thermischen Cycler, der auf 50 Grad Celsius vorgewärmt wurde, um für eine Stunde zu brüten. Nach einer Stunde transferiert der Adapter die kostenlose DNA sofort auf Eis.

Mischen Sie in einer separaten Röhre 25 Mikroliter PCR-Mix, zwei Mikroliter RNA-PCR-Primer, zwei Mikroliter RNA-PCR-Primerindex und 8,5 Mikroliter freies Wasser der RNA. Fügen Sie 37,5 Mikroliter dieser Mischung zu 12,5 Mikroliter des Adapters ligted CDNA hinzu. Übertragen Sie das Rohr auf den thermischen Cycler, der auf 98 Grad Celsius vorgewärmt wurde.

Programmieren Sie den thermischen Cycler, wie im Herstellerprotokoll vorgeschlagen, mit der Zyklusnummer auf 15 geändert. Halten Sie die Probe nach Abschluss bei vier Grad Celsius. Gehen Oder lagern Sie bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung.

Um die gebundene kostenlose DNA zu reinigen, fügen Sie zehn Mikroliter des DNA-Ladefarbstoffs zu jeder kostenlosen DNA-Probe hinzu. Und auf zehn Mikroliter der hochauflösenden letzteren und kundenspezifischen RNA letztere. Führen Sie 30 Mikroliter jeder Probe in zwei getrennten Bahnen nebeneinander im sechs Prozent TBE Polyacrylamid-Gel.

Mit benutzerdefinierter RNA letztere und hochauflösende letztere, der Zwischenraum zwischen den beiden verschiedenen Proben. Führen Sie das Gel in einem X TBE Puffer bei 145 Volt für ca. 30 bis 40 Minuten aus. Behalten Sie den Überblick über die untere blaue Vorderseite des Ladefarbstoffs.

Stoppen Sie die Elektrophorese, wenn sie sich der Unterseite des Gels nähert. Übertragen Sie das Gel in einem X TBE Puffer mit 5 Mikrogramm pro Millimeter Ethidiumbromid. Visualisieren Sie das Gel in einem Transilluminator und schneiden Sie das Gel genau zwischen den 145 Basispaar- und 160 Basispaarmarkern und etwas über dem 145-Basispaar-Marker, um eine Kontamination mit Adapter-Dimer zu vermeiden.

Ein kritischer Schritt ist die Reinigung ligted CDNA, die durch Schneiden des Gels genau als Adapter Dimer laufen sehr lose auf die gewünschte Marke durchgeführt wird. Übertragen Sie die Gelstücke in DNA-Bruchrohre, die in zwei Millimeter nammelnden Rohren aufbewahrt werden. Drehen Sie bei 20 Tausend Mal G für zwei Minuten.

Und fügen Sie dreihundert Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu und lassen Sie es sanft auf einer Wippe über Nacht bei Raumtemperatur drehen. Um die DNA-Ausfällung am nächsten Tag durchzuführen, übertragen Sie den Inhalt des Rohres auf 5 Mikron Filterröhren. Drehen Sie 600 mal G für streng zehn Sekunden.

Dann fügen Sie zwei Mikroliter Glykogen dreißig Mikroliter von drei Molaren-Natriumacetat, 1X Pelletfarbe, und 975 Mikroliter von 100 Prozent Ethanol zu eluierten DNA. Drehen Sie bei 17.000 mal G bei 4 Grad Celsius für 20 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 75 Prozent Ethanol hinzu, um das Pellet zu waschen.

Nach dem Spinnen bei 17 Tausend Mal G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten entsorgen Sie den Überstand und inkubieren die Rohre bei 37 Grad Celsius auf einem thermischen Block vollständig verdampfen das Ethanol. Das Pellet mit 12 Mikrolitern 10 Millimolar-Triciderchlorid bei PH 8.5 wieder aufsetzen. Als nächstes führen Sie eine Bibliotheksqualitätsprüfung durch, indem Sie die gereinigte und kostenlose DNA zehnmal verdünnen und einen Mikroliter der verdünnten CDNA verwenden, um auf einem Bioanalyzer zu laufen.

Stellen Sie sicher, dass die kostenlose DNA-Produktgröße dem Bereich der kleinen RNA im Elektropherogramm zwischen 136 und 160 Basenpaaren entspricht. Berechnen Sie die Gesamtmolarität für jede Probe. Normalisieren Sie jede Probe auf 2 Nanomolar mit dem Trishydrochlorid bei PH 8.5.

Halten Sie die Bibliotheken, indem Sie gleiche Volumina jeder zwei nanomolaren Proben in einem einzigen zweihundert Mikroliter-PCR-Rohr mischen. Denatur und Reihenfolge nach den Schritten, wie im Manuskript beschrieben. In dieser Studie wurde die Bibliothek nach der RNA-Isolierung vorbereitet und eine Qualitätsprüfung durchgeführt.

Die Produktgröße für Adapter-ligted Micro Rnase entsprach etwa 136 bis 160 Basispaaren für jede Probe. Die hervorgehobenen Abschnitte zeigen den Bereich des Gels, das für kleine RNA-Bibliothek der Vorbereitung genau ausgeschnitten wurde. Diese Abbildung zeigt die Gelelektrophorese und Elektropherogramme für die gereinigte kostenlose DNA-Bibliothek.

Mikroseziertes FFPE-Gewebe und Serum abgeleitete Eves. Die repräsentativen Metriken aus einem kleinen RNA-Sequenzierungslauf zeigen die erwartete Clusterdichte, Q-Score, Cluster-Passing-Filter-Prozentsatz und die geschätzte Ausbeute und Fehlerraten für mikroseziertes FFP-Gewebe und Serum abgeleitete EVs. Der Q-Wert in beiden Stichproben zeigte einen Wert über drei, der 99,9 Prozent der Basisrufgenauigkeit angibt.

Und die Fehlerquoten lagen alle unter einem. Jeder Schritt in der Bibliotheksvorbereitung sollte sorgfältig ausgeführt werden und Rohre sollten sofort nach jeder Inkubation auf Eis übertragen werden. Ein wichtiger Schritt im Protokoll ist das präzise Schneiden des Gels, um sicherzustellen, dass Sie eine Adapter-Dimer-freie und reine CDNA-Bibliothek haben.

Das Generieren der CDNA-Bibliothek erfordert eine Optimierung für einen qualitativ hochwertigen Sequenzierungslauf. Das Verständnis dieses Protokolls wird den Zuschauern helfen, diese kleinsten Details auf andere Sequenzierungsbibliotheksvorbereitungen aus begrenzten Quellbeispielen zu extrapolieren, die Serum und extrazelluläre Vesikel vorschlagen. Diese Technik hat uns geholfen, neue Mikronase zu identifizieren, die mit Tumoraggressivität und Therapieresistenz bei patiententem Darmkrebs assoziiert sind.

Diese Techniken können auf andere Krankheitstypen extrapoliert werden, die bei der Entdeckung von neuartigen Biomarkern helfen können. Da bei dieser Technik biologische Materialien wie Striation abgeleitetes Serum und Gewebeproben verwendet werden, sollte man entsprechende Vorsichtsmaßnahmen treffen. Darüber hinaus ist Ethidiumbromid ein bekanntes Karzinogen und sollte sehr sorgfältig mit diesem Protokoll behandelt werden.