Name: Apoptose-Induktion und Detektion in einer primärer Kultur von Seegurken-Darmzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Erfahren Sie eine einfache Primärzellkulturmethode für Darmzellen der Seegurke Apostichopus japonicus. Dieses Protokoll ermöglicht Langzeitkulturen mariner Wirbelloser für zellbiologische Forschung.

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Die Autoren danken Prof. Naiming Zhou von der Universität Zhejiang für seine technische Beratung und für die Bereitstellung der Ausstattung seines Labors. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummern 41876154, 41606150 und 41406137) und den Fundamental Research Funds for Zhejiang Provincial Universities and Research Institutes (Grant-Nummer 2019JZ00007) und den Fundamental Research Funds for Zhejiang Provincial Universities and Research Institutes [Grant-Nummer 2019JZ00007) finanziell unterstützt. ].

1. Zellkultur Mittlere Vorbereitung
<ol><li>
Coelomische Flüssigkeitszubereitung
	<ol>
<li>
Coelomische Flüssigkeitssammlung: Unter sterilen Bedingungen eine gesunde Seegurke (Nassgewicht 85-105 g) sezieren, coelomische Flüssigkeit sammeln und in einem sterilen Glaskolben aufbewahren.</li>
		<li>
Coelomische Zellentfernung: Zentrifugieren Sie die koelomische Flüssigkeit in 50 ml Zentrifugenrohren bei 1.700 x g für 5 min und übertragen Sie den Überstand in einen neuen sterilen Glaskolben; als nächstes die zellfreie koelomische Flüssigkeit der Seegurke zu sammeln.</li>
		<li>
Komplementkomponenten inaktivierung: Inkubieren Sie den sterilen Glaskolben, der die coelomische Flüssigkeit der Seegurken enthält, in einem 40–50 °C-Wasserbad für 20–40 min, um Komplementkomponenten-inaktivierte coelomische Flüssigkeit zu erhalten.</li>
		<li>
Mikrobenentfernung: Entfernen Sie Bakterien und Chlamydien durch Filtration durch 0,22 m Membranfilter. Als nächstes entfernen Sie Mykoplasmen und andere feine Partikel durch Filtration mit 0,1 m Membranfiltern, um eine koelomische Flüssigkeitsvorbehandlungslösung zu erhalten.</li>
		<li>
Salinitätsanpassung: Stellen Sie den Salzgehalt der koelomischen Flüssigkeitsvorbehandlungslösung auf 30 % (gemessen per Salinometer) ein, indem Sie 20 % hochkonzentrierte vorsterilisierte und gefilterte NaCl-Lösung (verdünnt durch vorbehandelte coelomische Flüssigkeit) oder DDW (doppeldestilliertes Wasser) hinzufügen. Die coelomische Flüssigkeit der Seegurken in eine sterile Flasche geben, die Flasche versiegeln und bei 4 °C für weitere Experimente lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Leibovitz es L-15 Zellkultur-Medium-Optimierung
	<ol>
<li>Wiegen Sie 5,05 g NaCl, 0,135 g KCl, 0,15 g CaCl2, 0,25 g Na2SO4, 0,975 g MgCl2, 0,25 g Glukose und 6,25 mg Taurin und verdünnen sie in 40 ml Leibovitz' L-15 Medium in einem 50 ml sterilen Zentrifugenrohr. Rühren Sie das Rohr auf einem Shaker für 1 h, um sicherzustellen, dass sich die Salze vollständig gelöst haben.</li>
		<li>2,5 ml L-Glutamin (100 mg/ml) und 500 l VE-Lösung (1,75 mg/L) in zuvor hergestellte Leibovitz-Medium L-15-Mittel geben und das Medium weiter durch 0,22 m Membranfilter filtern.</li>
		<li>Das gesamte mittlere Volumen auf 500 ml mit frischem Leibovitz-Medium L-15 und mit 100 ml zuvor hergestellter koelomischer Flüssigkeit einstellen; stellen Sie den pH-Wert mit der NaOH-Lösung auf 7,6 ein. Halten Sie den Betriebsprozess in einer sterilen Umgebung. Das Compoundierungsverhältnis von coelomischer Flüssigkeit kann 10%–50% betragen, und 20% ist ausreichend für die Kultur der A. japonicus Darmzellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Darmzellvorbereitung
<ol><li>
Seegurken-Darmverarbeitung
	<ol>
<li>Anästhetisieren Sie gesunde Seegurken in einer Eisbox. Sezieren und sammeln Sie den vorderen Darm, dann schneiden Sie die Gewebeproben vertikal und entfernen Sie den inneren Inhalt.</li>
		<li>Waschen Sie die Gewebeproben zweimal in phosphatgepufferter Saline (PBS) und desinfizieren Sie sie durch Eintauchen in eine wässrige Ethanollösung (75 Volumenprozent) nicht länger als 2 s.</li>
