Name: Herstellung einer Nahinfrarot-empfindlichen Core-Shell-Impfstoff-Bereitstellungsplattform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Polybubbles mit PLGA und PCL für Impfstoffbereitstellung. Diese Methode ermöglicht verzögerte Freisetzung und verbesserte Stabilität von Wirkstoffen bei der Lagerung.

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Wir danken Dr. Bryan E. Tomlin, der dem Elementaranalyselabor der TAMU angeschlossen ist und bei der Neutronenaktivierungsanalyse (NAA) geholfen hat.

1. Polycaprolacyontriacrylat (PCLTA) Synthese
<ol><li>3,2 ml 400 Da Polycaprolacyon (PCL) über Nacht bei 50 °C in einem offenen 200 ml runden Bodenkolben und K2CO3 in einer Glasdurchstechflasche bei 90 °C trocknen.</li>
	<li>Mischen Sie das Triol mit 6,4 ml Dichlormethan (DCM) und 4,246 g Kaliumcarbonat (K2CO3) unter Argon.</li>
	<li>2,72 ml Acrylylchlorid in 27,2 ml DCM mischen und tropfenweise in das Reaktionsgemisch im Kolben über 5 min geben.</li>
	<li>Bedecken Sie das Reaktionsgemisch mit Aluminiumfolie und lassen Sie es bei Raumtemperatur 24 h unter Argon ungestört.</li>
	<li>Filtern Sie nach 24 h das Reaktionsgemisch mit einem Filterpapier auf einem Buchner-Trichter unter Vakuum, um überschüssige Reagenzien zu entsorgen.</li>
	<li>Ausfällungfiltrat aus Schritt 1.5, das das endbedeckte Polymer in Derethylether in einem 1:3 (vol/vol) und Rotovape bei 30 °C enthält, um den Diethylether zu entfernen.</li>
</ol>2. Bildung der Polybubble
HINWEIS: Das Einspritzen von Polymer in das deionisierte (DI) Wasser würde dazu führen, dass die Polybubbles auf den Boden der Durchstechflasche wandern, was zu abgeflachten Böden führt. Verwenden Sie 10% (wt/vol) Carboxymethylcellulose (CMC) füllen Sie stattdessen die Glasdurchstechflasche, um polybubble Abflachung zu vermeiden.
<ol><li>Bereiten Sie 10% (wt/vol) CMC-Lösung in DI-Wasser vor.</li>
	<li>Füllen Sie eine 0,92 ml Glasdurchstechflasche mit 0,8 ml 10% CMC mit einer 1 ml Transferpipette.</li>
	<li>Mischen Sie 1000 mg/ml von 14 kDa PCL in DCM und synthetisieren SIE PCLTA in einem 1:3 (vol/vol) für ein Gesamtvolumen von 200 l oder bereiten Sie 200 l von 1000 mg/ml von 5 kDa Poly (Milch-Co-Glykolsäure) Diakrylat (PLGADA) in Chloroform vor.</li>
	<li>Mischen Sie das 2-Hydroxy-4-(2-Hydroxyethoxy)-2-Methylpropiophenon (Photoinitiator) mit dem Polymergemisch (PLGADA oder PCL/PCLTA) in 0,005:1 (vol/vol).</li>
	<li>Laden Sie 200 l Polymergemisch in eine 1 ml Glasspritze, die auf einer Spritzenpumpe montiert ist, die mit einem Dosier-Edelstahlrohr mit einem Innendurchmesser von 0,016 Zoll verbunden ist.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Mikromotor, um die Vorwärts- und Rückwärtsbewegung des Polymerrohres zu steuern, um Polymer in die 10% CMC in der Glasdurchstechflasche zu injizieren, um die Polybubble zu bilden.</li>
	<li>Härten Sie die Polybubbleen unter ultraviolett (UV) bei 254 nm Wellenlänge für 60 s bei 2 W/cm2.</li>
	<li>Blitz einfrieren die Polybubbleen in flüssigem Stickstoff und lyophilisieren über Nacht bei 0,010 mBar Vakuum und bei -85 °C.</li>
	<li>Trennen Sie die Polybubbles von der getrockneten CMC mit Zangen und waschen Sie die Polybubbles mit DI-Wasser, um restliche CMC zu entfernen. Beachten Sie, dass andere Polymere wahrscheinlich mit Modifikationen verwendet werden können, um die Freisetzungskinetik zu verändern.</li>
</ol>3. Modulation des Polybubble-Durchmessers
<ol><li>Füllen Sie eine 0,92 ml Glasdurchstechflasche mit 10% CMC mit einer 1 ml Transferpipette.</li>
	<li>Mischen Sie PCL/PCLTA in einem 1:3 (vol/vol) mit 1000mg/mL 14kDa PCL und synthetisieren PCLTA. Den Photoinitiator mit Polymermischung in einem 0,005:1 (vol/vol) mischen.</li>
	<li>Laden Sie das Polymergemisch in eine 1 ml Glasspritze, die auf einer Spritzenpumpe montiert ist und mit einem Dosier-Edelstahlrohr mit einem Innendurchmesser von 0,016 Zoll verbunden ist.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Mikromotor, um die Vorwärts- und Rückwärtsbewegung des Polymerrohres zu steuern, um Polymer in die 10% CMC in der Glasdurchstechflasche zu injizieren, um die Polybubble zu bilden.</li>
	<li>Um Polybubbles mit verschiedenen Durchmessern zu erhalten, variieren Sie die Dosierrate von 0,0005 bis 1 l/s.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder der Durchstechflasche mit den Polybubbles mit unterschiedlichem Durchmesser auf.</li>
