Name: In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Erfahren Sie die Isolation von Epithelzellen aus drei anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Heterogenität für klinische Anwendungen.

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Unsere Forschung wurde durch Stipendien des Instituto Nacional de Perinatologa de México (21041 und 21081) und CONACYT (A1-S-8450 und 252756) unterstützt. Wir danken Jessica Gonzalez Norris und Lidia Yuriria Paredes Vivas für die technische Unterstützung.

Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission des Instituto Nacional de Perinatologa in Mexiko-Stadt (Registernummer 212250-21041) gebilligt. Alle in diesen Studien durchgeführten Verfahren entsprachen den ethischen Standards des Instituto Nacional de Perinatologa, der Erklärung von Helsinki und den Leitlinien des offiziellen mexikanischen Standards des Gesundheitsministeriums.
1. Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie eine Lösung von 1x PBS mit EDTA vor. Fügen Sie dazu 500 l 0,5 M EDTA-Bestand in 500 ml 1x PBS für eine Endkonzentration von 0,5 mM EDTA hinzu.</li>
	<li>Bereiten Sie das Kulturmedium für HAEC vor. Nehmen Sie 450 ml hochglucose-DMEM, ergänzen Sie es mit 5 ml Natriumpyruvat (100 mM), 50 ml hitzeinaktivem fetalem Rinderserum, das für Stammzellen qualifiziert ist, 5 ml nicht essentieller Aminosäuren (100x), 5 ml Antibiotikum (100x), 5 ml L-Glutamin (200 mM) und 500 l Mercaptoethanol (1.000x).</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Behälter für den Transport und die Verarbeitung des Gewebes: ein Edelstahlbehälter mit Deckel, um die gesamte Plazenta vom Operationssaal zum Labor zu transportieren, ein Tablett (20 cm x 30 cm x 8 cm), um Blut vor der ganzen Plazenta zu waschen und zu entfernen die Zerlegung der Fruchtwassermembran und ein Kunststoff-Schneidebrett, um die Fruchtwassermembran in die drei Regionen zu trennen.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente (Skalpelle, Scheren, Zangen und Klemmen), 500 ml Becher, Baumwoll-Gauzunden und Eine Saline-Lösung.</li>
</ol>2. Erhalt von Plazentagewebe
HINWEIS: Die Fruchtwassermembranen wurden von Frauen bei vollwertiger Trächtigkeit (37 bis 40 Wochen) unter Angabe der Kaiserschnitt-Entbindung ohne Anzeichen einer aktiven Arbeit und ohne mikrobiologische Infektionsmerkmale gewonnen. Die vollständigen Isolations- und Kulturverfahren wurden in einem Biosicherheitskabinett unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>Klemmen Sie im Operationssaal die Nabelschnur, um den Blutfluss zum Rest des Gewebes zu verhindern. Sammeln Sie die gesamte Plazenta mit der Nabelschnur, die im sterilen Behälter eingeklemmt ist.</li>
	<li>Fügen Sie 500 ml Salinelösung in den Behälter, um die Plazenta zu hydratisieren.</li>
	<li>Schließen Sie den Behälter und transportieren Sie das Gewebe bei Raumtemperatur ins Labor.</li>
	<li>Legen Sie den Behälter mit der Plazenta in den Biosicherheitsschrank. HINWEIS: Falls die Zerlegung nicht innerhalb von 15 min nach dem Sammeln der Plazenta durchgeführt wird, lagern Sie den Behälter mit der Plazenta auf Eis bis zur Verarbeitung. Vermeiden Sie mehr als 1 h verstrichene Zeit zwischen dem Erhalt der Plazenta und dem Beginn der Zerlegung.</li>
</ol>3. Mechanische Trennung pro Bereich der Fruchtwassermembran
HINWEIS: Das Verfahren muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen und bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
<ol><li>Entfernen Sie die gesamte Plazenta aus dem Behälter und legen Sie sie auf das Tablett mit der Nabelschnur nach oben.</li>
	<li>Reinigen Sie die Blutgerinnsel mit einer sterilen Baumwollgaze von der Oberfläche des Chorion-Amnions, das die Plazenta bedeckt.</li>
	<li>Identifizieren Sie die drei Regionen der Membran: das Nabelam, das die Nabelschnur umhüllt, die Plazenta-Amnion, die die Decidua basalis bedeckt, und die reflektierte Region, die der Rest des Amnions ist, das nicht an der Plazenta befestigt ist (Abbildung 1).</li>
	<li>Sezieren Sie die Nabelamnionregion (Abbildung 2A).<ol>
<li>Halten Sie mit Sezieren von Zangen den Teil der Amnionmembran, der die Kreuzung von Plazenta und Nabelschnur bedeckt.</li>
		<li>Mit einem Skalpell sezieren Sie die Region, die die Schnur umgibt, während Sie sich strecken, um sie vom Chorion zu trennen.</li>
		<li>Legen Sie das abgetrennte Gewebe in einem markierten Becher mit 100 ml Salinelösung ab.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sezieren Sie die Plazenta-Amnion-Region (Abbildung 2B).<ol>
<li>Mit einer sterilen Baumwollgaze, entfernen Sie die Blutgerinnsel von der Oberfläche des Chorion-Amnion, das die Plazenta bedeckt.</li>
		<li>Halten Sie die Membran an der Grenze zwischen der Plazenta und der reflektierten Region mit sezierenden Zangen.</li>
		<li>Schneiden Sie entlang des Umfangs der Plazenta mit dem Skalpell.</li>
		<li>Trennen Sie die Plazenta Amnion von der Chorion, achten Sie darauf, keine Gefäße aus der Plazenta zu schneiden.</li>
		<li>Legen Sie das abgetrennte Gewebe in einen anderen beschrifteten Becher mit 300 ml Salinelösung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trennen Sie den Rest der Fruchtwassermembran, die nicht an der Plazenta (d. h. dem reflektierten Teil) befestigt ist, von der Choreographie (Abbildung 2C).<ol>
<li>Sammeln Sie die reflektierte Region in einem anderen beschrifteten Becher mit 300 ml Saline-Lösung. HINWEIS: Fügen Sie während der Zerlegung kontinuierlich eine Salinelösung hinzu, um das Austrocknen des Gewebes zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Waschen der Membranen
HINWEIS: Das Verfahren muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
<ol><li>Entsorgen Sie die Salinelösung jedes Membranbereichs separat.</li>