		<li>Waschen Sie die Gewebeproben in PBS dreimal, um Ethanol zu entfernen und übertragen Sie etwa 100 mg Gewebeprobe in ein 2,0 ml steriles Mikrozentrifugenrohr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellsammlung
	<ol>
<li>1,5 ml des voroptimierten Kulturmediums in den Darmgewebeblock der Seegurken geben und den Block mit einer sterilisierten chirurgischen Schere zerkleinern, bis die Lösung trüb ist. HINWEIS: Für optionalvereinfachtes Protokoll 0,5 ml voroptimiertes Kulturmedium in den Darmgewebeblock der Seegurken geben und den Block mit sterilisierter chirurgischer Schere in 1 mm3schneiden. Übertragen Sie die Proben direkt auf Kulturgerichte, gefolgt von nachfolgenden Inkubationsschritten.</li>
		<li>Fügen Sie 400 l Trypsin (0,25 %) hinzu, mischen Sie die Lösung durch Inversion und inkubieren Sie sie 5 min bei Raumtemperatur; filtern Sie dann die Lösung mit einem 100-m-Zellsieb. HINWEIS: Es ist optional, Trypsin für die Zelldispersion bei der Behandlung verschiedener Gewebeproben hinzuzufügen. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) sollte in Trypsin-Lösung enthalten sein, um die hemmende Aktivität von Ca2+ und Mg2+ im Kulturmedium zu reduzieren.</li>
		<li>Das Filtrat zu einem neuen sterilen 2,0 ml Mikrozentrifugenrohr, Zentrifuge bei 1.700 x g für 3 min sammeln, den Überstand entsorgen, dann das Pellet im Kulturmedium (ergänzt mit Antibiotika) wieder aufhängen und zweimal waschen. HINWEIS: Bereiten Sie frische spräziertes Vor-optimiertes Kulturmedium vor, ergänzt durch 2% Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin) und 1% Gentamicin (4 mg/ml) vor Beginn des Experiments.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Zellkultur
<ol><li>
Inkubator-Voreinstellung: Den Inkubator für die Zellkultur voreinstellen und im Voraus mindestens 24 h bei einer Temperatur von 18 °C und gesättigter Luftfeuchtigkeit betreiben. HINWEIS: Füttern Sie CO2 in den Inkubator in Abhängigkeit von den Eigenschaften der Zellkultur medium; Bei Verwendung des Basismediums von Leibovitz es L-15 muss kein CO2 bereitgestellt werden.</li>
	<li>
Zellenkultur der ersten Stufe
	<ol>
<li>Um das Wachstum von Mikroben zu hemmen und die Proliferation während der Anfangsphase der Zellkultur zu fördern, fügen Sie 10 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin) und 0,5 ml Gentamicin (40 mg/ml) in alle 500 ml voroptimierter Mediumkultur ein. Darüber hinaus ergänzen Sie alle 500 ml Kulturmedium mit 0,6 ml Insulin (10 mg/ml), 100 l Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor (0,1 g/l) und 25 l Fibroblasten-Wachstumsfaktor (0,1 g/l).</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellen in 1,5 ml-Röhren, setzen Sie sie mit 200 l des angegebenen Mediums wieder ab und pfeifen Sie sie in 4 cm große Gerichte.</li>
		<li>Die Zellen in einem Inkubator kulturieren und 2,0 ml indiziertes Medium nach 6 h in die Zellkultivierungsschalen geben. Wechseln Sie die Hälfte des Mediums alle 12 h bis zum Erreichen der nächsten Stufe. HINWEIS: Behandeln Sie das Medium sanft ändern, da die Zellen nicht fest an den Gerichten befestigt sind. Poly-D-Lysin-beschichtete Gerichte können zur lockeren Befestigung an den Schalenzellen verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellkultur der zweiten Stufe
	<ol>
<li>Um die Nebenwirkungen von Antibiotika auf die kultivierten Zellen zu reduzieren, reduzieren Sie die Konzentration der angezeigten Antibiotika (Penicillin, Streptomycin, und Gentamicin) im Kulturmedium um die Hälfte. HINWEIS: Die Verwendung von Insulin und Wachstumsfaktoren hängt von den Zellkulturbedingungen ab und ist optional.</li>
		<li>Ersetzen Sie das Zellkulturmedium; je nach Zelldichte alle zwei bis drei Tage. HINWEIS: Beobachten Sie die kultivierten Zellen täglich unter dem Mikroskop und zeichnen Sie die Wachstumsbedingungen auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellpassaging HINWEIS: Passage und Subkultur der Zellen, wenn die primäre Zelldichte 60% erreicht.<ol>