	<li>Verwenden Sie ImageJ, um den Durchmesser der Polybubbles zu quantifizieren und die Größe der Durchstechflasche als Maßstab zu verwenden.</li>
</ol>4. Zentrierung der Ladung innerhalb von Polybubble
<ol><li>
Modulation der PCL/PCLTA-Viskosität mit K2CO3: HINWEIS: Die Viskosität von PLGADA muss nicht mit K2CO3 geändert werden, da die Viskosität von 5 kDa PLAGDA bei 1000 mg/ml für die Zentrierung der Ladung ausreicht.<ol>
<li>Fügen Sie k2CO3 (das nach der PCLTA-Reaktion isoliert wurde) in unterschiedlichen Konzentrationen wie 0 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40 mg/ml und 60 mg/ml zum PCLTA hinzu.</li>
		<li>Messen Sie die dynamische Viskosität der Lösungen, indem Sie die Scherrate mit Rheometrie von 0 auf 1000 1/s ändern.</li>
		<li>Injizieren Sie die Ladung manuell in die Mitte (siehe Schritt 4.2 zur Herstellung des Ladungsgemischs) der Polybubbleen, die mit den PCL/PCLTA-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen von K2CO3 (Schritt 4.1.1) gebildet wurden. Bestimmen Sie die optimale Konzentration vonK2CO3, indem Sie beobachten, welche Lösung ab Schritt 4.1.1 zur Retention der Ladung in der Mitte führen kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zentrierung der Ladung (bereits gezeigte Machbarkeit mit kleinen Molekülen) mit CMC
	<ol>
<li>Mischen Sie die Ladung mit 5% (wt/vol) CMC in einem Rotator über Nacht, um die Viskosität der Ladung zu erhöhen.</li>
		<li>In die Polybubble 2 l Ladungsgemisch manuell injizieren und mit UV-Härtung bei 254 nm Wellenlänge für 60 s bei 2 W/cm2fortfahren.</li>
		<li>Blitz einfrieren die Polybubbleen in flüssigem Stickstoff für 30 s und lyophilisieren über Nacht bei 0,010 mBar Vakuum und bei -85 °C.</li>
		<li>Trennen Sie die Polybubbles von der getrockneten CMC mit Zangen und waschen Sie mit DI-Wasser, um restliche CMC zu entfernen.</li>
		<li>Schneiden Sie die Polybubble in die Hälfte und stellen Sie die Hälften mit konfokaler Mikroskopie ab, um sicherzustellen, dass die Ladung zentriert ist (siehe Schritt 6 für die verwendeten Anregungs- und Emissionswellenlängen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Frachtformulierung
HINWEIS: Polybubble-Formulierung kann verschiedene Ladungstypen beherbergen, einschließlich kleiner Moleküle, Proteine und Nukleinsäuren.
<ol><li>Basierend auf früheren Studien, im Falle von Proteinladung, verwenden Sie Hilfsstoffe einschließlich Polyethylenglykol (PEG)6, Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Glykopolymere6, um die Stabilität des Proteins während der Polybubble-Formulierung zu verbessern.</li>
	<li>Form polybubbles basierend auf dem Protokoll in Schritt 2.</li>
	<li>Bereiten Sie die Antigenlösung vor, indem Sie 17,11 g Trehalose zu 625 L HIV gp120/41 Antigen hinzufügen.</li>
	<li>In die Mitte der Polybubble 1 L Antigenlösung manuell injizieren.</li>
	<li>Öffnen Sie Polybubbleen an den Tagen 0, 7, 14 und 21 und erfassen Sie die Fluoreszenz von Antigen mit Anregungs- und Emissionswellenlängen 497 nm bzw. 520 nm.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Funktionalität des Antigens mit dem enzymgebundenen Immunsorbent Assay (ELISA) und verwenden Sie 5% fettfreie Milch als Sperrpuffer.</li>
</ol>6. Freigabe der Ladung
ANMERKUNG: Kleine Moleküle oder Antigene können als Frachtart verwendet werden
<ol><li>
Kleines Molekül
	<ol>
<li>Inkubieren Sie Polyblasen mit zentriertem Acriflavin in 400 l Phosphatpuffer-Saline (PBS) bei 37 °C, 50 °C für PLGADA-Polybubbleen und bei 37 °C, 50 °C, 70 °C für PCL/PCLTA-Polybubbleen. HINWEIS: Der Grund, warum wir empfehlen, über Körpertemperaturen zu testen, ist a) die Temperatur (50 °C) zu simulieren, bei der die Polybubble beim Lasern der Gold-Nanostäbe (AuNRs) innerhalb von PCL und PLGA erreicht; und b) den Abbauprozess von PCL (50 °C, 70 °C) beschleunigen.</li>
		<li>Sammeln Sie zu jedem Zeitpunkt die Überstande und ersetzen Sie sie durch 400 l frische PBS.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Fluoreszenzintensitäten in den gesammelten Übersprechern zu quantifizieren. HINWEIS: Verwenden Sie ex/em von 416 nm/514 nm für Acriflavine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antigen
	<ol>
<li>Inkubieren Sie Polybubbleen mit zentriertem Rinderalbuminserum (BSA)-488 in 400 l PBS bei 37 °C, 50 °C für PLGADA-Polybubbleen und bei 37 °C, 50 °C für PCL/PCLTA-Polybubbleen.</li>
