Name: Verwendung des Pyrimidin-Analogons 5-Iod-2′-Desoxyuridin (IdU) mit Zellzyklusmarkern zur Etablierung von Zellzyklusphasen in einer Massenzytometrie-Plattform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Zellzyklusanalyse auf Einzelzellebene mit Massenzytometrie und IdU-Markierung. Diese einfache Methode ermöglicht die Untersuchung seltener Krebszellen und immunologischer Proliferation bei akuter myeloischer Leukämie.

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Die Autoren danken den Bemühungen von Palak Sekhri, Hussam Alkhalaileh, Hsiaochi Chang und Justin Lyeberger für ihre experimentelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das Pelotonia Fellowship Program unterstützt. Alle Meinungen, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die des Autors/der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die des Pelotonia-Stipendienprogramms wider."

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<li>Shabihkhani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+procurement%2C+storage%2C+and+quality+assurance+of+frozen+blood+and+tissue+biospecimens+in+pathology%2C+biorepository%2C+and+biobank+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings.</a> Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).</li>
</ol>

Dr. Behbehani erhält Reiseunterstützung von Fluidigm. Fluidigm hat auch Reagenzien und Materialien für den Laborgebrauch gekauft.

Die hier vorgestellten Beispiele zeigen, wie eine MCM-Plattform zur Analyse der Zellzyklusverteilung eingesetzt werden kann. Es hat sich auch gezeigt, dass die Zellzyklusanalyse empfindlich auf experimentelle Bedingungen wie Zeit und Temperatur reagiert, was eine wichtige Überlegung ist, die Forscher berücksichtigen müssen, wenn sie MCM für ihre Zellzyklusanalyse in Betracht ziehen14. Proben, die für einen kurzen Zeitraum, nicht länger als eine Stunde, gelagert werden, weisen eine IdU-Einarbeitung...