	<li>Fügen Sie 100 ml frische Salinelösung in die Nabelregion.</li>
	<li>Fügen Sie 300 ml frische Salinelösung in die Plazenta- bzw. reflektierten Regionen ein.</li>
	<li>Rühren Sie die Membranen mit Hilfe von Sezieren Zangen, um Blutrückstände zu entfernen.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Saline-Lösung.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Wässer und die Rührung mindestens 3x, bis die Membranen durchscheinend sind.</li>
	<li>Legen sie die Membranen auf das Brett und verlängern Sie sie, um die Blutgerinnsel, die nicht mit den Wässen entfernt wurden, mit sterilem Gaze zu reinigen. HINWEIS: Es ist sehr wichtig, so viele Erythrozyten wie möglich zu entfernen, da ihre Anwesenheit die Trypsin-Funktion und die Lebensfähigkeit nachfolgender Zellkulturen beeinflusst.</li>
</ol>5. Enzymatische Verdauung der Membranen aus verschiedenen Regionen
HINWEIS: Das Verfahren muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
<ol><li>Schneiden Sie die reflektierten und plazentten Bereiche in zwei oder drei Fragmente.</li>
	<li>Schneiden Sie nicht die Nabelregion.</li>
	<li>Platzieren Sie die Fragmente jeder Region in Zentrifugenrohren. Fügen Sie 20 ml 0,5% Trypsin/EDTA zu den reflektierten und plazentaregionen und 5 ml mit 0,5% Trypsin/EDTA in die Nabelregion ein. HINWEIS: Es ist wichtig, die reflektierten und plazentten Bereiche in kleinere Stücke zu schneiden, da sie vollständig in die Trypsin-Lösung eingetaucht werden müssen.</li>
	<li>Die Zentrifugenrohre 30 s leicht schütteln. Trypsin entsorgen.</li>
	<li>Fügen Sie 30 ml neues 0,5% Trypsin/EDTA zu den reflektierten und plazentaregionen und 15 ml neuer 0,5% Trypsin/EDTA in die Nabelregion ein.</li>
	<li>Legen Sie die Rohre in einen Rotator im Inkubator.</li>
	<li>Inkubieren mit Drehung (20 Rpm) für 40 min bei 37 °C. HINWEIS: Wenn kein Rohrrotator verfügbar ist, schütteln Sie die Rohre alle 10 min leicht manuell.</li>
	<li>Übertragen Sie die Trypsin/Zelllösungen aus jeder Region in neue Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 2x das Volumen der HAEC-Medien bei 37 °C pro Tube vorgewärmt, um das Enzym zu inaktivieren.</li>
	<li>Die erste Verdauung auf Eis aufbewahren.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.6 x 5.8 für eine zweite Verdauungsphase.</li>
	<li>Halten Sie für jede Region ein Ende des Amnion-Anteils mit Sezieren von Zangen und mit einem anderen Paar, das entlang des Gewebes drückt, um Reihen von Epithelzellen zu entfernen, die sich während früherer Inkubationsperioden nicht vollständig abblätterten.</li>
	<li>Sammeln Sie die zweite Verdauung in einen anderen Satz zentrifugenröhren und inaktivieren Sie mit 2x dem Volumen von HAEC-Medien.</li>
	<li>Entsorgen Sie die verdauten Membranen in einen Biogefährdungsbehälter.</li>
</ol>6. Isolierung des HAEC
HINWEIS: Das Verfahren muss in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
<ol><li>Zentrifugieren Sie alle Rohre bei 200 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml vorgewärmte HAEC-Medien (bis 37 °C) pro Rohr und Pipette sanft hinzu, um jedes Pellet zu disaggregieren.</li>
	<li>Kombinieren Sie die zellulären Suspensionen der beiden Verdauungen in einer einzelnen Röhre für jede Membranregion.</li>
	<li>Filtern Sie die zellulären Suspensionen mit 100 m Zellsieben, um den extrazellulären Matrixmüll zu entfernen und einzelne Zellen zu erhalten.</li>
	<li>Bereiten Sie drei Aliquots mit 90 l Trypanblau in einem Mikrozentrifugenrohr vor.</li>
	<li>Fügen Sie 10 l jeder Zellsuspension pro Membranregion in die Mikrozentrifugenröhrchen ein und mischen Sie sie.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer unter einem Lichtfeldmikroskop.</li>
</ol>7. Kultur der HAEC
<ol><li>Säen Sie die HAEC aus den drei Regionen getrennt mit einer Dichte von 3 x 104 Zellen/cm2 mit vorgewärmten HAEC-Medien, ergänzt durch 10 ng/ml des humanen epidermalen Wachstumsfaktors (EGF).<ol>
<li>Säen Sie die Zellen in 100 mm Platten, um sie in vitro oder in 24 Brunnenplatten für die immunchemische Analyse zu halten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 °C unter normoxischen Bedingungen (5%CO2) in einem befeuchteten Inkubator.</li>
	<li>Fügen Sie eGF täglich hinzu und wechseln Sie das Medium jeden dritten Tag. HINWEIS: Die Zellen werden nach 4 bis 6 Tagen konfluent.</li>
	<li>Verwenden Sie die Zellen für die konventionelle Immunhistochemie, Zellsortierungsanalyse, Kryokonservierung, RNA- und Proteinextraktion oder um den Durchgang fortzusetzen.</li>
</ol>8. Passage von HAEC
<ol><li>Entfernen Sie das HAEC-Medium und waschen Sie 2x mit PBS/EDTA 0.01M Lösung.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit einer PBS/EDTA 0,01M Lösung für 15 min bei 37 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie die PBS/EDTA und fügen Sie 1,5 ml 0,5% Trypsin/EDTA hinzu.</li>
	<li>5 x 8 min bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Inaktivieren Sie das Enzym mit zwei Bänden HAEC-Medien.</li>
	<li>Sammeln Sie die gemischte Lösung und Zentrifuge für 5 min bei 200 x g.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen und fahren Sie mit folgenden Passagen fort oder verwenden Sie die Zellen für die weitere Analyse.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir haben ein neues Protokoll implementiert, um HAEC von Termmembranen zu isolieren. Es unterscheidet sich von früheren Berichten dadurch, dass jede Membran vor der Isolierung in ihre drei anatomischen Bereiche unterteilt wurde, um Zellen von jedem zu analysieren.
Einer der kritischsten Schritte im Protokoll ist das Waschen der Membran, um alle Blutgerinnsel zu entfernen, da sie die Aktivität von Trypsin bei der Trennung der Epithelzellen stören können. Wenn dieser Schritt nicht ordnungsgemäß ...