		<li>Sammeln Sie zu jedem Zeitpunkt die Überstande und ersetzen Sie sie durch 400 l frische PBS.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Fluoreszenzintensitäten in den gesammelten Übersprechern zu quantifizieren. Verwenden Sie ex/em von 497 nm/520 nm für BSA-488. HINWEIS: Eine Release-Studie bei 70 °C für PCL/PCLTA-Polybubbleen sollte nicht durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass das Antigen extremen Temperaturen aussetzt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Toxizität
<ol><li>
Quantifizierung des Chlorgehalts in Polyblasen mittels Neutronenaktivierungsanalyse (NAA)
	<ol>
<li>Verwenden Sie Polybubbleen, die für 2, 4, 6, 20 und 24 h für diese Studie bei 0,010 mBar Vakuum und bei -85 °C lyophilisiert wurden.</li>
		<li>Messen Sie 5-9 mg Polybubbleen und legen Sie sie auf LDPE Bestrahlungsfläschchen.</li>
		<li>Bereiten Sie 1000 g/ml Chlorkalibrierungslösung vom nationalen Institut für Normen und Technologie (NIST) -rückverfolgbare Kalibrierlösung vor.</li>
		<li>Verwenden Sie 1-Megawatt Triga-Reaktor, um Neutronenbestrahlungen an jeder Probe mit Neutronenfluzon von 9,1 × 1012 /cm2s für 600 s durchzuführen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Polybubbles auf unirradiated Fläschchen.</li>
		<li>Verwenden Sie den HPGe-Detektor, um Gamma-Strahlenspektren für 500 s nach 360 s Zerfallsintervallen zu erhalten.</li>
		<li>Verwenden Sie die NAA-Software von canberra Industries, um die Daten zu analysieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantifizierung des Chlorgehalts, der aus Polybubbleen mit NAA freigesetzt wird
	<ol>
<li>Inkubieren Sie Polybubbleen, die über Nacht lyophilisiert wurden (bei 0,010 mBar Vakuum und bei -85 °C) in 400 l PBS bei 37 °C.</li>
		<li>Sammeln Sie die Überstande in den Wochen 1, 2 und 3 nach der Inkubation.</li>
		<li>Analysieren Sie die Übersprecher auf den Chlorgehalt mit NAA mit der gleichen Methode wie oben in Schritt 7.1 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. AuNR-Synthese von Kittler, S., et al.8
<ol><li>Bereiten Sie die AuNR-Saatlösung vor, indem Sie 250 l 10 mM Chlorauurinsäure (HAuCl4), 7,5 ml 100 mM Cetrimoniumbromid (CTAB) und 600 l mit 10 ml eiskaltem Natriumborohydrid (NaBH4)mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Wachstumslösung vor, indem Sie 40 ml 100 ml CTAB, 1,7 ml 10 mM HAuCl4, 250 l Silbernitrat (AgNO3) und 270 l mit 17,6 mg/ml Ascorbinsäure in ein Rohr mischen.</li>
	<li>420 L Saatlösung mit der Wachstumslösung bei 1200 Rpm für 1 min kräftig mischen. Dann lassen Sie die Mischung ungestört für 16 h reagieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die überschüssigen Reagenzien aus dem Gemisch durch Zentrifugieren bei 8000 × g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand.</li>
</ol>9. Hydrophobeisierung von AuNRs durch Soliman, M.G., et al.9
<ol><li>Stellen Sie den pH-Wert von 1,5 ml synthetisierter CTAB-stabilisierter AuNRs mit 1 mM Natriumhydroxid (NaOH) auf 10 ein.</li>
	<li>Die Lösung mit 0,1 ml 0,3 ml methyliertem PEG (mPEG) Thiol bei 400 Umdrehungen von pm über Nacht umrühren.</li>
	<li>PeGylated AuNRs mit 0,4 M Dodecylamin (DDA) in Chloroform bei 500 Rpm 4 Tage mischen.</li>
	<li>Pipet die obere organische Schicht, die hydrophobe AuNRs enthält, und lagern Sie bei 4 °C bis zur zukünftigen Verwendung.</li>
</ol>10. NIR-Aktivierung von Polybubbleen
<ol><li>Mischen Sie die Polymerlösung (PLGADA oder PCL/PCLTA) mit hydrophobisierten AuNRs in einem 1:9 (vol/vol).</li>
	<li>Photoinitiator in einem 0,005:1 (vol/vol) in die Polymer-AuNR-Mischung geben.</li>
	<li>Bilden Sie Polyblasen, indem Sie das Polymer-AuNR-Gemisch in eine 0,92 ml Glasdurchstechflasche mit 10% CMC (wt/vol) injizieren (siehe Schritt 2).</li>
	<li>Härten Sie die Polybubbleen bei 254 nm Wellenlänge für 60 s bei 2 W/cm2.</li>
	<li>Blitzeinfrieren in flüssigem Stickstoff für 30 s und Lyophilisieren über Nacht bei 0,010 mBar Vakuum und bei -85 °C.</li>
	<li>Trennen Sie die getrockneten Polybubbles mit Zangen und waschen Sie sie mit DI-Wasser, um eventuelle Reste von CMC zu entfernen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Polyblasen in 400 l PBS bei 37 °C.</li>
	<li>Aktivieren Sie die Polybubbles mit 801 nm NIR-Laser bei 8A für 5 min jeden Montag, Mittwoch und Freitag.</li>
	<li>Nehmen Sie vorausschauende Infrarot-Bilder (FLIR) der Polybubble vor und nach der Laseraktivierung auf, um Temperaturwerte zu erhalten.</li>
	<li>Berechnen Sie Temperaturunterschiede zwischen vor und nach der Laseraktivierung basierend auf den Temperaturwerten aus den FLIR-Bildern.</li>
</ol>

