Name: In Vitro Modell der koronaren Angiogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Erfahren Sie ein in vitro Modell zur Untersuchung der koronaren Angiogenese mit Explantatkulturen von Sinus venosus und Endokardgewebe. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Reaktionen auf VEGF-A.

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Sharma-Labors für die Bereitstellung einer unterstützenden Forschungsumgebung. Ein besonderer Dank gilt Diane (Dee) R. Hoffman, die unsere Mauskolonie pflegt und pflegt. Wir möchten auch Drs. Philip J. Smaldino und Carolyn Vann für das gründliche Korrekturlesen des Manuskripts und die Bereitstellung hilfreicher Kommentare danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel des Ball State University Provost Office und des Department of Biology an B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant Funds to B.S, nIH (RO1-HL128503) und The New York Stem Cell Foundation funds to K.R. unterstützt.

Die Verwendung aller Tiere in diesem Protokoll folgte den Richtlinien des Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Etablierung von Mauszüchtern und Erkennen von Vaginalsteckern für zeitgedauerte Schwangerschaften
<ol><li>Richten Sie einen Mäusezuchtkäfig mit wilden männlichen und weiblichen Mäusen ein. Stellen Sie sicher, dass das Alter der Zuchtmäuse zwischen 6-8 Wochen liegt. Richten Sie entweder ein Paar (1 Männchen und 1 Hündin) oder als Trio (1 Männchen und 2 Hündin) für die Zucht ein.</li>
	<li>Überprüfen Sie am nächsten Morgen einen Vaginalstecker. Verwenden Sie eine abgewinkelte Metallsonde, um einen tiefen Stecker zu erkennen, indem Sie ihn in die vaginale Öffnung einsetzen. Bezeichnen Sie den Morgen eines positiven Vaginalsteckers als embryonalen Tag 0.5 (e0.5). HINWEIS: Ein Vaginalstecker kann entweder oberflächlich (leicht sichtbar, siehe Abbildung 1)oder tief (was nicht leicht sichtbar ist) sein. Das Vorhandensein eines tiefen Steckers blockiert das vollständige Einsetzen der Sonde, während das Fehlen eines Steckers ein vollständiges Einsetzen ohne Widerstand ermöglicht.</li>
	<li>Halten Sie die zeitliche Schwangerschaft aufrecht, bis die Embryonen e11.5 erreichen, an dem sie geerntet werden. Um die Schwangerschaft vor der Ernte von Embryonen zu bestätigen, erfassen Sie das Gewicht weiblicher Mäuse zwischen e7.5 und e11.5. HINWEIS: Die tägliche Erhöhung des Gewichts der Mutter deutet auf eine erfolgreiche Schwangerschaft hin, während keine Gewichtsänderung auf eine fehlgeschlagene Schwangerschaft hindeutet.</li>
</ol>2. Ernte von Embryonen von schwangeren Mäusen
HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass sie über die folgenden Geräte und Reagenzien verfügen: eine CO2-Euthanasiekammer, 70 % Ethanol, Papiertücher, regelmäßige Zangen, feine Zangen, Scheren, 1x sterile Phosphat-gepufferte Kochstoffe (PBS), 10 cm sterile Petrischalen, Behälter mit Eis, perforierter Löffel, Dissektionsstereomikroskop.
<ol><li>Legen Sie eine e11.5 schwangere Maus in eine saubere CO2 Euthanasiekammer, um sie zu opfern. Schließen Sie den Deckel der Kammer, um zu verhindern, dass die Maus entweicht.</li>
	<li>Nachdem die Maus in der Euthanasiekammer gesichert ist, schalten Sie CO2ein. Achten Sie darauf, denCo2-Durchfluss pro IACUC-Empfehlungen zu regulieren (d. h. 10-30% Verdrängung pro Minute). Nachdem die Maus vollständig eingeschläfert wurde, führen Sie zervikale Dislokation durch, um den Tod zu gewährleisten.</li>
	<li>Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut mit Zangen über den Bauch, machen Sie einen kleinen Schnitt mit einer Schere und verlängern Sie den Schnitt seitlich. Vergrößern Den Schnitt vor dem Zwerchfell und entlarven das Gebärmutterhorn, das die Embryonen enthält (Abbildung 2).</li>
	<li>Ziehen Sie die Saite der Embryonen (Gebärmutterhorn + Embryonen) heraus, indem Sie die Gebärmutter greifen und frei schneiden. Legen Sie die Embryoneninin in eiskalte sterile 1x PBS.</li>
	<li>Sezieren Sie die einzelnen Embryonen aus dem Gebärmutterhorn, indem Sie den Gebärmuttermuskel, den Dottersack und das Amnion eins nach dem anderen abschälen (Abbildung 3A-F) unter einem Stereomikroskop. Übertragen Sie die gereinigten Embryonen mit einem perforierten Löffel in eine Petrischale, die sterile 1x PBS auf Eis enthält. Achten Sie darauf, die Embryonen kalt zu halten.</li>
</ol>3. Isolierherzen von e11.5 Embryonen
HINWEIS: Vor Beginn stellen Sie sicher, dass Sie die folgenden Geräte und Reagenzien haben: regelmäßige Zange, feine Zange, 1x sterile PBS, 10 cm sterile Petrischale, 6 cm sterile Petrischale, Behälter mit Eis, perforierter Löffel, DissektionStereomikroskop.
<ol><li>Richten Sie eine neue Petrischale mit eiskalten sterilen 1x PBS unter einem Stereomikroskop ein. Übertragen Sie einen Embryo aus Schritt 2.5 in die Petrischale, um das Herz zu sezieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Kopf des Embryos mit Zangen. Drücken Sie zunächst den Kopf mit einer Hand zwischen die Zange und entfernen Sie dann den Kopf, indem Sie ihn mit der anderen Hand mit geschlossenen Zangen wegkratzen (Abbildung 4A-C).</li>
	<li>Nach dem Entfernen des Kopfes, orientieren Sie den Embryo mit seiner ventralen Seite nach oben, indem Sie den Embryo mit Zange am Bauch mit einer Hand halten (Abbildung 4D).</li>
	<li>Mit der anderen Hand, öffnen Sie die Brustwand des Embryos, indem Sie zuerst einen kleinen Schnitt in der Brust leicht über dem Zwerchfell mit feinen Zangen. Dann vergrößern Sie den Schnitt sehr sorgfältig, indem Sie geschlossene Zangen einsetzen und die Brustwand durch Öffnen der Zange reißen. Achten Sie darauf, nicht zu tief zu stoßen, was das Herz schädigen kann. Mit Hilfe der Zange, halten Sie die Brustwand weit offen, um das Herz und die Lunge in der Brusthöhle auszusetzen (Abbildung 4E).</li>
	<li>Mit feinen Zangen bewegen Sie das Herz vorsichtig anterior (90°) und setzen Sie die dorsale Aorta/Vene aus. Ziehen Sie das Herz/die Lunge vordergründ heraus, indem Sie die dorsale Aorta/Vene an der Basis des Herzens erfassen (Abbildung 4F-H). HINWEIS: Seien Sie sanft beim Herausziehen des Herzens/der Lunge, um ein Reißen des SV zu vermeiden, der sich an der Rückenseite des Herzens befindet.</li>
	<li>Spülen Sie das Herz/die Lunge mit kalten 1x PBS, um Blutzellen zu entfernen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.6, um das Herz/die Lunge von den verbleibenden Embryonen zu entfernen. Achten Sie darauf, das isolierte Herz/die Lunge auf Eis zu halten.</li>
</ol>4. Isolieren von SVs und Ventrikeln von e11.5 Embryonale Mausherzen
<ol><li>Platzieren Sie die Petrischale mit Herz/Lunge aus Schritt 3.7 unter einem Stereomikroskop, um die SVs und ganzen Ventrikel zu isolieren. Die angehängten Lungenlappen eins nach dem anderen mit feinen Zangen von der Wurzel abziehen.</li>