Menschliche Fruchtiotische Epithelzellen (HAEC) entstehen in den frühen Stadien der embryonalen Entwicklung, etwa acht Tage nach der Befruchtung. Sie entstehen aus einer Population von Plattenepithelzellen des Epiblasts, die sich aus der innersten Schicht der Fruchtwassermembran1ableiten. So gelten HAEC als Reste pluripotenter Zellen aus dem Epiblast, die das Potenzial haben, sich in die drei Keimschichten desEmbryos 2zu differenzieren. In den letzten zehn Jahren haben verschiedene Forschungsgruppen Methoden entwickelt, um diese Zellen aus der Fruchtwassermembran zum Term der Trächtigkeit zu isolieren, um ihre mutmaßlichen pluripotenzbedingten Eigenschaften in einem Kulturmodell in vitro3,4zu charakterisieren.
Dementsprechend wurde festgestellt, dass HAEC-Merkmale, die für humane pluripotente Stammzellen (HPSC) charakteristisch sind, wie die Oberflächenantigene SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; der Kern der Pluripotenz-Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2 und NANOG; und der Proliferationsmarker KI67, was darauf hindeutet, dass sie sich selbsterneuern5,6,7. Darüber hinaus wurden diese Zellen mit Differenzierungsprotokollen herausgefordert, um Zellen positiv für linienspezifische Marker der drei Keimschichten (Ektoderm, Mesoderm und Endoderm)4,5,8, sowie in Tiermodellen menschlicher Krankheiten zu erhalten. Schließlich, HAEC Express E-Cadherin, die zeigen, dass sie eine epitheliale Natur ähnlich wie die HPSC5,9behalten.
Abgesehen von ihrem embryonalen Ursprung haben HAEC andere intrinsische Eigenschaften, die sie für verschiedene klinische Anwendungen geeignet machen, wie die Sekretion von entzündungshemmenden und antibakteriellen Molekülen10,11, Wachstumsfaktoren und Zytokinfreisetzung12, keine Bildung von Teratomen, wenn sie in immundefizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizizide Mäuse im Gegensatz zu HPSC2transplantiert werden, und immunologische Toleranz, weil sie HLA-G ausdrücken, was das Risiko der Abstoßung nach Transplantation13.
Frühere Berichte gingen jedoch davon aus, dass das menschliche Amnion eine homogene Membran ist, ohne zu berücksichtigen, dass es anatomisch und physiologisch in drei Regionen unterteilt werden kann: Plazenta (das Amnion, das die Decidua basalisbedeckt), Nabel (der Teil, der die Nabelschnur umschließt) und reflektiert (der Rest der Membran nicht an der Plazenta befestigt)14. Es wurde gezeigt, dass die Plazenta- und reflektierten Regionen des Amnion Unterschiede in der Morphologie, mitochondrialen Aktivität, Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies15, miRNA-Expression16und Aktivierung von Signalwegen17zeigen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das menschliche Amnion von einer heterogenen Population mit unterschiedlicher Funktionalität integriert wird, die für weitere Studien in In-situ- oder In-vitro-Modellen in Betracht gezogen werden sollte. Während andere Laboratorien Protokolle für die Isolierung von HAEC von der gesamten Membran entwickelt haben, hat unser Labor ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und Charakterisierung von Zellen aus verschiedenen anatomischen Regionen erstellt.