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</ol>

Autoren haben nichts zu verraten.

Aktuelle Technologien und Herausforderungen Emulsionsbasierte Mikro- und Nanopartikel wurden häufig als Träger von Arzneimittelzufuhrenthalten verwendet. Obwohl die Freisetzungskinetik der Ladung von diesen Geräten ausgiebig untersucht wurde, war die Steuerung der Burst-Release-Kinetik eine große Herausforderung11. Die Vielseitigkeit und Funktionalität von Fracht ist auch bei Emulsionssystemen eingeschränkt, da die Ladung übermäßig wässrigen und organischen Lösungsmitteln ausge...

Begrenzte Impfabdeckung führt zum Tod von 3 Millionen Menschen, die speziell durch durch Impfung vermeidbareKrankheiten1 verursacht werden. Unzureichende Lagerungs- und Transportbedingungen führen zur Verschwendung funktioneller Impfstoffe und tragen so zu einer reduzierten globalen Immunisierung bei. Darüber hinaus führt eine unvollständige Impfung aufgrund der Nichteinhaltung der erforderlichen Impfpläne auch zu einer begrenzten Impfabdeckung, insbesondere in Entwicklungsländern2. Innerhalb des empfohlenen Zeitraums sind mehrere Besuche des medizinischen Personals erforderlich, um Booster-Shots zu erhalten, wodurch der Prozentsatz der Bevölkerung mit vollständiger Impfung begrenzt wird. Daher müssen neue Strategien für die kontrollierte Impfstoffabgabe entwickelt werden, um diese Herausforderungen zu umgehen.
Zu den derzeitigen Bemühungen um die Entwicklung von Impfstoffabgabetechnologien gehören emulsionsbasierte Polymersysteme3,4. Die Ladung ist jedoch häufig einer größeren Menge an organischem Lösungsmittel ausgesetzt, die potenziell Aggregation und Denaturierung verursachen kann, insbesondere im Zusammenhang mitproteinbasierterLadung 5,6. Wir haben eine neuartige Impfstoff-Lieferplattform entwickelt, "Polybubbles", die potenziell mehrere Laderäume beherbergen kann, während das Frachtvolumen, das dem Lösungsmittel7ausgesetzt ist, minimiert wird. In unserer Polybubble-Kernschalenplattform wird beispielsweise eine Ladetasche mit einem Durchmesser von 0,38 mm (SEM) in die Mitte einer 1 mm Polybubble injiziert. In diesem Fall würde die Fläche der Ladung, die organischem Lösungsmittel ausgesetzt ist, etwa 0,453 mm2betragen. Nach Berücksichtigung der Packungsdichte von Kugeln (Mikropartikeln) innerhalb einer Kugel (Cargo Depot) beträgt das tatsächliche Volumen der Mikropartikel (10 m Durchmesser), die in das Depot passen könnten, 0,17 mm3. Das Volumen eines Mikropartikels beträgt 5,24x10-8 mm3 und somit beträgt die Anzahl der Partikel, die in das Depot passen können, 3,2x106 Partikel. Wenn jedes Mikropartikel 20 Ladetaschen (als Ergebnis einer Doppelemulsion) mit einem Durchmesser von 0,25 m hat, beträgt die Fläche der Ladung, die organischem Lösungsmittel ausgesetzt ist, 1274 mm2. Das Frachtdepot innerhalb der Polybubble hätte somit eine 2800-fach geringere Oberfläche, die organischem Lösungsmittel ausgesetzt wäre als organischer lösungsmittelexponierter Ladung in Mikropartikeln. Unsere Plattform auf Polyesterbasis kann somit die Menge der Fracht, die organischen Lösungsmitteln ausgesetzt ist, potenziell reduzieren, was andernfalls zu Ladungsaggregation und Instabilität führen kann.
Polybubbleen werden nach dem Phasentrennprinzip gebildet, bei dem das Polyester in organischer Phase in eine wässrige Lösung injiziert wird, was zu einer kugelförmigen Blase führt. Fracht in der wässrigen Phase kann dann in die Mitte der Polybubble injiziert werden. Ein weiterer Laderaum kann möglicherweise innerhalb der Polybubble erreicht werden, indem eine andere Ladung mit der Polymerhülle vermischt wird. Die Polybubble in diesem Stadium wird formbar sein und dann ausgehärtet werden, um eine solide Polybubble Struktur mit Ladung in der Mitte zu führen. Sphärische Polybubbles wurden gegenüber anderen geometrischen Formen gewählt, um die Ladekapazität innerhalb der Polybubble zu erhöhen und gleichzeitig die Gesamtgröße der Polybubble zu minimieren. Polybubbles mit