Name: In Vivo Augmentation der Gut-Homing Regulatory T Cell Induction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Induktion von Darm-homing regulatorischen T-Zellen durch gentechnisch veränderte dendritische Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Rolle von Vitamin D und A im Immunsystem.

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Diese Arbeit wurde vom Office of the Assistant Secretary of Defense for Health Affairs durch das Peer Reviewed Medical Research Program unter Auszeichnung Nr. W81XWH-15-1-0240 (XT). Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die des Autors und werden nicht unbedingt vom Verteidigungsministerium gebilligt. Diese Arbeit wurde teilweise auch durch Research Innovation Grants vom Department of Medicine der Loma Linda University (681207-2967 [XT und GG], 681205-2967 [XT] und 325491 [DJB]) unterstützt.

Alle In-vivo-Tierstudienprotokolle wurden vom Loma Linda University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) sowie dem Animal Care and Use Review Office (ACURO) der US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) des Verteidigungsministerium.
1. Herstellung des Lentivirus, das sowohl 1-Hydroxylase als auch RALDH2 (Lenti-CYP-ALDH-Virus) ausdrückt
<ol><li>Tag 0: Am frühen Morgen 5 x 105 Zellen/ml von 293T Zellen im CM-10-D-Zellkulturmedium vorbereiten.</li>
	<li>Samen 20 ml/Platte in 150 mm x 25 mm Kulturgerichte. Kultur die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h. Konfluenz erreicht 80–90% nach 24 h.</li>
	<li>Tag 1: Machen Sie 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl und 1,5 mM Na2HPO4, pH 7.1). Aliquot und lagern bei -20 °C.</li>
	<li>2 M CaCl2 machen und bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>Für jede Kulturschale von 150 mm x 25 mm eine DNA-Fällungsmischung in einem sterilen 50 ml Kulturrohr zubereiten. Fügen Sie zunächst 1.620 l 2x HBS, 9,5 g PMD2G (VSVG), 17,5 g pCMVR8,74 (Capsid), 27 g Lenti-CYP-ALDH-Plasmid (ein Lentiviral-Vektor, der sowohl CYP27B1 als auch ALDH1a2 trägt) hinzu. Zweitens fügen Sie H2O zu einem Endvolumen von 3.037,5 l hinzu.</li>
	<li>In der letzten, fügen Sie 202,5 l von 2 M CaCl2 tropfenweise beim Mischen der Lösung auf enddauernde Konzentrationen von 1x HBS und 125 mM CaCl2. CaCl2 muss der letzte sein, der hinzugefügt wird. Lassen Sie die Transfektionsmischungen bei Raumtemperatur 20 min bei gelegentlichem Mischen. Für mehrere 150 mm x 25 mm Kulturgerichte entsprechend skalieren.</li>
	<li>Fügen Sie die 3.240 l DNA-Fällungsmischung tropfenweise zu einer 150 mm x 25 mm Kulturschale hinzu, die die 293T-Zellen enthält. Wirbeln Sie die Kulturschale vorsichtig nebeneinander, während Sie die DNA-Fällungsmischung hinzufügen. Inkubieren Sie die Schale bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h.</li>
	<li>Tag 2: Entfernen Sie die Calciumphosphat-Transfektionslösung, waschen Sie vorsichtig mit 1x PBS und speisen Sie die Zellkultur mit CM-4-D-Zellkulturmedium wieder ein. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h.</li>
	<li>Tag 3: Die Überstande in sterilen Lagerflaschen ernten und bei 4–8 °C lagern. Füllen Sie die Zellkultur mit einem frischen CM-4-D-Zellkulturmedium auf. Die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für weitere 24 h skulturen.</li>
	<li>Tag 4: Ernte die Überstande in sterile Lagerflaschen. Filtern Sie die Überräube ab Tag 3 und Tag 4 durch einen 0,45 m Filter. Um das VSVG-Pseudotypvirus zu konzentrieren, übertragen Sie die Überwälten in Zentrifugenröhren und drehen Sie bei 4.780 x g für 24 h bei 4 °C.</li>