<table><tbody><tr><td>Culture Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM</td></tr><tr><td>tierversuchsfrei rekombinant human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>15240062</td><td>100X</td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>12430054</td><td>Ergänzt mit hohem Glukose- und HEPESGEHALT</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific/Ambion</td><td>AM9260G</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>embryonale Stammzellen FBS, qualifiziert</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>10439024</td><td></td></tr><tr><td>nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>11140050</td><td>100X</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>10010023</td><td>1X</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung (Natriumchlorid 0,9%)</td><td>jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>11360070</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 0,05</td>%<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td><stark> Einwegmaterial</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 & Mikro; m Cell Strainer</td><td>Corning/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-behandelte Kulturschale</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Clear-TC-behandelte Multi-Well-Platten</td><td>Corning/Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Clear-TC-behandelte Multi-Well-Platten</td><td>Corning/Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-pyrogenes steriles Zentrifugenröhrchen</td><td>jeder Marke</td><td></td><td>mit konischen unten</td></tr><tr><td>Pyrogenfreie sterile Spitzen von 1.000 &; Mikro; L, 200 &Mikro; l und 10 &micro;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Baumwollgaze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile serologische Pipetten von 5, 10 und 25 ml</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile OP-Handschuhe</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>Ausrüstung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Pipettenfüller/-spender</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Becher von 500 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriles Schneidebrett</td><td></td><td></td><td></td>aus Kunststoff</tr><tr><td>Sterile Skalpelle, Scheren, Pinzetten, Klemmen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriler Behälter</td><td></td><td></td><td></td> aus Edelstahl</tr><tr><td>Steriles Tablett</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>MaCSmix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antikörper und Kits</td><td></td><td></td><td>Antikörper-ID</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>RRID:AB_3975</td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>Santa Cruz</td><td>23900</td><td>RRID:AB_627859)</td></tr><tr><td>Anti-NANOG</td><td>Peprotech</td><td>500-P236</td><td>RRID:AB_1268274</td></tr><tr><td>Anti-OCT4</td><td>Abcam</td><td>AB19857</td><td>RRID:AB_44517</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Millipore</td><td>AB5603</td><td>RRID:AB_2286686</td></tr><tr><td>Anti-SSEA-4</td><td>Zellsignalisierung</td><td>4755</td><td>RRID:AB_1264259</td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60</td><td>Zellsignalisierung</td><td>4746</td><td>RRID:AB_2119059</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11029</td><td>RRID:AB_2534088</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11036</td><td>RRID:AB_10563566</td></tr><tr><td>Tunel Assay Kit</td><td>Abcam</td><td>66110</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro kultur von epithelzellen aus verschiedenen anatomischen regionen der menschlichen amnionmembran