Ladung in der Mitte wurden ausgewählt, um eine verzögerte Burst-Release zu demonstrieren. Polybubbleen wurden auch mit einem Nahinfrarot-(NIR)-empfindlichen (d. h. theranostisch-fähigen) Mittel, nämlich Gold-Nanostäben (AuNR), eingebaut, um eine Temperaturerhöhung der Polybubbleen zu verursachen. Dieser Effekt könnte möglicherweise einen schnelleren Abbau erleichtern und zur Steuerung der Kinetik in zukünftigen Anwendungen verwendet werden. In diesem Artikel beschreiben wir unseren Ansatz, Polybubbleen zu formen und zu charakterisieren, eine verzögerte Burstfreisetzung aus den Polybubbleen zu erreichen und AuNR in die Polybubbles zu integrieren, um eine NIR-Aktivierung zu verursachen.

<table><tbody><tr><td>1-Stufen-Ultra-Tetramethylbezidin (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substratlösung</td><td>Thermo scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxy-2-methylpropiophenon</td><td>TCI AMERICA</td><td>H0991</td><td></td></tr><tr><td>450 nm Stopplösung für TMB-Substrat</td><td>Abcam</td><td>ab17152</td><td></td></tr><tr><td>Acryloylchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A24109-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acriflavin</td><td>Chem-Impex International</td><td>22916</td><td></td></tr><tr><td>wasserfreier Ethylether</td><td>Fisher Chemical</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HIV1 gp120 Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP)</td>Rinderserumalbumin (BSA)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-CF488 Farbstoffkonjugate</td><td>Invitrogen</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>Bromsalicylsäure</td><td>Acros Organics</td><td>AC162142500</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethylcellulose (CMC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>80502-040</td><td></td></tr><tr><td>Centrimoniumbromid (CTAB)</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19400480</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Chemical</td><td>C2984</td><td></td></tr><tr><td>Beschichtungspuffer</td><td>Abcam</td><td>ab210899</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan (DCM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-1L</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Fisher Chemical</td><td>E1384</td><td></td></tr><tr><td>Dodeacyl Amin</td><td>Acros Organics</td><td>AC117665000</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>Hydrochlorid Fisher BioReagents</td><td>BP251610</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Acros Organics</td><td>A61 100</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 Spritzenpumpe</td><td>KD Scientific</td><td>14 831 212</td><td></td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Thiol Laysan Bio</td><td>NC0702454</td><td></td></tr><tr><td>fettfreie Trockenmilch</td><td>Andwin Scientific</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumcarbonat</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat Kochsalzlösung Puffer</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr> <tr><td>(Poly(caprolacton)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-250G</td><td></td></tr> <tr><td>(Poly(Caprolacton) Triol</td><td>Acros Organics</td><td>AC190730250</td><td></td></tr><tr><td>Poly (Milchsäure-Co-Glykolsäure) Diacrylat</td><td>CMTec</td><td>280050</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumcarbonat</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes HIV1 gp120 + gp41 Protein</td><td>Abcam</td><td>ab49054</td><td></td></tr><tr><td>Silbernitrat</td><td>Acros Organics</td><td>S181 25</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Borhydrid</td><td>Fisher Chemical</td><td>S678 10</td><td></td></tr><tr><td>Tetrachloraursäure</td><td>Fisher Chemical</td><td>G54 1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>Acros Organics</td><td>AC157910010</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung einer nahinfrarot-empfindlichen core-shell-impfstoff-bereitstellungsplattform

Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform

Impfstoffabgabestrategien, die die Exposition von Fracht gegenüber organischen Lösungsmitteln begrenzen und gleichzeitig neuartige Freisetzungsprofile ermöglichen, sind entscheidend für die Verbesserung der Impfabdeckung weltweit. Hier wird eine neuartige injizierbare, ultraviolett-heilbare und verzögerte Burst-Release-plattform namens Polybubbles eingeführt. Cargo wurde in Polyester-basierte Polybubbles injiziert, die in 10% Carboxymethycellulose-basierter wässriger Lösung gebildet wurden. Dieses Papier enthält Protokolle, um die sphärische Form der Polybubbles beizubehalten und die Ladungsplatzierung und -aufbewahrung zu optimieren, um die Frachtmenge innerhalb der Polybubbles zu maximieren. Um die Sicherheit zu gewährleisten, wurden die chlorierten Lösungsmittelingehalte innerhalb der Polybubbleen mittels Neutronenaktivierungsanalyse analysiert. Release-Studien wurden mit kleinen Molekülen als Ladung innerhalb der Polybubble durchgeführt, um eine verzögerte Burst-Freisetzung zu bestätigen. Um das Potenzial für die On-Demand-Lieferung der Ladung weiter aufzuzeigen, wurden Gold-Nanostäbe in der Polymerhülle gemischt, um eine Nahinfrarot-Laseraktivierung zu ermöglichen.

Polybubbles wurden mit SEM und NAA extensiv charakterisiert. Die Fracht wurde erfolgreich zentriert, um zu einer verzögerten Burst-Freigabe zu führen. Polybubbles wurden auch erfolgreich laseraktiviert, da AuNRs innerhalb der Polybubbles vorliegen.
Polybubble-Charakterisierung Polybubbleen, die in eine wässrige Lösung ohne CMC injiziert wurden, führten aufgrund ihres Kontakts mit der Unterseite der Glasdurchs...

Dieser Artikel beschreibt die Protokolle, die verwendet werden, um eine neuartige Impfstoffbereitstellungsplattform, "Polybubbles", zu erstellen, um eine verzögerte Burst-Freisetzung zu ermöglichen. Polyester einschließlich Poly (Milch-Co-Glykolsäure) und Polycaprolacton wurden verwendet, um die Polybubbleen zu bilden und kleine Moleküle und Antigen wurden als Ladung verwendet.

Herstellung einer Nahinfrarot-empfindlichen Core-Shell-Impfstoff-Bereitstellungsplattform

Vaccine delivery strategies that can limit the exposure of cargo to organic solvent while enabling novel release profiles are crucial for improving ...