<li>Waschen Sie die kultivierten Zellen zweimal mit PBS bei Raumtemperatur. Fügen Sie 200 L Trypsin-Lösung hinzu (0,25%) zu jedem Gericht und manuell die Schale zu agitieren, um sicherzustellen, dass der gesamte Boden bedeckt ist. Entsorgen Sie die Trypsin-Lösung und inkubieren Sie die Zellen 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit 1,0 ml frischem Kulturmedium, indem Sie die Zellen pipetieren und wieder aufhängen. 0,5 ml Zellsuspension auf eine neue Schale geben, 1,5 ml frisches Medium hinzufügen und die Zellen bei 18 °C bebrüten. HINWEIS: Zellschaber können für die Zellsammlung verwendet werden, wenn die Trypsin-Lösung Zellen nicht verdaut und von den Tellern abtrennt (einige Zelllinien sind zu klebend). Führen Sie jedoch nicht beide Methoden gleichzeitig durch.</li>
		<li>Ändern Sie das Medium nach 12 h und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Bedingungen zu bewerten. Kultur die Zellen für weitere experimentelle Assays.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Apoptose-Induktion und Detektion in A. japonicus Darmzellen
<ol><li>
Zellkultur und Dexamethason-Behandlung
	<ol>
<li>Bereiten Sie Darmzellen nach dem zuvor eingeführten Protokoll vor und fügen Sie die Zellen tropfenweise zu einer 12-Well-Platte bei einem Zellvolumen von 2 x 106 pro Bohrkörper hinzu.</li>
		<li>Nach drei Tagen in der Kultur, nach den Schritten der "ersten Stufe Zellkultur", waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und ersetzen Sie das Medium durch optimiertes Medium (ohne Antibiotika und Wachstumsfaktoren).</li>
		<li>Verdünnung von Dexamethason (DXMS) im Kulturmedium, um vor Beginn der Experimente frische DXMS-Lösungen von 2 m und 200 M vorzubereiten.</li>
		<li>Fügen Sie DXMS-Lösungen in verschiedenen Konzentrationen zu kultivierten Zellen hinzu, die mit dem gleichen Volumen an Kultivierungsmedium samten werden; drei experimentelle Gruppen, einschließlich Steuerung (CTL), 1 M und 100 M DXMS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hoechst Färbung 
	<ol>
<li>Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation mit/ohne DXMS dreimal mit PBS für die angegebenen Zeiträume (0 h, 24 h und 48 h).</li>
		<li>Fügen Sie 300 L Hoechst 33258 Lösung pro Brunnen zu einer 12-Well-Platte und inkubieren bei 18 °C für 30 min. Rühren Sie die Platte sanft, um alle Zellen zu decken, die ihre Färbung gewährleisten.</li>
		<li>Entfernen Sie die Hoechst-Färbelösung und fixieren Sie die Zellen, indem Sie jedem Brunnen 300 L einer 4%igen Paraformaldehydlösung (in PBS) hinzufügen. Sanft rühren für 15 min. ACHTUNG: Paraformaldehyd ist mäßig giftig durch Hautkontakt oder Inhalation und wird als wahrscheinliches menschliches Karzinogen bezeichnet. Chemische Dunstabzugshauben, belüftete Waagengehäuse oder andere Schutzmaßnahmen sollten beim Wiegen und Behandeln von Paraformaldehyd verwendet werden.</li>
		<li>Waschen Sie die festen Zellen dreimal in PBS. Entsorgen Sie die PBS nicht nach dem Waschen, um die Zellen bedeckt zu halten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fluoreszierende Mikroskopie-Analyse
	<ol>
<li>Schalten Sie die Fluoreszenzmikroskop-Hardware ein, einschließlich quecksilberlampenleistung, Fluoreszenzlichtleistung und PC. Melden Sie sich beim Betriebssystemkonto an, starten Sie die Software, und überprüfen Sie deren Konfiguration.</li>
		<li>Legen Sie die vorbereitete Platte auf die Mikroskopstufe. Positionieren Sie die Probe mit dem Stufenregler über der Objektivlinse.</li>
		<li>Finden Sie die von Interesse befindlichen Zellen unter dem Lichtmikroskop, wechseln Sie zur Fluoreszenzmikroskopie und erfassen Sie die Bilder, indem Sie die Parameter optimieren. HINWEIS: Um das an die Kerne DNA gebundene Fluoreszenzsignal Hoechst 33258 zu beobachten, sollte die Fluoreszenzmikroskopie mit Anregung und Emission bei etwa 352 nm bzw. 461 nm durchgeführt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Umfangreiche Forschungsanstrengungen wurden in den letzten Jahrzehnten zur Etablierung von Zelllinien unternommen, es ist jedoch immer noch schwierig, Fortschritte bei der langfristigen Kultur von Zellen von marinen Wirbellosen zu machen14,22. Es wurde berichtet, dass kultivierte Zellen aus regenerierenden holothurischen Geweben über einen langen Zeitraum lebensfähig waren und eine hohe Proliferationsaktivität in bestimmten Zellen nachgewiesen werden kann<sup cla...