In Vitro Culture of Epithelial Cells from Different Anatomical Regions of the Human Amniotic Membrane

In der Literatur wurden mehrere Protokolle zur Isolierung und Kultur menschlicher Fruchtwasserepithelzellen (HAEC) berichtet. Diese gehen jedoch davon aus, dass es sich bei dem Fruchtioziumepithel um eine homogene Schicht handelt. Das menschliche Amnion kann in drei anatomische Regionen unterteilt werden: reflektiert, Plazenta und Nabel. Jede Region hat unterschiedliche physiologische Rollen, z. B. in pathologischen Bedingungen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um menschliches Amniongewebe in drei Abschnitten zu sezieren und in vitro zu pflegen. In der Kultur zeigten Zellen, die aus dem reflektierten Amnion abgeleitet wurden, eine quakodeale Morphologie, während Zellen aus Plazenta- und Nabelregionen plattenförmig waren. Nichtsdestotrotz haben alle erhaltenen Zellen einen epitheliale Phänotyp, der durch die Immundetektion von E-Cadherin nachgewiesen wird. Da sich die Plazenta- und reflektierten Regionen vor Ort in zellulären Komponenten und molekularen Funktionen unterscheiden, kann es daher für In-vitro-Studien notwendig sein, diese Unterschiede zu berücksichtigen, da sie physiologische Auswirkungen auf die Verwendung von HAEC in biomedizinische Forschung und die vielversprechende Anwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin.

HAEC wurden aus jedem der drei anatomischen Regionen der Fruchtwassermembran isoliert und in vitro einzeln kultiviert. Nach 48 h Kultur hafteten Zellen mit einem epithelialen Phänotyp an der Oberfläche der Platte, obwohl die Medien auch Zellablagerungen und schwimmende Zellen enthielten, die nach der Änderung des Mediums entfernt wurden(Abbildung 3).
Während der Verarbeitung der Primärkultur (Durchgang Null, P0) können einige Komplikationen auftreten, die die expe...