	<li>Tag 5: Gießen Sie die Überräube von den Pellets (das Pellet ist oft sichtbar) und lassen Sie die Rohre auf einem Papiertuch in einem sterilen Biosicherheitsschrank für mehrere Minuten abfließen.</li>
	<li>Die Pellets durch Pipettieren mit sterilem PBS mit 5 % Glycerin wieder aufhängen. Das Volumen für die Resuspension beträgt 33,3 l pro 150 mm x 25 mm Kulturschale.</li>
	<li>Aliquot 200 l/Tube und lagern bei -80 °C. Machen Sie ein separates Aliquot von 50 l/Fläfürstigkeitszwecke. Titer sollten im Bereich von 108–109 Messeinheiten (TUs)/ml liegen.</li>
	<li>Bleichmittel in die Kulturgerichte geben und entsorgen. HINWEIS: Diese transfizierten Zellen sind das größte Sicherheitsproblem im Protokoll, da alle lentiviralen Elemente in den Zellen exprimiert werden.</li>
</ol>2. Erzeugung von Knochenmark-abgeleiteten DCs (BMDCs)
<ol><li>Ernte Tibias und Oberschenkelknochen von 4–5 Balb/c Mäusen in ein 50 ml steriles Polypropylenrohr, das das Kulturmedium6enthält.</li>
	<li>Übertragen Sie die Tibias und Oberschenkel in ein 100 mm x 20 mm Kulturgericht, das das Kulturmedium enthält. Entfernen Sie Gewebe wie Muskeln von den Tibias und Oberschenkelknochen mit sezierender Schere und Zange.</li>
	<li>Schneiden Sie beide Enden der Tibias und Oberschenkelknochen, um die Knochenmarkhöhle freizulegen.</li>
	<li>Zeichnen Sie 10 ml Kulturmedium in einer 10 ml Spritze, die an einer 30 G Nadel befestigt ist.</li>
	<li>Setzen Sie die Nadel vorsichtig in die Knochenmarkhöhle ein und spülen Sie das Knochenmark in ein sauberes 50 ml steriles Polypropylenrohr. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf, um sicherzustellen, dass das Knochenmark vollständig ausgespült wurde.</li>
	<li>Pellet die Knochenmarkzellen durch Zentrifugation (400 x g) bei 2–8 °C für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
	<li>Das Pellet mit 5 ml 1x rotem Blutzelllysepuffer wieder aufhängen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 4-5 min mit gelegentlichem Schütteln.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 30 ml Kulturmedium hinzufügen.</li>
	<li>Pellet die Zellen durch Zentrifugation (400 x g) bei 2–8 °C für 5 min. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml CM-10-R Zellkulturmedium. Bei Bedarf können die Zellen durch ein 40-m-Zellsieb geleitet werden, um Schmutz zu entfernen.</li>
	<li>Führen Sie eine Zellanzahl aus, und passen Sie die Zellen mithilfe des CM-10-R-Zellkulturmediums auf 1 x 106 Zellen/ml an.</li>
	<li>Fügen Sie rekombinanten murinen Granulozyten/Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF, Endkonzentration = 100 U/ml) und murines Interleukin-4 (IL-4, Endkonzentration = 10 U/ml) hinzu. HINWEIS: Die Lagerlösungen von GM-CSF und IL-4 werden bei -80 °C bei 100.000 U/ml (1.000x) bzw. 10.000 U/ml (1.000x) gelagert.</li>
	<li>Verteilen Sie die Zellen in 6 Brunnenkulturplatten bei 4 ml/Well und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 48 h.</li>
	<li>Entfernen Sie nicht haftende Zellen mit sanfter Pipettierung.</li>
	<li>Fügen Sie frisches CM-10-R-Zellkulturmedium hinzu, das das GM-CSF (100 U/ml) und IL-4 (10 U/mL) enthält. Kultur die Zellen für weitere 48 h.</li>
	<li>Ernte nicht haftende Zellen (BMDCs) zur Transduktion durch das lenti-CYP-ALDH-Virus.</li>
</ol>3. Transduktion von DCs mit lenti-CYP-ALDH Virus zur Erzeugung von DC-CYP-ALDH-Zellen
<ol><li>Bereiten Sie 1 x 106 DCs/Well in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml CM-10-R-Zellkulturmedium vor, das 50 l Virus und 8 g/ml Protamin in einer 6-Well-Kulturplatte enthält.</li>