	<li>Richten Sie das Herz auf seiner Rückenseite aus und entfernen Sie Die vordergründigen Vorhöfe und das angrenzende Gewebe, das den SV vordergründ umgibt, ohne den SV zu zerreißen. Entfernen Sie die linke und rechte Vorstation aus dem Herzen, indem Sie an ihrer Basis halten und sie mit feinen Zangen abkratzen (Abbildung 5B). Entfernen Sie das benachbarte Gewebe, das den SV umgibt, mit einer ähnlichen Technik(Abbildung 5C). HINWEIS: Denken Sie daran, dass das richtige Atrium an den SV angeschlossen ist, also achten Sie darauf, nur das Atrium zu entfernen.</li>
	<li>Um den SV zu isolieren, orientieren Sie zuerst das Herz mit seiner Dorsalseite nach oben (weil der SV auf der Dorsalseite ist) und halten Sie das Herz noch in dieser Position, indem Sie das Herz sanft an seinen Ventrikeln mit Zangen halten. HINWEIS: Der SV ist ein Zuflussorgan eines embryonalen Herzens, das zwischen den Vorhöfen auf der Rückenseite des Herzens liegt.</li>
	<li>Entfernen Sie den SV, indem Sie ihn vorsichtig vom Herzen abschälen, wo er befestigt ist, oder indem Sie den SV mit feiner Zange an der Basis seiner Befestigung halten und ihn mit geschlossenen Zangen abkratzen (Abbildung 5D,E).</li>
	<li>Den isolierten SV mit einer sterilen Transferpipette in eine neue 6 cm Petrischale mit eiskalter steriler 1x PBS auf Eis geben und die Petrischale als SV kennzeichnen.</li>
	<li>Um die gesamten Ventrikel zu isolieren, entfernen Sie den Abflusstrakt (Aorta und Lungenstamm) aus dem Herzen, nachdem der SV entfernt wurde (Abbildung 5F,G).</li>
	<li>Die ganzen Ventrikel mit einer sterilen Transferpipette in eine neue 6 cm Petrischale mit sterilen 1x PBS auf Eis geben und die Petrischale als Ventrikel kennzeichnen. Halten Sie den isolierten SV und ventrikel auf Eis.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.7, um SVs und Ventrikel von den verbleibenden Herzen zu isolieren.</li>
</ol>5. Einrichten von Tissue Culture Platten mit Einsätzen und extrazellulärer Matrixbeschichtung
HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass Sie folgende Geräte und Reagenzien haben: kommerzielle extrazelluläre Matrixlösung (ECM; z. B. Matrigel), 8,0 M Polyethylenterephthalat (PET) Kultureinsätze, 24 Wellplatten, 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
<ol><li>Lassen Sie die ECM-Lösung auf Eis auftauen. Halten Sie die ECM-Lösung auf Eis, um eine Erstarrung zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie die PET-Membrankultureinsätze (Porengröße = 8,0 m, Filtrationsfläche = 0,3 cm2, Filterdurchmesser = 6,5 mm) in die Brunnen der behandelten Nicht-Gewebekultur 24 Brunnenplatten. Beschriften Sie die Platten als SV oder Ventrikel für den SV bzw. die endokardialen Angiogenese-Assays. HINWEIS: Richten Sie die Einsätze in separaten Platten für den SV und die Ventrikel ein, wenn beide Kulturen gleichzeitig ausgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie genügend Bohrungen für alle experimentellen Proben und Kontrollen einrichten.</li>
	<li>Nachdem die ECM-Lösung aufgetaut ist, sofort ECM 1:2 in vorgekühltem Basalmedium (d.h. EBM-2-Basalmedium, siehe Materialtabelle)auf ein ausreichendes Volumen (100 l/Einsatz x Anzahl der Einsätze) verdünnen. HINWEIS: Wenn es z. B. sechs Einsätze gibt, beträgt das Gesamtvolumen 100 l x 6 = 600 l. Fügen Sie 200 l ECM in 400 l Basalmedium hinzu.</li>
	<li>Beschichten Sie die Einsätze mit 100 l frisch verdünntem ECM, indem Sie sie direkt auf die Membran legen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für mindestens 30 min, damit das ECM erstarren kann. HINWEIS: Dies muss unter einer laminaren Strömungsgewebekulturhaube durchgeführt werden, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
</ol>6. SVs und ganze Ventrikelkulturen
HINWEIS: Vor Beginn, stellen Sie sicher, die folgenden Geräte und Reagenzien zu haben: 70% Ethanol, Transferpipette, Stereomikroskop, Zange, laminare Flussgewebe Kultur Haube, mikrovaskuläre endotheliale Zelle Ergänzung Kit (Tabelle der Materialien), Basalmedium, 1x sterile PBS). Abbildung 6 zeigt den Arbeitsablauf der SV- und Ventrikelkultur.
<ol><li>Den Inhalt des Ergänzungskits auf Eis auftauen. Bereiten Sie das komplette Medium vor, indem Sie den gesamten Inhalt des Ergänzungskits in 500 ml Basalmedium unter einer zertifizierten laminaren Strömungsgewebekulturhaube hinzufügen. Mischen Sie das Medium gut und verteilen Sie in 50 ml Aliquots.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Basis des Stereomikroskops und den umgebenden Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Erhalten Sie die Gewebekulturplatten aus Schritt 5.4. Mit Hilfe einer Transferpipette die Expflanzen aus Schritt 4.7 vorsichtig auf die Insert-Membran übertragen. Unter einem Stereomikroskop und mit Hilfe von sauberen Zangen, positionieren Sie die Explants in der Mitte der Einsätze, um sicherzustellen, dass sie nicht in der Ecke der Einsätze stecken oder an den Seitenwänden befestigt sind.</li>
	<li>Nachdem die Explants platziert und auf die Einsätze zentriert sind, entfernen Sie vorsichtig alle zusätzlichen PBS aus den Einsätzen und schließen Sie die Deckel der Platten.</li>
	<li>Fügen Sie unter einer laminaren Strömungsgewebekulturhaube 100 l des vorgewärmten kompletten Mediums auf die Einsätze und 200 l in die Brunnen ein, um die Explanten an der Luft-Flüssig-Schnittstelle so zu kultivieren, dass die Basaloberfläche des Einsatzes mit dem Medium in Kontakt steht. , aber die obere Oberfläche ist der Luft ausgesetzt. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Lautstärke anpassen, um eine Luft-Flüssig-Schnittstelle zu erhalten, wenn Sie ein einsetzende Einsätze/Wellplatten unterschiedlicher Größe verwenden.</li>
	<li>Fügen Sie 300 l PBS in die ungenutzten Brunnen der 24 Brunnenplatten und decken Sie mit dem Deckel ab. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator, und wachsen die Kulturen für 5 Tage.</li>
	<li>In den folgenden Tagen beobachten Sie routinemäßig die Kulturen unter einem invertierten Lichtmikroskop, um den Status der Explantkulturen zu beurteilen. Stellen Sie sicher, dass die Explanten kontraktil schlagen und dass alle Explants an der Unterseite der mit ECM eingebetteten Membran befestigt sind. Beachten Sie alle schwimmenden Explants. HINWEIS: Die periodische Kontraktion der Explanten zeigt an, dass sie am Leben sind. Schwimmende Explanten sollten in der Analyse weggelassen werden.</li>
	<li>Nach der Bewertung des Kulturstatus, legen Sie die Kulturplatte wieder in den Inkubator und weiter die Kultur für bis zu 5 Tage wachsen.</li>
</ol>7. Behandlung von Kulturen mit VEGF-A (Positive Control)
HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass die folgenden Geräte und Reagenzien: laminare StrömungSgewebe-Kulturhaube, 1x PBS, Basalmedium + 1% fetales Rinderserum (FBS), Basalmedium + VEGF-A, Pipetten und Pipettenspitzen haben.
<ol><li>Bereiten Sie das Basalmedium + 1% FBS und das Basalmedium + VEGF-A vor.<ol>
<li>Um das Basalmedium + 1% FBS vorzubereiten, bestimmen Sie zunächst die Anzahl der benötigten Kontrollbrunnen. Wenn es z. B. drei Steuerbrunnen gibt, dann ist 300 l/well x 3 = 900 l das gesamt benötigte Volumen. Fügen Sie 9 l FBS in 891 l Basalmedium hinzu, um das Basalmedium + 1% FBS zu bilden.</li>