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Fruchtwassermembran, um deren Heterogenität und funktionelle Eigenschaften für eine mögliche Anwendung in klinischen und physiopathologischen Modellen zu bestimmen.

In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran

Several protocols have been reported in the literature for the isolation and culture of human amniotic epithelial cells (HAEC). However, these assume that ...

Dieses Protokoll kann helfen, wichtige Fragen über Heterogenität und funktionelle Eigenschaften menschlicher Fruchtieinerepithelzellen zu beantworten, die aus der Fruchtwassermembran isoliert sind. Während frühere Protokolle Zellen aus der ko-amniotischen Membran isolierten, ohne zwischen den Regionen zu unterscheiden, erlaubt unser Protokoll die Kultur der Zellpopulation, die aus drei verschiedenen anatomischen Regionen isoliert ist. Um die Fruchtwassermembran nach Region zu trennen, in einem Biosicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen, identifizieren Sie das Nabelam, das die Nabelschnur umhüllt, die Plazenta-Amnion, die die Decidua basalis bedeckt, und die reflektierte Region, die als der Rest des Amnions betrachtet wird, das nicht an der Plazenta befestigt ist.Um die Nabelamnionregion zu sezieren, verwenden Sie Sezieren von Zangen, um den Teil der Amnionmembran zu halten, der die Kreuzung der Plazenta und der Nabelschnur bedeckt, und verwenden Sie ein Skalpell, um die Region zu sezieren, die die Schnur umgibt, während sie sich streckt, um den Bereich von der Chorion zu trennen. Dann legen Sie das getrennte Gewebe in einem markierten Becher mit 100 Milliliter naline Lösung ab. Um die Plazenta-Amnion-Region zu sezieren, verwenden Sie eine sterile Baumwollgaze, um die Blutgerinnsel von der Oberfläche des Chorions/Amnions zu entfernen, das die Plazenta bedeckt.Und verwenden Sie sezierende Zangen, um die Membran an der Grenze zwischen der Plazenta und der reflektierten Region zu erfassen. Verwenden Sie ein Skalpell entlang des Umfangs der Plazenta zu schneiden und trennen Sie die Plazenta Amnion von der Chorion, achten Sie darauf, keine Gefäße aus der Plazenta zu schneiden. Legen Sie das abgetrennte Gewebe in einen anderen beschrifteten Becher mit 300 Milliliter neiner Salinelösung.Und trennen Sie den Rest der Fruchtwassermembran, die nicht an der Plazenta befestigt ist, von der Chorion. Legen Sie dann die reflektierte Region in einen anderen beschrifteten Becher mit 300 Milliliter naline Lösung. Um die Membranen zu waschen, verwenden Sie eine Pinzette, um sie auf eine sterile Oberfläche zu legen, um die Saline-Lösung aus jedem Behälter mit Gewebe zu entsorgen.Legen Sie die Membranen wieder in den Behälter und fügen Sie 100 Milliliter frische Salinelösung in die Nabelregion und 300 Milliliter frischer Salinelösung in die Plazenta- und reflektierten Regionen. Verwenden Sie Sezieren der Zangen, um die Membranen zu rühren, um alle Blutrückstände zu entfernen und legen Sie die Membranen auf die sterile Oberfläche, um die Saline-Lösungen zu entsorgen. Dann waschen Sie die Membranen mindestens zwei weitere Male, wie gerade gezeigt, bis das Gewebe durchscheinend ist.Zur enzymatischen Verdauung der verschiedenen Fruchtwassermembranregionen die reflektierten und plazentten Regionen in zwei oder drei Fragmente schneiden. Und legen Sie die Fragmente und den Nabelbereich in einzelne 50-Milliliter-Zentrifugenröhren. Fügen Sie 20 Milliliter 0,5%Trypsin-EDTA zu jeder Röhre von reflektierten und plazentaförmigen Gewebefragmenten und fünf Milliliter 0,5%Trypsin-EDTA in die Röhre, die das Nabelbereichsgewebe enthält.Schütteln Sie die Rohre 30 Sekunden lang sanft. Dann legen Sie die Membranen auf eine sterile Oberfläche, entsorgen Sie die Trypsin-EDTA-Lösung und ersetzen Sie sie durch 30 Milliliter frische0,5%Trypsin-EDTA für die reflektierten und plazentaförmigen Gewebefragmente und 15 Milliliter frische0,5%Trypsin-EDTA für das Nabelbereichsgewebe. Legen Sie die Rohre dann in einem Rotator in einem Inkubator für eine 40-minütige Drehung bei 20 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius.Übertragen Sie am Ende der Inkubation das gesamte Volumen der Zelllösung in neue konische Röhren. Und fügen Sie das Zweifache des Volumens von 37-Grad-Celsius menschlichen AE-Zellen medium zu jeder Röhre auf Eis hinzu. Verdauen Sie alle übrig gebliebenen Gewebefragmente in den Originalröhren mit frischen 0,5%Trypsin-EDTA, wie gerade gezeigt.Verwenden Sie am Ende der zweiten Verdauung ein Paar sezierender Zangen, um ein Ende des Amnion-Anteils zu halten, und ein zweites Paar sezierender Zangen, um entlang des verbleibenden Gewebes zu quetschen, um alle Reihen von Epithelzellen zu entfernen, die sich während der vorherigen Inkubationsperioden nicht vollständig abblätterten. Entfernen Sie dann die Membranen, um die zweite Verdauungslösung auf einen zweiten Satz Zentrifugenrohre übertragen zu können. Und inaktivieren Sie die Verdauungsenzyme mit dem zweifachen Volumen des frischen 37-Grad-Celsius-Human-AE-Zellmediums auf Eis.Für die Isolierung menschlicher AE-Zellen, SedimentdieZellen durch Zentrifugation. Und setzen Sie das Pellet in jedem Rohr mit 10 Milliliter frisches 37-Grad-Celsius menschliches AE-Zellmedium wieder auf. Ziehen Sie jedes Paar Verdauungsteile in ein einziges Rohr und filtern Sie die Suspensionen durch 100-Mikrometer-Siebe, um extrazelluläre Matrix-Trümmer zu entfernen.Nach dem Zählen säen Sie die menschlichen AE-Zellen aus jeder der drei Regionen in einzelne 100-Millimeter-Platten mit einer dreimal 10 bis vierten Zelle pro Zentimeter quadratischer Konzentration in 37-Grad-Celsius-Human-AE-Zellmedium, ergänzt mit 10 Nanogramm pro Milliliter des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktors. Dann inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius unter normoxischen Bedingungen in einem befeuchteten Inkubator bis zur nachgelagerten Analyse des Interesses. Nach 48 Stunden Kultur haften menschliche AE-Zellen mit einem epitheliale phänotypischen Anhaftungsfraktions, während der Überstand Zellablagerungen und schwimmende Zellen enthält, die entfernt werden können, sobald das Medium gewechselt wird.Es ist ratsam, die Kulturen zu verwerfen und eine andere Membran zu verarbeiten, wenn das Vorhandensein von bakteriellen Kontaminationen, übermäßigen Erythrozyten aufgrund unzureichender Waschen der Membranen, mangelhaftoder nicht haftende Zellen oder Zellen mit einer Fibroblastenmorphologie identifiziert wird. Die Morphologie menschlicher AE-Zellen hängt vom Ursprung der Zellen ab, da Zellen aus der reflektierten Zone eine quakotale Morphologie zeigen und in einer gepflasterten Monoschicht wachsen, und Zellen aus den Plazenta- und Nabelregionen flacher und plattenförmiger sind. Die Immunfluoreszenz gegen E-Cadherin zeigt, dass die Primärkulturen und Subkulturen ihren epitheliale Phänotyp beibehalten, was darauf hindeutet, dass es keine Kontamination eines anderen Zelltyps gibt.Darüber hinaus sind die Zellen lebensfähig, wie ihre Expression des Ki-67 Proliferationsmarkers belegt. Obwohl sich die Subpopulationen aus dem Amnion in ihrer Morphologie und Funktion unterscheiden, ändert sich der Ausdruck und die Präsenz des Kerns der Pluripotenzfaktoren in menschlichen AE-Zellen, die aus der Plazenta und reflektierten Regionen abgeleitet sind, nicht. Da menschliche Fruchtiozienepithelzellen eine mögliche Quelle pluripotenter Stammzellen sind, können wir sie durch eine Reihe spezifischer Definitionsprotokolle herausfordern, um zu klären, ob diese Zellen aus jeder Region unterschiedliche Potenziale haben.Überprüfen Sie vor einem begonnenen Protokoll die Krankengeschichte des Patienten, um sicherzustellen, dass das Gewebe keine mikrobiologischen Merkmale einer Infektion aufweist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eine schnelle und robuste Lösung zur Isolierung von lebensfähigen Erwachsenen epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut beschrieben wird. Das Verfahren nutzt enzymatische Verdauung der Haut Kollagen-Matrix, durch Zupfen der Haarfollikel und Isolierung von einzelnen Zellsuspensionen oder Gewebestücke für die Zellkultur gefolgt.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