Das Kultivieren von Zellen unter künstlich kontrollierten Bedingungen und nicht in ihrer natürlichen Umgebung liefert einheitliche versuchsweise Materialien für biologische Studien, insbesondere für Arten, die in einer Laborumgebung nicht leicht kultiviert werden können. Meereswirbellose machen mehr als 30% aller Tierarten1aus und liefern zahlreiche biologische Materialien für die Durchführung von Forschungsarbeiten über die Regulierungsmechanismen spezifischer biologischer Prozesse, wie Regeneration2,3, Stressreaktion4und Umweltanpassung5,6.
Die Seegurke Apostichopus japonicusist eine der am meisten untersuchten Stachelhäuleiterarten, die gemäßigte Gewässer entlang der Nordpazifikküste bewohnen. Es ist bekannt als eine kommerziell wichtige Art und marikultiviert in großem Maßstab in Ostasien, vor allem in China7. Zahlreiche wissenschaftliche Fragen zu A. japonicus, einschließlich der regulatorischen Mechanismen, die der Darmregeneration nach der Ausweidung8 und Degeneration in der Aestivation9, Metabolische Kontrolle10,11und Immunantwort12,13 unter thermischen oder pathogenen Belastungen zugrunde liegen, haben die Aufmerksamkeit der Forscher auf sich gezogen. Im Vergleich zu gut untersuchten Modelltieren ist die Grundlagenforschung, insbesondere auf zellulärer Ebene, jedoch durch technische Engpässe, wie z. B. das Fehlen fortgeschrittener Zellkulturmethoden, begrenzt.
Die Forscher haben sich viel Mühe gegeben, Zelllinien zu etablieren, aber sie haben auch viele Herausforderungen und keine Zelllinie von einem marinen Wirbellosen hat noch14etabliert. Jedoch, primäre Zellkulturen von marinen wirbellosen Tieren haben in den letzten Jahrzehnten15,16, und sie haben eine Gelegenheit für Experimente auf zellulärer Ebene zur Verfügung gestellt. Zum Beispiel wurde das regenerierende Intesin von A. japonicus als Quelle von Zellen für langfristige Zellkulturen verwendet, die eine praktische Methode für die primäre Zellkultur von marinen Wirbellosen17zur Verfügung stellten. Dieses Protokoll kombinierte und optimierte wirbellose Zellkultur Ansätze und entwickelte eine weit geeignete Primärkulturmethode für Seegurken oder andere marine Wirbellose.
Apoptose ist ein intrinsisches Zellselbstmordprogramm, das durch verschiedene exogene und endogene Reize ausgelöst wird. Koordinierte Apoptose ist entscheidend für viele biologische Systeme18,19, und es wurde in die Darmregression der Seegurke während der Aestivationbeteiligt 9. Zur Untersuchung des apoptotischen Prozesses bei Organismen von Interesse wurden eine Reihe von Methoden, einschließlich Hoechst-Färbungs- und Mikroskopie-Assays, etabliert und erfolgreich angewendet20. Hier führten wir Apoptose-Induktion und -Nachweis in primär kultivierten Darmzellen von Seegurken durch, um die Verwendbarkeit von Primärzellen in biologischen Studien von wirbellosen Meerestieren zu bewerten. Dexamethason, eines der häufig verwendeten synthetischen Glukokortikosteroide21, wurde verwendet, um Apoptose in kultivierten Darmzellen aus Seegurken zu induzieren, und signifikante Shoechst 33258 Signal wurde erfolgreich in den gefärbten Zellen durch fluoreszierende Mikroskopie nachgewiesen.