Die Massenzytometrie ermöglicht die Detektion von ca. 40 Parametern, indem sie die hohe Auflösung und quantitative Natur der Massenspektroskopie nutzt. Anstelle von Fluorophor-konjugierten Antikörpern werden metallmarkierte Antikörper verwendet, die eine höhere Anzahl von Kanälen ermöglichen und einen minimalen Spillovererzeugen 1,2. MCM hat Vor- und Nachteile in Bezug auf die Zellzyklusanalyse im Vergleich zur Durchflusszytometrie. Ein großer Vorteil von MCM besteht darin, dass die große Anzahl von Parametern die gleichzeitige Messung des Zellzykluszustands über eine große Anzahl immunphänotypisch unterschiedlicher T-Zelltypen in sehr heterogenen Proben ermöglicht. MCM wurde erfolgreich eingesetzt, um den Zellzykluszustand während der normalen Hämatopoese im menschlichen Knochenmark3 und transgenen Mausmodellen des Telomerasemangels4 zu messen. Die Analyse des Zellzykluszustands bei akuter myeloischer Leukämie (AML) zeigte, dass der Zellzyklus mit bekannten Reaktionen auf klinische Therapien korrelierte, was einen In-vivo-Einblick in funktionelle Merkmale lieferte, die die Therapieauswahl beeinflussen können5. Ein zweiter Vorteil der zytometrischen Massenanalyse des Zellzyklus ist die Möglichkeit, eine große Anzahl anderer funktioneller Marker zu messen, die mit dem Zellzykluszustand korreliert werden können. Neuere Arbeiten konnten die Protein- und RNA-Synthese mit dem Zellzykluszustand korrelieren, indem IdU und metallmarkierte Antikörper gegen BRU und rRNA6 verwendet wurden. Diese Art von hochparametrischer Analyse, die den Zellzykluszustand über zahlreiche Populationen hinweg in einem Kontinuum der Differenzierung misst, wäre mit der derzeitigen Durchflusszytometrie-Technologie nahezu unmöglich. Der größte Nachteil von MCM ist das Fehlen vergleichbarer DNA- oder RNA-Färbungen, wie sie in der Fluoreszenz-Durchflusszytometrie verwendet werden (z. B. DAPI, Hoechst, Pyronin Y usw.). Fluoreszenzfarbstoffe können relativ genaue Messungen des DNA- und RNA-Gehalts liefern, aber diese Präzision ist nur aufgrund der Änderungen der Fluoreszenzeigenschaften dieser Farbstoffe möglich, die bei der Interkalation zwischen Nukleotidbasen auftreten. Die MCM-Analyse ist daher nicht in der Lage, den DNA- oder RNA-Gehalt mit ähnlicher Präzision zu messen. Stattdessen stützt sich die zytometrische Massenzellzyklusanalyse auf Messungen von Proteinen, die mit dem Zellzykluszustand in Verbindung stehen, wie z. B. Cyclin B1, phosphoryliertes Retinoblastomprotein (pRb) und phosphoryliertes Histon H3 (pHH3) in Kombination mit der direkten Messung des Jodatoms aus dem Einbau von IdU in S-Phase-Zellen. Diese beiden Messansätze liefern während der normalen Zellproliferation sehr ähnliche Ergebnisse, können aber möglicherweise diskordant sein, wenn der Zellzyklus gestört ist.
Die Messung der Anzahl der Zellen in jeder Zellzyklusphase ist wichtig, um die normale Entwicklung des Zellzyklus sowie die Unterbrechung des Zellzyklus, die häufig bei Krebs und immunologischen Erkrankungen beobachtet wird, zu verstehen. MCM ermöglicht eine zuverlässige Messung von extrazellulären und intrazellulären Faktoren mit metallmarkierten Antikörpern. Die Messung der S-Phase war jedoch eingeschränkt, da der Iridium-basierte DNA-Interkalator nicht in der Lage war, zwischen 2N- und 4N-DNA zu unterscheiden. Um Zellzyklusphasen zu definieren, entwickelte Behbehani eine Methode, die IdU mit einer Masse von 127 verwendet, die in den Bereich des Massenzytometers fällt und eine direkte Messung von Zellen in S-Phase3 ermöglicht. Durch diese direkte Messung entfällt die Notwendigkeit von Sekundärantikörpern oder der Einsatz von DNA-Vergällungsmitteln wie Säure oder DNase. In Verbindung mit intrazellulären Zyklusmarkern ermöglicht es eine hohe Auflösung der Zellzyklusverteilung in experimentellen Modellen.
Dieses Protokoll adaptiert Zellzyklusmessungen von gängigen Durchflusszytometrieprotokollen für MCM. Unsere Methoden bieten eine bequeme und einfache Möglichkeit, Zellzyklusparameter einzubeziehen. Die Inkorporation von In-vitro-Proben erfordert nur 10 bis 15 Minuten Inkubationszeit bei 37 °C, was kürzer ist als bei den meisten BrdU-Färbeprotokollen, die Inkubationszeiten von mehreren Stunden empfehlen 3,7. IdU- und BrdU-inkorporierte Proben können mit einem proteomischen Stabilisator fixiert und dann für einige Zeit in einem -80 °C Gefrierschrank gelagert werden. Auf diese Weise kann eine große Anzahl von IdU-gefärbten Proben für die Chargenanalyse archiviert werden, ohne dass die Probenqualität beeinträchtigt wird.