	<li>Kultur der Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium durch frisches CM-10-R-Zellkulturmedium und kulturieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für weitere 24 h. Zu diesem Zeitpunkt können die enzymatischen Aktivitäten von 1-Hydroxylase und RALDH2 ausgewertet werden (siehe Schritt 4). Wiederholen Sie ggf. die Schritte 3.1–3.3 für eine zweite Transduktion.</li>
	<li>Fügen Sie Lipopolysaccharid (100 ng/ml) hinzu und kultiieren Sie die Zellen für 24 h.</li>
	<li>Ernte der Zellen (DC-CYP-ALDH-Zellen) für Experimente.</li>
</ol>4. Auswertung der überexprimierten 1-Hydroxylase und RALDH2 in DC-CYP-ALDH-Zellen
<ol><li>Auswertung der überexprimten 1-Hydroxylase in DC-CYP-ALDH-Zellen<ol>
<li>Samen 1,0 x 106 DC-CYP-ALDH-Zellen/gut in 2 ml CM-10-R-Zellkulturmedium in 12 Brunnenkulturplatten.</li>
		<li>Fügen Sie 25(OH)D zur Endkonzentration von 2,5 m hinzu. Inkubieren Sie die DC-CYP-ALDH-Zellen für 24 h.</li>
		<li>Die Überräube ernten und bei -20 °C lagern.</li>
		<li>Assay für 1,25(OH)2D Konzentrationen in den Überstandunterhaltsmitteln mit einem handelsüblichen Radioimmunoassay (RIA) (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Bestimmen Sie die Expression von 1-Hydroxylase in DC-CYP-ALDH-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) mit einem Anti-CYP27B1-Antikörper.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auswertung der überexprimtralen RALDH2 in DC-CYP-ALDH-Zellen HINWEIS: Die Expression und Aktivität des überexprimierenden RALDH2 wird mit einem kommerziellen Aldehyddehydrogenase (ALDH)-Detektionskit bestimmt (siehe Materialtabelle).<ol>
<li>Samen 1 ml DC-CYP-ALDH oder Kontrollzellen (1 x 105 Zellen/ml im Testpuffer) in je zwei 5 ml-Röhren (eine mit der Bezeichnung "Control" und die andere mit der Bezeichnung "Test") bezeichnet.</li>
		<li>In jedem der Steuerröhrchen 10 l Diethylaminobenzaldehyd (DEAB)-Lösung (1,5 mM in 95% Ethanol) hinzufügen und sofort mischen. DEAB ist ein RALDH2-Hemmer.</li>
		<li>Fügen Sie den Kontroll- und Reagenzröhrchen 5 l aktiviertes RALDH-Fluoreszenzsubstrat (300 m) hinzu und mischen Sie sie sofort.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Rohre für 45 min.</li>
		<li>Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g bei 2–8 °C für 5 min. Aspirieren Sie die Überwälten.</li>
		<li>Rekonstituieren Sie die Zellen in 200 L Assaypuffer.</li>
		<li>Halten Sie die Zellen auf Eis und gehen Sie für die Analyse durch FACS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Noronha, S. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldefluor+protocol+to+sort+keratinocytes+stem+cells+from+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).</li>
<li>Ferreira, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D3+Induces+Tolerance+in+Human+Dendritic+Cells+by+Activation+of+Intracellular+Metabolic+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways.</a> Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).</li>
<li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing%2C+IL-10-producing+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li>
</ol>

Drs. Xiaolei Tang und David J. Baylink sind Erfinder eines anhängigen Patents im Zusammenhang mit dieser Studie.

In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von DC-CYP-ALDH-Zellen zur Erweiterung der Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in peripheren lymphoiden Geweben. Unsere Daten haben gezeigt, dass die DC-CYP-ALDH-Zellen lokal hohe Konzentrationen de novo von 1,25(OH)2D und RA in vitro in Gegenwart entsprechender Substrate (d.h. 25[OH]D bzw. Retinol) synthetisieren können. Da ausreichende Blutkonzentrationen von 25(OH)D und Retinol leicht durch Vitamin D- und A-Supplementierungen bei Patienten mit Defiziten<sup...