<table><tbody><tr><td>0,1 &mu; m Filter</td><td>Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m Filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin</td><td>Genom</td><td>GNM25200</td><td></td></tr><tr><td>100 μm m Filter</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>4 cm Schüsseln</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0124</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd-Lösung</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>80096618</td><td>in PBS</td></tr><tr><td>Tischzentrifugen</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>BeyoClick EdU-488 Kit</td><td>Beyotime</td><td>C0071S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10005817</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator mit konstanter Temperatur</td><td>Lucky Riptile</td><td>HN-3</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>XW00500221</td><td></td></tr><tr><td>Elektrisches thermostatisches Wasserbad</td><td>senxin17</td><td>DK-S28</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>80176961</td><td>75%</td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF</td><td>)PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica DMI3000B</td><td>DMI3000B</td><td></td></tr><tr><td>Garamycin</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>XW14054101</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33258 Färbelösung</td><td>Beyotime</td><td>C1017</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td></td><td></td>XW1106168001</tr><tr><td>Insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF)</td><td>PEPROTECH</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>Genom</td><td>GNM41300</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (100 mg/ml)</td><td>Genom</td><td>GNM-21051</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td></td><td></td>XW77863031</tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10020518</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10019308</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td>pH7,2-7,4</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Genom</td><td></td><td></td>GNM15140</tr><tr><td>PH-Messgerät</td><td>Bante</td><td>A120</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>SIGMA</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>VE</td><td>Seebio</td><td>185791</td><td></td></tr></tbody></table>