<table><tbody><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td>Bestandteil der</td>CSM-Zentrifuge</tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td>Probenzentrifugation</td></tr><tr><td>gespalten-PARP (D214)</td><td>BD Biosciences</td><td>F21-852</td><td>Identifizierung apoptotischer Zellen</td></tr><tr><td>Cyclin B1</td><td>BD Biosciences</td><td>GNS-1</td><td>G2 Auflösung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Kryokonservierungsmittel</td></tr><tr><td>EQ Vier-Elemente-Kalibrierperlen</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>Interner Metallstandard für CyTOF-Leistung</td></tr><tr><td>FACS-Röhrchen mit Netzsieb</td><td>Corning</td><td>08-771-23</td><td>Zellsieb zur Entfernung von Klumpen/Ablagerungen vor dem CyTOF-Lauf</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Nahrungsergänzungsmittel für das Zellkulturwachstum</td></tr><tr><td>Helios</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>CyTOF-System/Plattform</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Färbeadditiv zur Vermeidung unspezifischer Verfärbungen</td></tr><tr><td>IdU (5-Iod-2&prime;-Desoxyuridin)</td><td>Sigma</td><td>I7125</td><td>Enthält in der S-Phase</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>eBiosciences</td><td>SolA15</td><td>Bestätigung von G0/G1</td></tr><tr><td>MaxPar Multi Label Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201300</td><td>Metallmarkierungskit, bindet Metalle auf Antikörper</td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880023</td><td>Mischen von Proben während der Färbung</td></tr><tr><td>von Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>15710</td><td>Fixiermittel</td></tr><tr><td>Pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazin</td><td>Fluidigm</td><td>201192</td><td>Zellidentifizierung während der CyTOF-Aufnahme</td></tr><tr><td>p-H2AX (S139)</td><td>Millipore</td><td>JBW301</td><td>Nachweis von DNA-Schäden</td></tr><tr><td>p-HH3 (S28)</td><td>Biolegend</td><td>HTA28</td><td>M-Phasen-Auflösung</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Waschlösung für Zellkulturen und Bestandteil der Fixierlösung</td></tr><tr><td>p-Rb (S807/811)</td><td>BD Biosciences</td><td>J112906</td><td>G0/G1 Auflösung</td></tr><tr><td>Proteomischer Stabilisator</td><td>SmartTube Inc</td><td>PROT1</td><td>Probenfixiermittel</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td>Zellkultur-Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Acros Organics</td><td>AC447810250</td><td>Bestandteil von CSM/Antikörperpuffer, Biozid</td></tr></tbody></table>

verwendung des pyrimidin-analogons 5-iod-2′-desoxyuridin (idu) mit zellzyklusmarkern zur etablierung von zellzyklusphasen in einer massenzytometrie-plattform

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

Die Regulation der Zellzyklusphase ist ein wichtiger Aspekt der Zellproliferation und Homöostase. Die Störung der Regulationsmechanismen, die den Zellzyklus steuern, ist ein Merkmal einer Reihe von Krankheiten, darunter auch Krebs. Die Untersuchung des Zellzyklus erfordert die Fähigkeit, die Anzahl der Zellen in jedem Teil des Zellzyklusverlaufs zu definieren und die einzelnen Zellzyklusphasen klar abzugrenzen. Das Aufkommen der Massenzytometrie (MCM) bietet ein enormes Potenzial für die Einzelzellanalyse mit hohem Durchsatz durch direkte Messungen von Elementisotopen, und die Entwicklung einer Methode zur Messung des Zellzykluszustands mittels MCM erweitert den Nutzen von MCM weiter. Hier beschreiben wir eine Methode, die 5-Iod-2′-Desoxyuridin (IdU), ähnlich wie 5-Brom-2'-Desoxyuridin (BrdU), in einem MCM-System direkt misst. Der Einsatz dieses IdU-basierten MCM bietet mehrere Vorteile. Erstens wird IdU während seiner Synthese schnell in die DNA eingebaut, was eine zuverlässige Messung von Zellen in der S-Phase mit Inkubationszeiten von nur 10-15 Minuten ermöglicht. Zweitens wird IdU gemessen, ohne dass sekundäre Antikörper oder DNA-Abbau erforderlich sind. Drittens kann die IdU-Färbung leicht mit der Messung von Cyclin B1, phosphoryliertem Retinoblastomprotein (pRb) und phosphoryliertem Histon H3 (pHH3) kombiniert werden, was zusammen eine klare Abgrenzung der fünf Zellzyklusphasen ermöglicht. Die Kombination dieser Zellzyklusmarker mit der hohen Anzahl von Parametern, die mit MCM möglich sind, ermöglicht die Kombination mit zahlreichen anderen Metriken.