		<li>Um das Basalmedium + VEGF-A vorzubereiten, bestimmen Sie zunächst die Gesamtzahl der Brunnen, die VEGF-A-Medium benötigen. Wenn es drei Brunnen gibt, dann sind 300 l/well x 3 = 900 l das Gesamtvolumen und 50 ng/well x 3 = 150 ng VEGF-A. Fügen Sie 150 ng VEGF-A in 900 l Basalmedium hinzu, um das Basalmedium + VEGF-A herzustellen. HINWEIS: Montieren Sie diese Lösung mit einem größeren Volumen als berechnet, um eine ausreichende Anzahl kleinerer Aliquots für jedes Experiment zu versichern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie am 2. Tag die Medien aus beiden Kammern (die Einsätze und die Brunnen). Waschen Sie Kulturen mit 300 l 1x PBS, indem Sie den Einsätzen 100 l und die Bohrungen 100 l und die Bohrungen um 200 l ergänzen. Die Platten ein paar Mal fest wirbeln und die PBS entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 300 l Basalmedium + 1% FBS (100 l in den Einsatz und 200 l in die Brunnen) hinzu, um die Kulturen für 24 h auszuhungern.</li>
	<li>Am 3. Tag nach dem Hungertod 300 l Basalmedium + 1% FBS (100 l in den Einsatz und 200 l in die Brunnen) in die Steuerbrunnen bzw. Basalmedium + VEGF-A (50 ng/well) in die Behandlungsbrunnen geben.</li>
	<li>Nach der Behandlung, weiter die Kulturen im Brutkasten wachsen.</li>
</ol>8. Fixierung und Immunostainierung
HINWEIS: Stellen Sie vor Beginn die folgenden Geräte und Reagenzien sicher: 4% Paraformaldehyd (PFA), 1x PBS, primär- und sekundäre Antikörper, einen Shaker, 0,5% nichtionisches Tensid in PBS (PBT).
<ol><li>Am sechsten Tag der Kultivierung, entfernen Sie die Medium und Waschkulturen mit 1x PBS bei Raumtemperatur (RT).<ol>
<li>Fixieren Sie die Kulturen, indem Sie den Bohrstellen 200 L 4% PFA-Lösung und den Einsätzen 100 l hinzufügen. Feste Kulturen in 4 °C für 20 min beim Schaukeln.</li>
		<li>Nach 20 min Fixierung PFA in einer Dunstabzugshaube aus den Kulturen entfernen und die Kulturen mit 1x PBS waschen, indem Sie 200 l in die Brunnen und 100 l in die Einsätze geben.</li>
		<li>Wiederholungswähbe 3x, je 10 min, beim Schaukeln. Fahren Sie dann mit der Immunfärbung fort. HINWEIS: Alle Waschschritte werden auf einer Tischplatte bei RT durchgeführt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdünnung primärer Antikörper (Anti-VE-Cadherin, Anti-ERG 1/2/3) in Blockierlösung (5% Eselserum, 0,5% PBT). Fügen Sie 300 l primärer Antikörperlösung (200 l in den unteren Brunnen und 100 l in die Einsätze) ein. Inkubieren Sie Kulturen in primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C beim Schaukeln. HINWEIS: Anti-VE-Cadherin wird verwendet, um die endotheliale Zellmembran zu beschriften und Anti-ERG 1/2/3 wird verwendet, um den Endothelzellkern zu beschriften, um die angiogenen Sprossen von Endothelzellen zu visualisieren.</li>
	<li>Am nächsten Tag die Kulturplatten 10x in 0,5% PBT waschen und rocken, pbT alle 10 min wechseln.</li>
	<li>Verdünnen Sie die sekundären Antikörper (Esel Anti-Ratte Alexa Fluor 488 und Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555) in Blockierlösung. Fügen Sie 300 l des sekundären Antikörpers wie in Schritt 8.2 hinzu und bebrüten die Kulturen über Nacht bei 4 °C beim Schaukeln. Am nächsten Tag die sekundären Antikörper 10x in PBT waschen und PBT alle 10 min wechseln. HINWEIS: Waschen Sie mindestens 10x, aber mehr Wäschen sind besser. Nachdem die Wässer abgeschlossen sind, können die Kulturen mit 1x PBS gelagert werden, bis sie auf Dias montiert werden.</li>
</ol>9. Montage kulturen auf Dias, Imaging und Analyse
HINWEIS: Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass die folgenden Geräte und Reagenzien: feine Zange, Dias, Montagemedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), Abdeckungen und konfokale Mikroskop. Nach der sekundären Antikörperfärbung montieren Sie die Kulturen mit den folgenden Schritten zur Bildgebung auf Dias.
<ol><li>Ziehen Sie die Membran vorsichtig vom Einsatz mit feinen Zangen ab und übertragen Sie sie auf die Dias, indem Sie die Membranseite nach unten legen und die Explantkulturen nach oben setzen. Platzieren Sie die Replikationsproben in denselben Folien, und beschriften Sie die Folien als Steuerelement oder VEGF-A. Fügen Sie ein paar Tropfen Montagemedium mit DAPI direkt auf die Membran und bedecken Sie die Dias mit Deckelscheinen. HINWEIS: Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden, während Sie die Abdeckungen platzieren.</li>
	<li>Die Ränder der Dias mit klarem Nagellack abdichten und trocknen lassen. HINWEIS: Dias können für eine Langzeitlagerung in -20 °C gelagert werden.</li>
	<li>Bilddiagleitet mit einem konfokalen Mikroskop.</li>
	<li>Führen Sie Analysen durch, um die Länge des angiogenen Auswuchses zu messen. Quantifizieren Sie die angiogene Auswuchslänge, indem Sie den Abstand der Endothelzellen (Ve-Cadherin+/ERG 1/2/3+) messen, die sich von der Innengrenze der ERG 1/2/3+-Zellen in den Ventrikelkulturen und vom Zentrum der SV-Explantationen in den SV-Kulturen ausdehnt.<ol>
<li>Um die Quantifizierung mit FIJI/ImageJ durchzuführen, laden Sie zuerst FIJI Software herunter.</li>
		<li>Bilddateien in FIJI öffnen: Gehen Sie zu Datei | Öffnen | Ordner | Dateiname | Öffnen.</li>
		<li>Gehen Sie zu Analysieren | Festlegen von Messungen | Wählen Sie Perimeter.</li>
		<li>Wählen Sie das Werkzeug Gerade Linie aus dem Hauptfenster aus.</li>
		<li>Zeichnen Sie eine Linie über die Länge eines Keims, wie in Schritt 9.4 vorgeschlagen.</li>
		<li>Gehen Sie zu Analysieren | Maßnahme. HINWEIS: Längenmessungen werden im neuen Fenster angezeigt.</li>
		<li>Führen Sie die Quantifizierung in Bildern durch, die mindestens drei zufällig ausgewählte Sichtfelder darstellen. Durchschnittlich die Sprossenlängenmessungen und melden Sie sie als Mittelwert - Standardabweichung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Ferrara, N., Bunting, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor%2C+a+specific+regulator+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).</li>
<li>Sharma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Progenitor+Cells+Compensate+to+Rebuild+the+Coronary+Vasculature+in+Elabela-+and+Apj-Deficient+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts.</a> Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).</li>
<li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+deletion+of+Ino80+disrupts+coronary+angiogenesis+and+causes+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease.</a> Nature Communications. 9 (1), 368(2018).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Einige der wichtigsten Schritte für den erfolgreichen Anbau von Herzkranzgefäßen aus dem SV- und Endo-Vorläufergewebe sind: 1) Korrekte Identifizierung und Isolierung des SV-Gewebes für die SV-Kultur; 2) Verwendung von Ventrikeln aus Embryonen im Alter von e11-11,5 für eine genaue Endo-Kultur; 3) Aufrechterhaltung steriler Bedingungen während der gesamten Sezierzeit und halten das Gewebe zu jeder Zeit kalt; und 4) Beibehaltung der Anspannung der ECM-beschichteten Membran, um zu vermeiden, dass Gewebe im Medium schwimmt.<...