apoptose-induktion und detektion in einer primärer kultur von seegurken-darmzellen

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primärkultivierte Zellen werden in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Disziplinen als außerordentlich wichtige Instrumente zur funktionellen Bewertung biologischer Substanzen oder zur Charakterisierung spezifischer biologischer Aktivitäten eingesetzt. Aufgrund des Mangels an universell anwendbaren Zellkulturmedien und -protokollen sind gut beschriebene Zellkulturmethoden für Meeresorganismen jedoch nach wie vor begrenzt. Unterdessen behindern die häufig auftretende mikrobielle Kontamination und die polytropen Eigenschaften von wirbellosen Meereszellen die Etablierung einer wirksamen Zellkulturstrategie für marine Wirbellose weiter. Hier beschreiben wir eine einfach zu handhabende Methode zur Kultivierung von Darmzellen aus der Seegurke Apostichopus japonicus; Darüber hinaus stellen wir ein Beispiel für In-vitro-Apoptose-Induktion und Nachweis in primär kultivierten Darmzellen bereit. Darüber hinaus liefert dieses Experiment Details über die geeignete Kulturmedium- und Zellsammlungsmethode. Das beschriebene Protokoll ist mit einer Vielzahl von weit verbreiteten Gewebeproben von Meeresorganismen wie Echinodermata, Mollusca und Crustacea kompatibel und kann ausreichend Zellen für mehrere In-vitro-Experimente bereitstellen. Diese Technik würde es Forschern ermöglichen, primäre Zellkulturen von wirbellosen Meerestieren effizient zu manipulieren und die funktionelle Bewertung gezielter biologischer Materialien an Zellen zu erleichtern.