Mit Hilfe von HL-60-Zellen und einem humanen Knochenmarkaspirat kann gezeigt werden, wie experimentelle Bedingungen die Zellzyklusverteilung und -analyse beeinflussen können. Zunächst muss die Gating-Strategie festgelegt werden, um zu zeigen, wie die Zellzyklusphasen abgeleitet werden. In Abbildung 1 zeigen wir die Etablierung des Singulett-Gates, das für die Trennung von Zelltrümmern und Dubletten wichtig ist, wodurch eine Einzelzellpopulation entsteht. Für Zelllinien genügt das Singulett-G...

Dieses Protokoll passt Zellzyklusmessungen für den Einsatz in einer Massenzytometrie-Plattform an. Mit den Multiparameter-Fähigkeiten der Massenzytometrie ermöglicht die direkte Messung des Jodeinbaus die Identifizierung von Zellen in der S-Phase, während intrazelluläre Zyklusmarker die Charakterisierung jedes Zellzykluszustands unter einer Reihe von experimentellen Bedingungen ermöglichen.

Verwendung des Pyrimidin-Analogons 5-Iod-2′-Desoxyuridin (IdU) mit Zellzyklusmarkern zur Etablierung von Zellzyklusphasen in einer Massenzytometrie-Plattform

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, den Zellzyklus auf Einzelzellebene mit dem Massenzytometer zu untersuchen, was die Durchführung mehrerer neuartiger Forschungs- und klinischer Studien ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Einfachheit. IdU wird direkt in die Zellen gegeben und es sind keine weiteren Behandlungen oder Antikörper erforderlich.Wir haben diese Technik verwendet, um den Zellzykluszustand bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie innerhalb der Stamm- und Vorläuferzellkompartimente zu untersuchen. Und dies zeigte, dass die Zellzykluseigenschaften dieser spezifischen Zelltypen mit dem klinischen Ergebnis von Patienten mit diesen Krankheiten korrelieren können. Diese Technik kann nützlich sein, um die Wachstumseigenschaften seltener Krebszellen zu verstehen und die Proliferation von Immunzelluntergruppen zu verstehen.Halten Sie die Zellen vor und nach der Zugabe von IdU zu den Zellproben in den gewünschten Wachstumsbedingungen. In diesem Fall wird ein befeuchteter 37 Grad Celsius Inkubator bei 5%CO2 zur Markierung der Zellen mit IdU die konzentrierte IdU-Stammlösung eins zu 50 in die Wachstumsmedien der Zellen verdünnt. Anschließend werden die Proben in eine Biosicherheitshaube überführt und auf jeden Milliliter Zellen 10 Mikroliter eines millimolaren IdU gegeben.Bringen Sie die Zellen für 10 bis 15 Minuten in den Inkubator zurück, bevor Sie die Proben in einzelne konische Röhrchen überführen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation in konischen 15-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern PBS pro Röhrchen. Beschriften Sie die Zellen bei Bedarf mit einer geeigneten lebenden/toten Färbung, um die toten Zellen zu markieren.Nach der Lebend-/Totfärbung wurden die Zellen mit mit CSM gewaschenem Medium abgeschreckt, bevor die Zellen mit 25 Mikrolitern 16%igem Paraformaldehyd fixiert wurden. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Fügen Sie fünf bis 15 Milliliter CSM hinzu und zentrifugieren Sie erneut.Resuspendieren Sie die Pellets in 500 Mikrolitern Zellfärbemedium, das mit 10 % Dimethylsulfoxid angereichert ist. Anschließend werden die Zellen in kleinere Röhrchen überführt, um sie bei minus 80 Grad Celsius zu lagern. Um die für ihre Zellzyklusanalyse zu normalisieren, importieren Sie die Dateien in ein geeignetes Durchflusszytometrie-Analyseprogramm und erstellen Sie ein biaxiales Diagramm der Ereignislänge im Vergleich zu 191 Iridium.Die Zellen bilden eine ausgeprägte, helle Iridium-Population. Ändern Sie die Längenskala des Ereignisses, damit die Zellen hervorgehoben werden. Erstellen Sie dann ein Singulett-Gatter, um 50 bis 60 % der Dubletten und Trümmer auszuschließen, und legen Sie die Residuen- und Offset-Gauß-Parameter fest, um alle verbleibenden Dubletten und Rückstände zu entfernen.Um das S-Phasen-Gatter festzulegen, erstellen Sie ein biaxiales Diagramm von IdU im Vergleich zu einem Proliferationsmarker. Die S-Phase IdU-positiven Zellen bilden eine eigene Population. Legen Sie für G0/G1- und G2/M-Gating die Gates in einem IdU- und Cyclin B1-Diagramm fest.Die G0/G1-Phase ist Cyclin B1-niedrig, IdU-negativ, und die G2/M-Phase ist Cyclin B1-hoch, IdU-negativ. Um bestimmte Zelltypen zu ermitteln, zeichnen Sie nur die S-Phasen-Zellen im Cyclin B1- und IdU-Diagramm auf, um die Trennung zwischen G0/G1-Phasen- und G2/M-Phasenzellen zu ermitteln. Zeichne ein Tor um die hohe Population von Cyclin B1.In einigen Fällen kann dies schwer zu erkennen sein, aber der Cyclin-B1-Spiegel von etwa den oberen 5 % der S-Phasen-Population ist typischerweise der Bruchpunkt zwischen den G0/G1- und G2/M-Phasengattern. Die Zellen, die sich innerhalb des vorherigen Tors befinden, sind die G2/M-Phasenpopulation, während der Rest die G0/G1-Phasenpopulation ist. Um die G0-Phasenpopulation zu bestimmen, erstellen Sie ein phosphoryliertes Retinoblastom-Protein im Vergleich zum IdU-Diagramm.Die G0-Phase wird durch eine phosphorylierte Retinoblastom-Protein-niedrige, IdU-negative Population repräsentiert. Da die aktiv zyklische Population ein hochphosphoryliertes Retinoblastom-Protein und eine IdU-Inkorporation aufweist, kann das G0-Phasengatter an dieser Grenze gezeichnet werden, da es typischerweise in zwei verschiedenen Populationen exprimiert wird. Wenn das G0-Gate schwer zu definieren ist, machen Sie die S-Phasen-Population zur aktiven Population und zeichnen Sie ein Gate, das die obersten 90 bis 100 % der phosphorylierten Retinoblastom-Protein-High-Population enthält.Die phosphorylierte Retinoblastom-Protein-Low-Population außerhalb des Gate-Bereichs ist typischerweise die G0-Population, während die G0/G1-Zellen mit pRb-Spiegeln, die in dieses Gate fallen, G1-Zellen sind. Für das M-Phasen-Gating wird ein IdU versus phosphoryliertes Histon H3 durch axiales Diagramm erstellt. Die M-Phasenphase wird als der sehr kleine Anteil der Zellen