Ein Verfahren für die menschliche Brust OP discard Material verarbeiten beschrieben. Verarbeiteten Gewebe, in Form von Organoiden kann unbegrenzt gelagert oder eingefroren platziert in Kultur für langfristige Wachstum werden. Dieses Verfahren ermöglicht die experimentelle Überprüfung der normalen humanen epithelialen Zellbiologie, und die Wirkungen von exogen Störungen.

Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur

Nasen Epithelzellen, durch oberflächliche Schürf Biopsie der menschlichen Freiwilligen erhalten, werden erweitert und auf Gewebekultureinsätze übertragen. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen an der Luft Flüssigkeit-Grenzfläche angebaut, was Kulturen der Wimper und nicht-Geißelzellen. Differenzierte Nasen epithelialen Zellkulturen bieten tragfähige experimentelle Modelle für die Untersuchung der Schleimhaut der Atemwege.

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von humanen Amnionenepithelzellen (hAECs) unter Verwendung von Reagenzien ohne tierische Produkte in Übereinstimmung mit den aktuellen Richtlinien der guten Herstellungspraxis (cGMP).

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Diese Handschrift beschreibt eine weiche Lithographie-basierte Technik einheitlichen Arrays von dreidimensionalen (3D) Epithelgewebe definierter Geometrie durch extrazelluläre Matrix umgeben zu konstruieren. Dieses Verfahren ist offen für eine große Vielfalt von Zelltypen und experimentelle Kontexten und ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von identischen Replikaten.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Diese Studie stellt eine standardisierte und validierte Methode zur Isolierung und Kultur der primären Maus endometrial Stroma und Epithelzellen, die in einer Co - Kultur - System verwendet werden kann , in vitro decidualization zu studieren.

Isolierung von Maus Endometrial Epithelial und Stromazellen für<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Dieses Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von primären amniotische Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen in induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung eines nicht-Integration von episomal Ansatzes in vollem Umfang chemisch definierten Bedingungen. Verfahren der Gewinnung, Kultur, Neuprogrammierung und Charakterisierung der daraus resultierenden induzierten pluripotenten Stammzellen durch strenge Methoden werden detailliert beschrieben.

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Isolierung und Kultur menschlicher Zahnfleischepithelzellen vor, indem wir den Rock-Inhibitor Y-27632 zur traditionellen Methode hinzufügen. Diese Methode ist einfacher, weniger zeitaufwendig, verbessert die Stammzelleigenschaften und produziert eine größere Anzahl von Epithelzellen mit hohem Potenzial sowohl für das Labor als auch für klinische Anwendungen.

Isolierung und Kultur primärer humaner Zahnfleischepithelzellen mit Y-27632

Jüngste Fortschritte bei humaninduzierten pluripotenten Stammzelldifferenzierungsprotokollen ermöglichen die schrittweise Ableitung organspezifischer Zelltypen. Hier stellen wir detaillierte Schritte zur Erhaltung und Expansion von iPSC-abgeleiteten Atemwegsbasalzellen und deren Differenzierung zu einem mukoziliären Epithel in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen zur Verfügung.

Erzeugung von Atemwegs-Epithelzell-Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Hier zeigen wir, wie Epithelzellen, die mit Fibroblasten in dem nanofaserigen membranbasierten Zweischichtsystem kultiviert wurden, stabil an der Membran haften und auf ihr wachsen können.

Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

Erfahren Sie die Isolation von Epithelzellen aus drei anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Heterogenität für klinische Anwendungen.

In Vitro Kultur von Epithelzellen aus verschiedenen anatomischen Regionen der menschlichen Amnionmembran

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