Die entzündliche Darmerkrankung (IBD) ist eine entzündliche chronische Erkrankung im Magen-Darm-Trakt (GUT). In den Vereinigten Staaten gibt es etwa 1,4 Millionen IBD-Patienten. Es ist allgemein anerkannt, dass eine dysregulierte Immunantwort auf Darmbakterien die Krankheit auslöst und die Schleimhautepithelbarriere1,2stört. Aus diesem Grund hemmen derzeit verfügbare, von der US Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Medikamente die Funktionen von Entzündungsmediatoren oder blockieren die Homing von Immunzellen in den Darm. Die entzündungshemmenden Mediatoren und Immunzellen, die gezielt sind, sind jedoch auch für die Immunabwehr notwendig. Infolgedessen gefährden die Entzündungsmediatoren die systemische Immunabwehr und die Immunzellen-Homing-Blocker schwächen die Darmimmunabwehr, die beide zu schwerwiegenden Folgen führen können3,4. Darüber hinaus können die Immunzellen-Homing-Blocker auch das Homing von regulatorischen T (Treg)-Zellen in den Darm blockieren und damit die bereits beeinträchtigte Darmimmuntoleranz bei IBD-Patienten verschlechtern. Darüber hinaus kann die Blockierung der Treg-Zelle, die in den Darm einfließt, auch zu einer systemischen Immunsuppression aufgrund der Ansammlung von Treg-Zellen im Blut führen5. Schließlich funktionieren Inhibitoren und Blocker vorübergehend und erfordern daher häufige Verabreichungen. Häufige Verabreichung dieser Inhibitoren und Blocker können die unerwünschten Nebenwirkungen weiter verschlimmern.
Kürzlich haben wir eine neue Strategie vorgeschlagen, die potenziell die Nebenwirkungen imZusammenhang mit aktuellen Medikamenten für die IBD-Behandlung 6 mildern oder sogar beseitigen kann. Diese Strategie verstärkt die Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in peripheren Lymphgeweben6. Die Begründung dieser Strategie ist, dass Darm-Homing Treg Zellen speziell Heimat des Darms und wird daher nicht die systemische Immunabwehr gefährden. Da Treg-Zellen potenziell Gedächtnisbildenkönnen 7,8, Darm-Homing-Treg-Zellen können potenziell eine stabile Kontrolle der chronischen Darmentzündung bei IBD-Patienten bieten und damit sollte die Behandlung nicht so häufig verabreicht werden müssen. Da diese Strategie die Induktion von Darmhoming-Treg-Zellen in vivo verstärkt, hat sie nicht die Sorge der In-vivo-Instabilität in einer hochgradig proinflammatorischen Umgebung, die mit dem Adoptivtransfer von in vitro erzeugten Treg-Zellen9,10verbunden ist. In dieser Hinsicht sind in vitro erzeugte Treg-Zellen eine der vorgeschlagenen Strategien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen11,12,13 und Transplantatabstoßung14,15. Schließlich werden in dieser Strategie dendritische Zellen (DCs) entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen von zwei Molekülen de novo zu produzieren: aktives Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und aktives Vitamin A (Retinoinsäure oder RA). Wir haben uns für 1,25(OH)2D und RA entschieden, weil 1,25(OH)2D die Expression von regulatorischen Molekülen induzieren kann (z.B. Gabelstapler p3 [foxp3] und Interleukin-10 [IL-10])16,17 und dass RA die Expression von Darmhoming-Rezeptoren in T-Zellen stimulieren kann18. Da sowohl 1,25(OH)2D als auch RA auch DCs28,29tolerisieren können, gehen wir davon aus, dass die konstruierten DCs stabil in einem tolerogenen Status in vivo gehalten werden und damit die In-vivo-Instabilitätsbedenken umgehen, die mit in vitro erzeugten tolerogenen DCs (TolDCs)19,20,21verbunden sind. In dieser Hinsicht sind TolDCs auch eine der vorgeschlagenen Strategien für die In-vivo-Augmentation der Treg-Zellfunktionen19,20,21. Um unsere Argumentation zu unterstützen, haben wir gezeigt, dass die entwickelten DCs, nach in vivo Lieferung, die Induktion von Darm-homing Treg-Zellen in peripherenlymphoidenGeweben 6 erhöhen können.
Ein weiterer Vorteil unserer vorgeschlagenen Strategie ist, dass 1,25(OH)2D auch andere Funktionen hat, die IBD-Patienten potenziell zugute kommen können. Zu diesen anderen Funktionen gehört die Fähigkeit von 1,25(OH)2D, die Sekretion antimikrobieller Mittel zu stimulieren22 und die Karzinogenese23zu unterdrücken. Infektionen und Krebserkrankungen werden häufig mit IBD24,25assoziiert.