innerhalb der phosphorylierten Histon-H3-Population betrachtet.Die Zellen in der G2/M-Population mit niedrigeren pHH3-Spiegeln sind die G2-Zellen. Wenn die IdU-Inkorporation fehlgeschlagen ist oder nicht möglich war, definieren Sie die zyklischen und nicht zyklischen Zellfraktionen unter Verwendung von Ki67 und phosphoryliertem Retinoblastomprotein. Die doppelt positive Population repräsentiert die aktiv radelnde Population, die mit den Phasen G1, S, G2 und M korreliert.Die doppelt niedrige Population repräsentiert die nicht radelnde Population, die mit der G0-Phase korreliert. Wenn alle Gatter eingerichtet sind, exportieren Sie die numerischen Werte aus den Gattern. Die Prozentsätze in jedem Zyklus können erreicht werden, indem die einzelnen Populationen von den kombinierten Populationen subtrahiert werden, um numerische Werte für jede einzelne Zellzyklusphase für die anschließende grafische Darstellung und statistische Analyse zu generieren.Die Etablierung des Singulett-Gatters ist wichtig für die Trennung der zellulären Trümmer und Dubletten, um die Isolierung der Einzelzellpopulation zu ermöglichen. Anschließend kann eine Zellzyklusanalyse der einzelnen Zellen durchgeführt werden. Die IdU-Markierung und damit die nachgelagerte Zellzyklusanalyse kann erheblich von Zeit und Temperatur beeinflusst werden.Zum Beispiel haben Zellen, die zu lange in geschlossenen Gefäßen oder beim Transport zwischen den Orten verbleiben, reduzierte S-Phasen-Anteile, was für die Zellzyklusanalyse nicht genau ist. Zellproben, die für kurze Zeiträume von einer Stunde oder weniger aufbewahrt werden, zeigen immer noch eine normale Zellzyklusverteilung, was darauf hindeutet, dass ein schneller Transport die Analyse möglicherweise nicht negativ beeinflusst. Kryokonservierte Zellen benötigen möglicherweise eine lange Äquilibrierungsphase, bevor die Zellen in den aktiven Zellzyklus zurückkehren, was möglicherweise immer noch nicht den Zustand des Zellzyklus vor der Kryokonservierung widerspiegelt.Verschiedene Zelltypen können auch durch die Aufrechterhaltungsbedingungen unterschiedlich beeinflusst werden. In dieser menschlichen Knochenmarkprobe zeigten die T-Zellen beispielsweise eine Verringerung der Zellzahl im Vergleich zu Monoblasten aus derselben Probe. Ein weiterer Vorteil der Massenzytometrie ist die Fähigkeit, Zellen zu unterscheiden, die sich im Zellzyklusarrest befinden oder eine abnormale Zellzyklusverteilung aufweisen.Ein großer Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie leicht mit anderen Massenzytometriemessungen kompatibel ist, wie z. B. Oberflächenphänotypisierung, Chromatinstruktur, intrazellulärer Zytokinstimulation, die mit dem Zellzykluszustand korreliert werden können. Wir haben diese Technik verwendet, um die Erschöpfung und Seneszenz von Immunzellen zu untersuchen und zu zeigen, dass das Ansprechen auf eine Chemotherapie bei Patienten mit akuter Leukämie mit den Zellzykluseigenschaften der Leukämiezellen korrelieren kann.