Blutgefäße des Herzens werden gemeinhin als Herzkranzgefäße bezeichnet. Diese Gefäße bestehen aus Arterien, Venen und Kapillaren. Während der Entwicklung werden zunächst stark verzweigte Kapillaren etabliert, die sich dann in Herzkranzgefäße und Venen1,2,3,4,5umbauen. Diese anfänglichen Kapillaren werden aus endothelialen Vorläuferzellen im Proepikardien, Sinusvenosus (SV) und Endokardgewebe (Endo)1,6,7,8. SV ist das Zuflussorgan des embryonalen Herzens und Endo ist die innere Auskleidung des Herzlumens. Endotheliale Vorläuferzellen, die in der SV und Endo gefunden werden, bilden die Mehrheit der koronaren Vaskulatur, während das Proepikardie zu einem relativ kleinen Teildavon2 beiträgt. Der Prozess, durch den das Kapillarnetz der Herzkranzgefäße im Herzen aus seinen bereits existierenden Vorläuferzellen wächst, wird als koronare Angiogenese bezeichnet. Koronare Herzkrankheit ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit und dennoch fehlt eine wirksame Behandlung für diese Krankheit. Das Verständnis der detaillierten zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese kann bei der Entwicklung neuartiger und effektiver Therapien zur Reparatur und Regenerierung beschädigter Herzkranzgefäße nützlich sein.
In jüngster Zeit wurde durch die Entwicklung neuer Werkzeuge und Technologien ein Anstieg unseres Verständnisses für die Entwicklung von Herzkranzgefäßen erreicht. Insbesondere die In-vivo-Linienkennzeichnung und fortschrittliche Bildgebungstechnologien waren sehr nützlich bei der Aufdeckung des zellulären Ursprungs und der Differenzierungswege von Herzkranzgefäßen9,10,11,12. Trotz der Vorteile dieser In-vivo-Tools gibt es Einschränkungen in Bezug auf Geschwindigkeit, Flexibilität und Zugänglichkeit. Daher können robuste In-vitro-Modellsysteme In-vivo-Systeme ergänzen, um die zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese in einer Art und Weise mit hohem Durchsatz aufzuklären.
Hier beschreiben wir ein In-vitro-Modell der koronaren Angiogenese. Wir haben ein In-vitro-Explantenkultursystem entwickelt, um Herzkranzgefäße aus zwei Vorläufergeweben, SV und Endo, anzubauen. Mit diesem Modell zeigen wir, dass die In-vitro-Gewebeexplantationskulturen koronare Gefäßsprossen wachsen, wenn sie durch Wachstumsmedium stimuliert werden. Zusätzlich wachsen die Explant-Kulturen schnell im Vergleich zur Kontrolle, wenn sie durch den vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor A (VEGF-A), ein hochwirksames angiogenes Protein, stimuliert werden. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die angiogenen Sprossen aus der SV-Kultur venös dedifferenziert werden (Verlust der COUP-TFII-Expression), ein Mechanismus ähnlich der SV-Angiogenese in vivo1. Diese Daten deuten darauf hin, dass das In-vitro-Explantenkultursystem angiogene Ereignisse, die in vivo auftreten, originalgetreu wieder einführt. Zusammen genommen sind In-vitro-Modelle der Angiogenese, die hier beschrieben werden, ideal für die Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen der koronaren Angiogenese in einer hohen Durchsatz- und zugänglichen Weise.