Dieses Protokoll kann durch den Einsatz der Polybubble zur Erhaltung der Ladungsstabilität beitragen, die sowohl kleine Moleküle als auch Proteine sein kann, was wiederum die Kohlenstoffwechselwirkungen mit dem Lösungsmittel reduzieren kann. Diese neuartige Technik kann eingesetzt werden, um die Impfabdeckung in den Entwicklungsländern zu verbessern, da die Impfstofffunktionalitäten aufgrund ineffizienter Transport- und Lagereinrichtungen häufig beeinträchtigt werden können. Um die Polybubbles herzustellen, verwenden Sie zunächst eine Ein-Milliliter-Transferpipette, um 800 Mikroliter 10%CMC in eine 0,92 Milliliter Glasflasche zu geben.Um PCLTA zu synthetisieren, mischen Sie 1 000 Gramm pro Milliliter 14 Kilodalton PCL in 200 Mikroliter DCM. Um PLGADA zu synthetisieren, mischen Sie 1 000 Gramm pro Milliliter von fünf Kilodalton PLGADA in 200 Mikroliter Chloroform. Photoinitiator mit dem polymeren Gemisch von Interesse im Verhältnis 0,005 zu 1 mischen und 200 Mikroliter der resultierenden Lösung in eine Ein-Milliliter-Glasspritze laden, die auf einer Spritzenpumpe montiert ist, die mit einem Dosier-Edelstahlrohr mit einem Innendurchmesser von 0,016 Zoll verbunden ist.Mit einem Mikromotor, um die Vorwärts- und Rückwärtsbewegung des Polymerrohres zu steuern, das Polymer in die 10%CMC in die Glasdurchstechflasche zu injizieren, um die Polybubbles zu bilden und die Polybubbles unter ultraviolettem Licht bei einer Wellenlänge von 254 Nanometern für 60 Sekunden bei zwei Watt pro Quadratzentimeter zu aushärten, dann die Polybubbles in flüssigem Stickstoff für 30 Sekunden einfrieren und die Träger über Nacht bei 0,01 Millibar Minus graduieren. Für die Zentrierung der Ladung von Interesse innerhalb einer Polybubble, mischen Sie die Ladung mit 5%CMC in einem Rotator über Nacht, um die Viskosität der Ladung zu erhöhen, bevor sie manuell zwei Mikroliter des Ladungsgemisches in die Polybubble injizieren. Wenn die gesamte Ladung injiziert wurde, re-cure, Flash Freeze, und lyophilisieren die injizierte Polybubble, wie gerade gezeigt.Verwenden Sie am nächsten Morgen Zangen, um die Polybubble vom getrockneten CMC zu trennen und die Polybubble mit entionisiertem Wasser zu waschen, um restliche CMC zu entfernen. Dann schneiden Sie die Polybubble in die Hälfte und bilden die Hälften durch konfokale Mikroskopie, um sicherzustellen, dass die Ladung zentriert ist. Für die Freisetzung kleiner Moleküle können Sie die Polybubbleen mit zentriertem Acriflavine in 400 Mikroliter PBS bei 37 Grad Celsius für die entsprechende Inkubationslänge inkubieren.Zu jedem versuchsweise Zeitpunkt den Überstand sammeln und 400 Mikroliter frisches PBS in die Durchstechflasche geben. Verwenden Sie dann einen Plattenleser, um die Fluoreszenzintensität des gesammelten Überstandes zu quantifizieren. Mischen Sie für die Nahinfrarotaktivierung die Polymerlösung mit hydrophobisierten Gold-Nanostäben im Verhältnis eins bis neun und fügen Sie den Fotoinitiator mit einem Verhältnis von 0,005 zu 1 hinzu.Injizieren Sie die resultierende Mischung in eine 0,92 Milliliter Glasdurchstechflasche mit 800 Mikroliter10%CMC und härten Sie die Polybubbleen unter ultraviolettem Licht aus, wie gezeigt. Nach Blitzeinfrieren und Lyophilisierung, wie gezeigt, waschen Sie die Polybubbles mit entionisiertem Wasser und inkubieren Sie die Träger in 400 Mikroliter PBS bei 37 Grad Celsius für die entsprechende Inkubationszeit. Am Ende der Inkubation erhalten Sie ein vorausschauendes Infrarotbild der Polybubble vor und nach der Aktivierung der Polybubbles mit einem 801 Nanometer Nahinfrarotlaser bei acht Ampere für fünf Minuten dreimal pro Woche für vier Wochen für PLGADA Polybubbles und 14 Wochen für PCL-PCLTA Polybubbles.Zu jedem versuchsweise Zeitpunkt den Überstand sammeln und 400 Mikroliter frisches PBS in die Durchstechflasche geben. Berechnen Sie dann die Temperaturunterschiede zwischen den Polyblasen vor und nach der Laseraktivierung basierend auf den Temperaturwerten aus den vorausschauenden Infrarotbildern. Die Zugabe von 10%CMC-basierter wässriger Lösung führt zu einer kompletten Polybubble Suspension für eine erfolgreiche Aufrechterhaltung der Polybubble Sphärizität.Die Einspritzung von Ladung in die Polybubble in Abwesenheit von CMC führt zu Leckagen und einem daraus resultierenden Mangel an Ladungsretention innerhalb der Polybubble. Um diese Leckage zu beheben, kann die Viskosität des PCLTA mit Kaliumcarbonat isoliert nach Derendverschluss Polycaprolacton mit Triacrylat erhöht werden und die Viskosität der Ladung kann durch Mischen der Ladung mit 5%CMC erhöht werden. Die Viskosität der PLGADA Polybubbles reicht aus, um die Zentrierung der Ladung zu erleichtern und erfordert keine Modulation über Kaliumcarbonat.Beachten Sie, dass nach dem Mischen von HIV gp120/41 Antigen mit und ohne Trehalose vor der Polybubble-Injektion kein statistisch signifikanter Unterschied in der Bindungseffizienz des Antikörpers beobachtet wird. Verzögerte Burst-Freisetzungen werden in PLGADA-Polybubbleen mit Acriflavine in der Mitte des 19. Tages für Polybubbleen beobachtet, die bei 37 Grad Celsius und am fünften Tag für Polybubbleen bei 50 Grad Celsius inkubiert werden. Darüber hinaus können PLGADA Polybubbles und PCL- und PCLTA-Polybubbles, die Gold-Nanostäbe enthalten, mehrfach erfolgreich laseraktiviert werden.Achten Sie bei der Bildung der Polybubbles darauf, die Reagenzien vor dem Licht zu schützen und die Lösungen sofort zu verwenden. Nach der Entwicklung dieser Technologie wollten wir auch die Automatisierung dieses Prozesses auf die Skalierung der Polybubble-Produktion untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt ein allgemeines Verfahren für die Untersuchung rekombinanten Rezeptor-bindende Domäne (RBD)-basierte Subunit-Impfstoffe gegen SARS. Es umfasst Methoden für die Transfektion und Expression von RBD-Protein in 293T-Zellen, Immunisierung von Mäusen mit RBD und den Nachweis von Neutralisation Aktivität Mausseren anhand eines etablierten SARS pseudovirus Neutralisationstest.