Hier etablierten wir die primäre Darmzellkultur von A. japonicus und durchgängen die Zellen. Abbildung 1 zeigt runde Zellen in verschiedenen Stadien der Kultivierung. Und die EdU-Färbe-Assays liefern direkte Beweise, um die proliferative Aktivität dieser runden Zellen im späteren Stadium zu offenbaren (Abbildung 2). Wir haben auch das Protokoll leicht angepasst, wodurch Zerkleinerung von Hackfleischblöcken anstelle von filtrierten Zellen; Darüber hinaus...

Dieses Protokoll bietet eine einfach zu handhabende Methode zur Kultur der Darmzellen der Seegurke Apostichopus japonicus und ist mit einer Vielzahl von weit verbreiteten Gewebeproben von Meeresorganismen wie Echinodermata, Mollusca und Crustacea kompatibel.

Apoptose-Induktion und Detektion in einer primärer Kultur von Seegurken-Darmzellen

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Das Protokoll bietet eine einfach zu handhabende und weitgehend kompatible primäre Zellkulturmethode für wirbellose Meerestiere. Diese Technik gibt Forschern eine Möglichkeit, die marinen wirbellosen Zellen für vergleichsweise lange Zeit zu kultiton. Eine Zellkultur sollte mit einem konsistenten genetischen Hintergrund für verschiedene weitere biologische experimentelle Anwendungen in der Meeresbiologieforschung versehen werden.Für die neuen Forschungsarbeiten in diesem Bereich sind wir der Meinung, dass das angegebene vereinfachte Protokoll die gute Wahl sein sollte. Nach der Anästhesisierung, sezieren und sammeln Sie den vorderen Darm, dann schneiden Sie die Gewebeproben vertikal und entfernen Sie den inneren Inhalt. Waschen Sie die Gewebeproben zweimal in PBS und desinfizieren Sie sie durch Eintauchen in eine 75%Ethanol-Lösung für nicht länger als zwei Sekunden.Dann waschen Sie die Gewebeproben in PBS dreimal, um das Ethanol zu entfernen, und übertragen Sie etwa 100 Milligramm Gewebeprobe in eine zwei Milliliter sterile Mikrozentrifugenröhre. Fügen Sie 1,5 Milliliter voroptimiertes Kulturmedium in den Darmgewebeblock der Seegurken ein und zerkleinern Sie den Block mit einer sterilisierten chirurgischen Schere, bis die Lösung trüb ist. Fügen Sie 400 Mikroliter 0,25%Trypsin hinzu.Mischen Sie die Lösung durch Inversion und inkubieren Sie sie für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann filtern Sie die Lösung mit einem 100 Mikron Zellsieb und sammeln Sie das Filtrat in einem neuen sterilen Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Für optionalvereinfachtes Protokoll können in kultivierten Medien geschnittene Gewebeblöcke direkt in Gerichte übertragen und anschließend inkubiert werden.Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1700xG für drei Minuten, entsorgen Sie den Überstand, dann setzen Sie das Pellet im Kulturmedium mit Antibiotika wieder auf und waschen Sie es zweimal mit Kulturmedium. Stellen Sie den Inkubator für die Zellkultur vor und führen Sie ihn im Voraus mindestens 24 Stunden mit einer Temperatur von 18 Grad Celsius und gesättigter Luftfeuchtigkeit aus. Dann die Zellen mit 200 Mikroliter des angegebenen Mediums wieder aussetzen und in vier Zentimeter große Gerichte übertragen.Kultur die Zellen in einem Inkubator. Nach sechs Stunden, nehmen Sie sie aus dem Inkubator und fügen Sie zwei Milliliter des angegebenen Mediums auf die Zellkultivierung Gerichte. Wechseln Sie alle 12 Stunden die Hälfte des Mediums.Nach fünf bis sieben Tagen beginnen sich die Zellen zu teilen. Reduzieren Sie die Nebenwirkungen von Antibiotika, indem Sie die Konzentration von indizierungsgemäßen Antibiotika, Penicillin, Streptomycin und Gentamicin im Kulturmedium um die Hälfte reduzieren. Ersetzen Sie alle zwei bis drei Tage das Zellkulturmedium.Wenn die primäre Zelldichte 60% erreicht, leiten Sie die Zelldurchlaufung. Waschen Sie zunächst die kultivierten Zellen zweimal mit PBS bei Raumtemperatur. Fügen Sie 200 Mikroliter 0,25%Trypsin-Lösung zu jedem Gericht, und manuell die Gerichte zu erregen, um sicherzustellen, dass der gesamte Boden abgedeckt ist.Entsorgen Sie die Trypsin-Lösung, und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter frischem Kulturmedium, indem Sie die Zellen abpfeifen und wieder aufhängen. 0,5 Milliliter Zellsuspension auf ein neues Gericht übertragen.Fügen Sie 1,5 Milliliter frisches Medium hinzu und brüten Sie die Zellen bei 18 Grad Celsius. Wechseln Sie nach 12 Stunden das Medium, und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Bedingungen zu bewerten. Bereiten Sie drei experimentelle Gruppen, einschließlich einer Steuerung, und zwei Gruppen von Lösungen mit einem Mikromolar und 100 Mikromolar-Deximethazone vor.Nach der Inkubation mit oder ohne Deximethazon für Null, 24 oder 48 Stunden, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Nach dem Ausschalten des Lichts 300 Mikroliter Hacken 33258 Lösung pro Brunnen zu einer 12 Brunnenplatte hinzufügen, und sanft die Platte zu rühren, um alle Zellen zu bedecken, um ihre Färbung zu gewährleisten. Bei 18 Grad Celsius 30 Minuten inkubieren.Entfernen Sie dann die Hackchst-Färbelösung und fixieren Sie die Zellen, indem Sie jedem Brunnen 300 Mikroliter von vier Prozent Paraformaldehydlösung in PBS hinzufügen. Sanft rühren für 15 Minuten. Danach waschen Sie die festen Zellen dreimal in PBS.Bewahren Sie die PBS nach dem letzten Waschen auf, um die Zellen bedeckt zu halten. Schalten Sie die Fluoreszenzmikroskop-Hardware ein, einschließlich der Quecksilberlampenleistung, der Fluoreszenzlichtleistung und des PCs. Melden Sie sich beim Betriebssystemkonto an, starten Sie die Software, und überprüfen Sie deren Konfiguration. Legen Sie die vorbereitete Platte auf die Mikroskopstufe.Positionieren Sie die Probe mit dem Stufenregler über der Objektivlinse. Finden Sie die Zellen von Interesse unter dem Lichtmikroskop. Wechseln Sie zur fluoreszierenden Mikroskopie und passen Sie die Parameter der Anregung und Emission auf ca. 352 bzw. 461 Nanometer für die Kern-DNA-Beobachtung an.Erfassen Sie die Bilder. In dieser Studie wurde die primäre Darmzellkultur von Seegurken etabliert und durchdrungen. Hier werden runde Zellen in verschiedenen Stadien der Kultivierung gezeigt.Hier sind Zellen, die am unteren Rand des Geschirrs am dritten Tag, nach der Aussaat, befestigt sind. Hier ist die Zellproliferation am siebten Tag. Hier sind Zellen, die nach dem Passieren an der Unterseite des Geschirrs befestigt sind.Und Zellen, die Aktivität verloren und nach 10 Passagen starben. Die EDU-Angaben liefern direkte Beweise, um die proliferative Aktivität dieser runden Zellen in späteren Stadien zu offenbaren. Die Stimulation mit einem Mikromolar-Deximethaum erhöhte die apoptotische Zellrate am schnellsten im Vergleich zur Kontrolle und der 100 mikromolaren Deximethazone-Stimulation.Die kultivierten Zellen wurden für verschiedene Zeiträume mit Deximethaon behandelt, gefolgt von hoechst 33258 Färbung für die Apoptotikzelldetektion. Zellbehandlungen vor der Inkubation sind entscheidend für die Langzeitkontrolle. Es ist eine Erinnerung, das optionale vereinfachte Protokoll auszuprobieren, wenn die Zelle nicht gut wächst.Paraformaldehyd ist mäßig giftig durch Hautkontakt oder Inhalation, und es ist als wahrscheinlich menschliches Karzinogen dokumentiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir stellen eine einfache Protokoll zu Bereichen programmierten Zelltod (PCD) in Mausembryonen und Differenzieren embryonalen Stamm (ES)-Zellkulturen unter Verwendung eines gut löslichen Farbstoff genannt LysoTracker visualisieren.