<table><tbody><tr><td>100 x 20 MM Gewebekulturschale</td><td>Fisher</td><td>Scientific 877222</td><td>Im Protokoll als Petrischale bezeichnet</td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>8,0 μm PET-Membrankultureinsätze</td><td>Millipore Sigma</td><td>MCEP24H48</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey Anti-Kaninchen 555</td><td>Fisher Scientific</td><td>A31572</td><td>Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Esel Anti-Ratte 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>Sekundärer Antikörper</td></tr><tr><td>Abgewinkelte Metallsonde</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>10088-15</td><td>Abgewinkelt 45 Grad, verwendet zum Nachweis tiefer Pfropfen</td></tr><tr><td>Anti-ERG 1/2/3 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab92513</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-VE-Cadherin-Antikörper</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB550548</td><td>Primärer Antikörper, Hersteller BD BioSciences</td></tr><tr><td>CO2 Gastank</td><td>Diverse Lieferanten</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>13998223</td><td>Für 37 > C, 5% CO2 Inkubation</td></tr><tr><td>Dissektion Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>S9i</td><td>Leica S9i Stereomikroskop</td></tr><tr><td>EBM-2 Basalmedium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>Basalmedium für das Wachstum von Endothelzellen</td></tr><tr><td>ECM-Lösung</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Handelsüblich als Matrigel</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Singlequots Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td>Nahrungsergänzungskit für mikrovaskuläre Endothelzellen; Dies wird in das EBM-2 gemischt, um das EGM-2 zu vervollständigen</td></tr><tr><td>Medium Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003IR</td><td></td></tr><tr><td>FiJi</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>Bildverarbeitungssoftware (<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads" target="_blank">https://imagej.net/Fiji/Downloads</a>)</td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>11412-11</td><td>Wird für Embryonen verwendet </td></tr><tr><td>Dissektion Fisherbrand Operationsschere mit gerader Klinge</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-808-4</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH-302-5601LR</td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Gewebekulturhaube</td><td>Fisher Scientific</td><td>verschiedene Modelle verfügbar</td><td></td></tr><tr><td>Einbettmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Vectashield mit DAPI</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Elektronenmikroskopie/Fisher</td><td>50-980-494</td><td>Dies ist bei 32% erhältlich; muss auf 4% verdünnt</td></tr> <tr><td>werdenPerforierter Löffel</td> Werkzeuge <td>für die Feinforschung</td><td>10370-18</td><td>Nützlich bei der Entfernung von Embryonen/Geweben aus einer Lösung</td></tr><tr><td>Rekombinante Maus VEGF-A 165</td><td>PeproTech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>Standardzange, Dumont #5</td><td>Werkzeuge für die Feinforschung</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Sure-Seal Maus-/Rattenkammer</td><td>Easysysteminc</td><td>EZ-1785</td><td>Euthanasiekammer</td></tr></tbody></table>