Protokoll für die rekombinante RBD-basierte Impfstoffe SARS: Protein Preparation, Animal Impfung und Neutralisation Erkennung

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung von multivalent anzeigenden Impfstoffen mit äußerem Membranvesikel (OMV). Säugetierzellen werden transfiziert, um virale Antigene zu exprimieren und zu sezernieren, die mit einem SpyTag und einem Polyhistidin-Tag fusioniert sind. Diese Antigene werden dann mit einer Nickel-Nitriotriessigsäure (Ni-NTA)-Affinitätssäule aufgereinigt. Das gereinigte Antigen wird mit äußeren Membranvesikeln gemischt, die das oberflächengebundene SpyCatcher...

Erzeugung eines multivalent anzeigenden Impfstoffs gegen äußere Membranvesikel

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung einer neuartigen Polymerblasen- oder Polyblasen-basierten Plattform, die eine verzögerte Burst-Freisetzung ermöglicht. Polymere auf Polyesterbasis werden verwendet, um die Polyblasen mit Kern-Schale-Struktur zu bilden, und kleine Moleküle und Antigene können als Fracht verwendet werden.

Eine Technik zur Generierung einer neuartigen Verabreichungsplattform für eine verzögerte Burst-Freisetzung von Molekülen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Erzeugung eines mRNA-Impfstoffkandidaten unter Verwendung von polymeren Nanopartikeln. Das kationische Polymer interagiert mit negativ geladener mRNA und bildet Polyplexe. Die Bildung von Polyplexen stabilisiert die mRNA und macht sie zu einem potenziellen Kandidaten für zukünftige mRNA-Impfstoffe in immuntherapeutischen Anwendungen.

Formulierung von mRNA-beladenen Nanopartikeln für Impfzwecke

Hier wird eine detaillierte Methode zur Beschreibung der Reinigung, Umfaltung und Charakterisierung selbstassemblierender Protein-Nanopartikel (SAPNs) für die Impfstoffentwicklung beschrieben.

Herstellung von E. coli-exprimierenden selbstmontierenden Protein-Nanopartikeln für Impfstoffe, die eine trimerische Epitop-Präsentation erfordern

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung kommerzieller, zellfreier Proteinexpressionskits zur Herstellung von Membranproteinen, die in Nanodisc unterstützt werden und als Antigene in Subunit-Impfstoffen verwendet werden können.

Zellfreie skalierte Produktion und adjuvante Zugabe zu einem rekombinanten Haupt-Außenmembranprotein aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Bioengineering von äußeren Membranvesikeln als "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.

Eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform basierend auf äußeren Membranvesikeln mit SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne

Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Herstellung und Evaluierung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo vor.

Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

Diese Methode beschreibt die Verkapselung des Tollwutantigens in biologisch abbaubare polymere Mikropartikel mit strukturellen und materiellen Eigenschaften, die eine pulsierende Freisetzung nach einer vorgegebenen Verzögerung ermöglichen. Die ELISA-Bewertung des aus dem Partikelkern gewonnenen Antigens (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) bestätigt das Vorhandensein eines intakten Glykoproteins des trimeren Tollwutvirus durch Partikelherstellung.

Herstellung pulsatiler polymerer Mikropartikel, die das Tollwutantigen verkapseln

In diesem Protokoll haben wir eine mit einer kationischen Nanoemulsion verkapselte Retinsäure (RA) entwickelt, die als Adjuvans verwendet werden kann, um antigenspezifische systemische und mukosale Reaktionen zu fördern. Durch die Zugabe der von der FDA zugelassenen RA zur Nanoemulsion wurde antigenspezifisches sIgA in der Vagina und im Dünndarm nach intramuskulärer Injektion der Nanoemulsion gefördert.

Kationische Nanoemulsions-verkapselte Retinsäure als Adjuvans zur Förderung von OVA-spezifischen systemischen und mukosalen Reaktionen

Erfahren Sie die Herstellung von Polybubbles mit PLGA und PCL für Impfstoffbereitstellung. Diese Methode ermöglicht verzögerte Freisetzung und verbesserte Stabilität von Wirkstoffen bei der Lagerung.

Herstellung einer Nahinfrarot-empfindlichen Core-Shell-Impfstoff-Bereitstellungsplattform

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