use-pyrimidine-analog-5-iodo-2-deoxyuridine-idu-with-cell-cycle

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir haben eine Strategie zur sequentiellen Aufnahme von Thymidin-Analoga (CldU und IDU) in das Gewebe erwachsener Mäuse zu erkennen an zwei aufeinander folgenden Runden der Zellteilung zu quantifizieren abgeleitet. Diese Strategie ist sinnvoll, die Zellerneuerung an langlebigen Geweben, onkogenen Transformation oder die Durchreise verstärkenden Zellen zu erkennen.

Immunfluoreszenz-Nachweis von zwei Thymidinanaloga (CldU und IDU) in primärem Gewebe

Die Bestimmung der Zellzyklus-Position eine Population von Zellen, oder zu verstehen, wie Signale Verbreitung beeinflussen, kann leicht durch Durchflusszytometrie mit diesem Protokoll gemessen werden. Wir berichten über einen einfachen experimentellen Ansatz zur Färbung von Zellen und die Quantifizierung ihrer Position in den Zellzyklus.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

Tracking-feine Veränderungen in der Progression und die Kinetik der Zellzyklusstadien kann durch Verwendung einer Kombination von metabolische Markierung von Nukleinsäuren mit BrdU und genomischer Gesamt-DNA-Färbung über Propidiumiodid durchgeführt werden. Dieses Verfahren vermeidet die Notwendigkeit von chemischen Synchronisation der Rad-Zellen, wodurch die Einführung von nicht-spezifischen DNA-Schäden, die sich wiederum auf den Ablauf des Zellzyklus.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Dieses Video beschreibt das Protokoll für die BrdU-Immunfluoreszenzfärbung. Die Technik ermöglicht die Identifizierung von Zellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und die Markierung von Antikörpern ermöglichen eine detaillierte Analyse des Verbleibs der Zellen der S-Phase zu einem späteren Zeitpunkt.

BrdU-Immunfluoreszenzfärbung: Eine Technik zur Identifizierung von Zellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus

Das Video zeigt einen Immunfluoreszenz-basierten Ansatz zur Quantifizierung von Replikationsstress in Krebszellen. Mit Hydroxyharnstoff behandelte Zellen produzieren einzelsträngige DNA, die durch Immunfluoreszenz nachgewiesen wird. Die Anzahl der grünen Fluoreszenzherde gibt an, wie hoch der Replikationsstress in Krebszellen ist.

Eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Quantifizierung von Replikationsstress in Krebszellen

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU) -Aufnahme, die zeitliche Verfolgung von Zellen, die in der S-Phase auf einen bestimmten Zeitpunkt waren ermöglichen. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und Antikörpermarkierung erleichtert die detaillierte Analyse des Schicksals der S-Phasen-Zellen zu späteren Zeitpunkten.

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

Hier skizzieren wir, wie man die mitochondriale Lokalisation einer (Zellzyklus-)Kinase untersucht und wie man ihre submitochondriale Position sowie potenzielle mitochondriale Substrate/Ziele bestimmt. Die erzwungene Expression von Proteinen in die Mitochondrien stellt ein nützliches Werkzeug dar, um die funktionellen Konsequenzen der mitochondrialen Lokalisierung eines Proteins von Interesse zu untersuchen.

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

Im vorliegenden Protokoll demonstrieren wir, wie die DNA-Doppelstrang-Endsektion während der S/G2-Phase des Zellzyklus mit einer immunfluoreszenzbasierten Methode visualisiert werden kann.

Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging

Die Zellzyklusanalyse mit 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU) und Phospho-Histon H3 (pH3) Markierung ist ein mehrstufiges Verfahren, das eine umfangreiche Optimierung erfordern kann. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das alle Schritte für dieses Verfahren einschließlich Bildanalyse und Quantifizierung beschreibt, um Zellen in verschiedenen Zellzyklusphasen zu unterscheiden.

5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin/Phospho-Histon H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Wir beschreiben zwei komplementäre Protokolle zur genauen Bestimmung der S-Phasendauer in S. cerevisiae unter Verwendung von EdU, einem Thymidinanalogon, das in vivo eingebaut und mittels Click-Chemie durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesen wird. Es ermöglicht die einfache Charakterisierung der Dauer der DNA-Replikation und übersehener Replikationsdefekte in Mutanten.

Bestimmung der S-Phasendauer mittels 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin-Einbau in Saccharomyces cerevisiae

Erfahren Sie die Zellzyklusanalyse auf Einzelzellebene mit Massenzytometrie und IdU-Markierung. Diese einfache Methode ermöglicht die Untersuchung seltener Krebszellen und immunologischer Proliferation bei akuter myeloischer Leukämie.

Verwendung des Pyrimidin-Analogons 5-Iod-2′-Desoxyuridin (IdU) mit Zellzyklusmarkern zur Etablierung von Zellzyklusphasen in einer Massenzytometrie-Plattform (Video) | JoVE Journal

Verwendung des Pyrimidin-Analogons 5-Iod-2′-Desoxyuridin (IdU) mit Zellzyklusmarkern zur Etablierung von Zellzyklusphasen in einer Massenzytometrie-Plattform

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