in vitro modell der koronaren angiogenese

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Hier beschreiben wir einen In-vitro-Kulturtest zur Untersuchung der koronaren Angiogenese. Herzkranzgefäße ernähren den Herzmuskel und sind von klinischer Bedeutung. Defekte in diesen Gefäßen stellen schwere Gesundheitsrisiken dar, wie z. B. bei Arteriosklerose, die bei Patienten zu Herzinfarkten und Herzinsinnen führen kann. Folglich ist die koronare Herzkrankheit eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Trotz seiner klinischen Bedeutung wurden relativ wenig Fortschritte bei der Regenerierung beschädigter Herzkranzgefäße erzielt. Dennoch wurden in jüngster Zeit Fortschritte beim Verständnis des zellulären Ursprungs und der Differenzierungswege der Entwicklung von Koronaren erzielt. Das Aufkommen von Werkzeugen und Technologien, die es Forschern ermöglichen, Vorläuferzellen fluoreszierend zu kennzeichnen, ihrem Schicksal zu folgen und Progenies in vivo zu visualisieren, hat entscheidend dazu beigetragen, die Entwicklung des koronaren Gefäßes zu verstehen. In-vivo-Studien sind wertvoll, haben aber Einschränkungen in Bezug auf Geschwindigkeit, Zugänglichkeit und Flexibilität im experimentellen Design. Alternativ können genaue In-vitro-Modelle der koronaren Angiogenese diese Einschränkungen umgehen und es Forschern ermöglichen, wichtige biologische Fragen mit Schnelligkeit und Flexibilität zu hinterfragen. Das Fehlen geeigneter In-vitro-Modellsysteme könnte den Fortschritt beim Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen des koronaren Gefäßwachstums behindert haben. Hier beschreiben wir ein In-vitro-Kultursystem zum Anbau von Herzkranzgefäßen aus dem Sinus venosus (SV) und dem Endokard (Endo), den beiden Vorläufergeweben, aus denen viele der Herzkranzgefäße entstehen. Wir bestätigten auch, dass die Kulturen einige der bekannten In-vivo-Mechanismen genau rekapitulieren. Zum Beispiel zeigen wir, dass die angiogenen Sprossen in der Kultur von SV DEN COUP-TFII-Ausdruck ähnlich dem, was in vivo beobachtet wird, herunterregulieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass VEGF-A, ein bekannter angiogener Faktor in vivo, die Angiogenese sowohl aus der SV- als auch aus der Endo-Kultur robust stimuliert. Gemeinsam haben wir ein genaues In-vitro-Kulturmodell entwickelt, um die koronare Angiogenese zu untersuchen.