Verwendung LysoTracker zum programmierten Zelltod in Embryonen Erkennen und Differenzieren embryonalen Stammzellen

Bestimmte genetische Störungen oder die Exposition gegenüber Toxinen können normale Entwicklungsprozesse stören, die zum Tod bestimmter Zelltypen führen. Die Analyse von aktivierter Caspase 3 durch Whole-Mount-Immunfluoreszenz in Zebrafischembryonen zeigt eine stadien- und gewebespezifische Lokalisation von Zellen, die spezifisch Apoptose durchlaufen.

Die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen von Whole-mount Immunfluoreszenz an aktivierte Caspase 3 Detect

Der Begriff Anastase bezieht sich auf das Phänomen, bei dem sterbende Zellen einen Zellselbstmordprozess in einem späten Stadium rückgängig machen, sich selbst reparieren und schließlich überleben. Hier demonstrieren wir Protokolle zum Nachweis und zur Verfolgung von Zellen, die einer Anastasierung unterzogen werden.

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bestimmung intrazellulärer Signalereignisse, die in lebensfähigen Zellen durch physikalische Interaktion mit benachbarten toten oder sterbenden Zellen induziert werden. Das Protokoll konzentriert sich auf Signalereignisse, die durch Rezeptor-vermittelte Erkennung der toten Zellen induziert werden, im Gegensatz zu ihrer phagozytären Aufnahme oder Freisetzung löslicher Mediatoren.

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Ein Workflow mit Flow Cytometry oder Differential Zentrifugation wurde entwickelt, um erkennen, zu quantifizieren und isolieren Apoptotic Körper aus einem Apoptotic Probe zu hoher Reinheit.

Nachweis und Isolierung von apoptotischen stellen hohe Reinheit

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Zytotoxizität von pre-activated CD8 untersuchen+ T-Zellen gegen Krebszellen durch das Erkennen von apoptotischen Krebs Zellen über Echtzeit-Mikroskopie. Dieses Protokoll kann Mechanismen hinter myeloische Zellen-induzierte T-Zell-Unterdrückung untersuchen und zu bewerten Verbindungen auffüllen T Zellen durch Blockade von Immunzellen suppressive myeloische abzielen.

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung von apoptotischen Thymozyten und peritonealen Makrophagen vor und analysieren die Effizienz der Eskrozytose und die spezifische hemmungsvermittelte Blockierung apoptotischer Thymozyten-Verengungen. Dieses Protokoll hat eine breite Anwendung in der zellvermittelten Räumung anderer Partikel, einschließlich künstlicher Perlen und Bakterien.

Experimentelle Analyse des Apoptotic Thymozyte Engulfment durch Macrophagen

Das vorgestellte Protokoll verwendet Diedurchflusszytometrie, um die Anzahl der sich ausbreitenden und abgestorbenen Zellen in kultivierten Mausenteroiden zu quantifizieren. Diese Methode ist hilfreich, um die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Organoidproliferation und das Überleben zu bewerten.

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Dieses Protokoll beschreibt ein apikal-out-nekrotisierendes Enterokolitis-Modell (NEC)-in-a-dish, das Dünndarmenteroide mit umgekehrter Polarität verwendet und den Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglicht. Wir bieten ein Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll zum Nachweis von NEC-bedingten Epithelstörungen und eine Methode zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von apikalen Enteroiden, die dem NEC-in-a-dish-Protokoll unterliegen.

In vitro Apical-out enteroides Modell der nekrotisierenden Enterokolitis

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Methode zur Untersuchung und Quantifizierung des Zelltods in menschlichen Dickdarmorganoiden als Reaktion auf zytotoxische Störungen wie Zytokine. Der Ansatz verwendet einen fluoreszierenden Zelltodfarbstoff (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), Lebendfluoreszenzmikroskopie und Open-Source-Bildanalysesoftware, um die Reaktionen einzelner Organoide auf zytotoxische Reize zu quantifizieren.

Quantifizierung des Zytokin-induzierten Zelltods in humanen Dickdarmorganoiden mittels Live-Fluoreszenzmikroskopie

Erfahren Sie eine einfache Primärzellkulturmethode für Darmzellen der Seegurke Apostichopus japonicus. Dieses Protokoll ermöglicht Langzeitkulturen mariner Wirbelloser für zellbiologische Forschung.

Apoptose-Induktion und Detektion in einer primärer Kultur von Seegurken-Darmzellen

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