Eines der auffälligsten Merkmale der SV-Angiogenese in vivo ist, dass sie einem bestimmten Weg folgt und Zelldedifferenzierungs- und Redifferenzierungsereignisse beinhaltet, die zu stereotypen Zeiten und Positionen1auftreten. Da die ersten SV-Zellen auf den Herzventrikel wachsen, stellen sie die Produktion von venösen Markern wie COUP-TFII (Abbildung 7) ein. Anschließend nehmen koronare Sprossen zwei Migrationspfade, entweder über die ...

In-vitro-Modelle der koronaren Angiogenese können für die Entdeckung der zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese verwendet werden. In-vitro-Explantationskulturen von Sinusvenosus und Endokardgewebezeigen weisen als Reaktion auf VEGF-A ein robustes Wachstum auf und weisen ein ähnliches Muster der COUP-TFII-Expression auf wie in vivo.

In Vitro Modell der koronaren Angiogenese

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Unser Protokoll ist wichtig, weil es Forschern ermöglicht, den molekularen Mechanismus der koronaren Angiogenese außerhalb eines Organismus zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie den Prozess der koronaren Angiogenese in einem Organismus genau modelliert und die Untersuchung der Mechanismen der koronaren Angiogenese erleichtert. Beginnen Sie damit, eine schwangere Maus zu sprühen, die embryonale 11,5 Embryonen mit 70% Ethanol trägt.Heben Sie die Haut über den Bauch mit Zange, verwenden Sie eine Schere, um eine Bauchhaut und Peritonealschnitt seitlich und vor dem Zwerchfell zu machen, um das Gebärmutterhorn auszusetzen. Greifen Sie die Gebärmutter, schneiden Sie das Gewebe frei und ziehen Sie das Gebärmutterhorn. Legen Sie die Reihe der Embryonen in eiskalte sterile PBS unter einem Stereomikroskop, und schälen Sie den Gebärmuttermuskel, Dengelbsack und amnion Abdeckung von jedem Embryo.Wenn jeder Embryo isoliert ist, verwenden Sie einen perforierten Löffel, um das Gewebe in eine neue Petrischale mit sterilem PBS auf Eis zu übertragen. Um das embryonale Herzgewebe zu ernten, übertragen Sie den ersten Embryo, der in eine neue Petrischale unter dem Mikroskop seziert wird, und legen Sie den Embryo in die ventrale Seite. Verwenden Sie feine Zangen, um einen kleinen Schnitt in der Brust zu machen, etwas über dem Zwerchfell, und setzen Sie die geschlossenen Zangen in den Schnitt, um den Schnitt zu vergrößern.Verwenden Sie die Zange, um die Brustwand offen zu halten, um das Herz und die Lunge freizulegen, verwenden Sie ein zweites Paar Zangen, um das Herz sanft um 90 Grad zu bewegen, um die dorsale Aorta und Vene freizulegen. Dann, diese Gefäße an der Basis des Herzens greifen, ziehen Sie vorsichtig das Herz und die Lunge vor und spülen Sie das Gewebe mit kalten PBS. Wenn das gesamte Herzgewebe geerntet ist, stellen Sie die Herzproben unter das Mikroskop und entfernen Sie die Lungenlappen aus jedem Herz.Richten Sie das erste Herz auf seiner rückenden Seite, und halten Sie das Herz an seiner Basis, verwenden Sie feine Zange, um die linke und rechte Vorhöfe im angrenzenden Gewebe um den SV aus dem Herzen zu kratzen. Um den SV zu isolieren, richten Sie die Herz-Rückenseite nach oben. Entfernen Sie den SV vorsichtig aus dem Herzen und verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um das isolierte Gewebe in eine neue sechs Zentimeter lange Petrischale mit eiskaltsterilem PBS auf Eis zu legen.Um die gesamten Ventrikel zu isolieren, entfernen Sie den Abflusstrakt und verwenden Sie eine neue sterile Transferpipette, um die Ventrikel in eine separate sechs Zentimeter lange Petrischale zu legen, die eiskalte sterile PBS auf Eis enthält. Um SV und ganze Ventrikelkulturen einzurichten, beschichten Sie zunächst die Membranen eines acht Mikrometer Poren PET-Kultureinsatzes pro Brunnen einer 24-Well-Kulturplatte, mit 100 Mikroliter frisch verdünnter extrazellulärer Matrix pro Kultur für mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Wenn die Matrix verfestigt ist, verwenden Sie eine Transferpipette, um eine Explantation auf jeden Einsatz zu übertragen, und bewegen Sie die Platte unter dem Mikroskop.Positionieren Sie die Explants mit sauberen Zangen in der Mitte jedes Inserts, um sicherzustellen, dass sie nicht an den Seitenwänden befestigt sind, und entfernen Sie sorgfältig alle zusätzlichen PBS. Als nächstes übertragen Sie die Platte mit dem Deckel geschlossen unter einer laminaren StrömungSgewebe-Kulturhaube, und fügen Sie 100 Mikroliter vorgewärmtkomplettes Medium zu jedem Einsatz, und 200 Mikroliter auf den Brunnen unter jedem Einsatz. Dann fügen Sie 300 Mikroliter PBS zu allen ungenutzten Brunnen hinzu und legen Sie die Platte für fünf Tage in den Zellkultur-Inkubator.Für DIE VEGF-A-Behandlung am zweiten Tag der Kultur, entfernen Sie das Medium aus beiden Kammern jeder Kultur und fügen Sie 100 Mikroliter PBS zu jedem Einsatz und 200 Mikroliter PBS zu jedem Brunnen hinzu. Nachdem Sie die Platte ein paar Mal gewirbelt haben, ersetzen Sie die PBS durch 300 Mikroliter Basalmedium, ergänzt durch 1%fetales Rinderserum, um die Kulturen zu starten, und geben Sie die Platte an den Inkubator zurück. Am dritten Tag nach dem Hungertod 300 Mikroliter frisches Basalmedium plus Serum in die Kontrollbrunnen und Basalmedium plus 50 Nanogramm pro Milliliter VEGF-A in die Behandlungsbrunnen geben und die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben.Waschen Sie am sechsten Kulturtag die Kammern wie gezeigt mit PBS und fixieren Sie die Kulturen mit 200 Mikrolitern 4%Paraformaldehyd in jedem Brunnen und 100 Mikroliter Fixativ in jedem Einsatz. Nach 20 Minuten bei 4 Grad Celsius mit Schaukeln die Kulturen mit 300 Mikroliter PBS für 10 Minuten pro Wäsche mit Schaukeln bei Raumtemperatur waschen. Nach der letzten Wäsche 300 Mikroliter Primärantikörperlösung in die Brunnen geben und für eine Nachtkultur bei vier Grad Celsius mit Schaukeln einsetzen.Am nächsten Morgen die Kulturen zehnmal in nicht-ionischem Tensid in PBS mit Schaukeln waschen und die Waschlösung alle 10 Minuten wechseln, bevor die Kulturen mit 300 Mikrolitern eines geeigneten Fluorophorkonjugatierten Sekundärantikörpers bei vier Grad Celsius über Nacht mit Schaukeln gekennzeichnet werden. Am nächsten Tag die Kulturen 10 Mal in frischem PBS mit nichtionischen Tensid waschen, wie gezeigt. Nach dem letzten Waschen verwenden Sie feine Zangen, um die Membran sorgfältig von jedem Einsatz zu schälen und die Membranen auf einzelne Glasmikroskop-Dias zu legen, seitenach oben zu explantieren.Bedecken Sie die Proben mit DAPI ergänzten Montagemedium in einem Deckelschlupf, und versiegeln Sie die Kanten der Abdeckung Supleinen mit klarem Nagellack. Wenn der Nagellack getrocknet ist, stellen Sie die Dias durch konfokale Mikroskopie ab. Da die ersten SV-Zellen auf den Herzventrikel wachsen, stellen sie die Produktion von venösen Markern wie Coup-TF2 ein.Nach fünf Tagen Kultur sprießen SV-Endothelzellen und wandern auf die Membran. Wie im embryonalen Herzen wird die Coup-TF2-Expression reduziert, wenn die Gefäße vom SV wegwandern. Kulturen, die mit VEGF-A stimuliert werden, zeigen ein erhöhtes Wachstum angiogener Sprossen sowohl in der Dichte als auch in der Länge. Weitere SV-Kulturen, die durch VEGF-A stimuliert werden, zeigen eine fast dreifache Erhöhung der Sprossenlänge im Vergleich zu Kontrollen, was darauf hindeutet, dass Endothelsprossen von SV und Endokard auf VEGF-A reagieren.Es ist wichtig, das SV-Gewebe nicht zu verlieren, während das Herz und die Lunge herausgezogen, die Vorhöfe entfernt und das angrenzende Gewebe rund um den SV gereinigt wird. Live-Bildgebungsexperimente können durchgeführt werden, um die koronare Angiogenese zu visualisieren und die Details der zellulären und molekularen Dynamik während des Prozesses zu erfassen. Diese Technik ist äußerst nützlich für die Bewertung potenzieller molekularer Mechanismen der koronaren Angiogenese und als Modellsystem zur Untersuchung der Angiogenese im Allgemeinen.

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Forschung

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Medizin

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Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine...

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Hier präsentieren wir eine neuartige Anwendung der Aorta Ring-Test, wo sind prelabelled mesenchymale Zellen Co kultiviert mit Ratte Aorta abgeleitet endotheliale Netzwerke. Diese neuartige Methode ermöglicht die Visualisierung von mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) Homing und Integration mit endothelialen Netzwerken, Quantifizierung der Netzwerkeigenschaften und Auswertung von MSC Immunophenotypes und gen-Expression.

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Die hier vorgestellte Methode kann die Wirkung von Reagenzien auf die Angiogenese oder die Gefäßpermeabilität in vivo ohne Färbung bewerten. Die Methode verwendet die Dextran-FITC-Injektion über die Schwanzvene, um Neogefäße oder Gefäßleckagen sichtbar zu machen.

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Die Keimangiogenese, die für Entwicklung und Krankheit von grundlegender Bedeutung ist, umfasst komplexe molekulare und mechanische Prozesse. Wir präsentieren ein vielseitiges 2,5D-ex vivo-Modell , das das zelluläre Keimen aus Schweine-Halsschlagadern analysiert und dabei die steifigkeitsabhängige Angiogenese und die ausgeprägte Leader-Follower-Zellmechanik aufdeckt. Dieses Modell hilft bei der Weiterentwicklung von Tissue-Engineering-Strategien und Krebstherapieansätzen.

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Erfahren Sie ein in vitro Modell zur Untersuchung der koronaren Angiogenese mit Explantatkulturen von Sinus venosus und Endokardgewebe. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Reaktionen auf VEGF-A.

In Vitro Modell der koronaren Angiogenese

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