Um die DCs zu erzeugen, die lokal hohe Konzentrationen von 1,25(OH)2D und RA de novo erzeugen können, verwenden wir einen lentiviralen Vektor, um DCs zu entwickeln, um zwei Gene zu überexprimieren. Ein Gen ist das Cytochrom P450-Unterfamilie 27-Unterfamilie B-Mitglied 1 (CYP27B1), das 25-Hydroxyvitamin D 1-Hydroxylase (1-Hydroxylase) kodiert, das physiologisch die Synthese von 1,25(OH)2D katalysiert. Das andere Gen ist die Aldehyddehydrogenase 1 Familienmitglied A2 (ALDH1a2), die Retinaldehyddehydrogenase 2 (RALDH2) kodiert, die physiologisch die Synthese von RA6katalysiert.
Da die In-vivo-Augmentation der Darmhoming-Treg-Zellinduktion für die Behandlung von IBD potenziell wichtig ist, werden wir im folgenden Protokoll die Verfahren zur Erzeugung der 1-Hydroxylase-RALDH2-overexzierenden DCs (DC-CYP-ALDH-Zellen) kann für die zukünftige Untersuchung von Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>10 mL Spritzen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 03-377-23</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Kulturschalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Kulturplatten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 25 mm Kulturschalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430559</td><td></td></tr><tr><td>25-Hydroxycholecalciferol (25[OH]D)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# H4014</td><td></td></tr><tr><td>293T Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>Cat# 01700</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CYP27B1</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab95047</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1016</td><td></td></tr><tr><td>CM-10-D Zellkulturmedium</td><td></td><td></td><td>DMEM-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 0,055 mM 2-Mercaptoethanol (2-ME), 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nichtessentielle Aminosäure und 2 mM L-Glutamin.</td></tr><tr><td>CM-10-R Zellkulturmedium</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640 Medium (kein Glutamin) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 0,055 mM 2-Mercaptoethanol (2-ME), 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nichtessentielle Aminosäure und 2 mM L-Glutamin.</td></tr><tr><td>CM-4-D Zellkulturmedium</td><td></td><td></td><td>DMEM-Medium mit 4 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 U/ml Penicillin/Streptomycin, 0,055 mM 2-Mercaptoethanol (2-ME), 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nichtessentielle Aminosäure und 2 mM L-Glutamin.</td></tr><tr><td>Corning Flaschenaufsatz-Vakuumfilter, 0,22 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430513</td><td></td></tr><tr><td>Corning Flaschenaufsatz-Vakuumfilter, 0,45 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430514</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 08-940</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 11960044</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 16000044</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Gibco ACK Lysingpuffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# G5516</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore</td><td>Cat# 391340</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-CYP-ALDH</td><td>Maßgeschneiderte</td><td>1,6-kb-Maus-CYP27B1 und ALDH1a2-cDNAs wurden mittels PCR unter Verwendung eines Plasmids, das die CYP27B1 cDNA enthielt, bzw. eines Plasmids, das die ALDH1a2-cDNA enthielt, amplifiziert (GeneCopoeia). Das amplifizierte CYP27B1 cDNA-Fragment mit einer 5'-KOZAK-Ribosomeneintrittssequenz wurde in den lentiviralen Vektor (Addgene) pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE kloniert. Das resultierende Konstrukt wurde als lenti-CYP-GFP bezeichnet. Das amplifizierte ALDH1a2-cDNA-Fragment wurde in das Lenti-CYP-GFP kloniert, um das GFP zu ersetzen, und wurde als Lenti-CYP-ALDH bezeichnet. Dieses bicistronische Plasmid exprimiert CYP27B1, das durch den SFFV-Promotor kontrolliert wird, und ALDH1a2, das durch den PGK-Promotor kontrolliert wird.</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L3755</td><td></td></tr><tr><td>Maus GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 315-03</td><td></td></tr><tr><td>Maus IL-4</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 214-14</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S9888</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 14-841-02</td><td></td></tr><tr><td>Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td>Addgene</td><td>Plasmid# 22036</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#15140148</td><td></td></tr><tr><td>Phoshat-ausgewogene Lösung ( PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 20012027</td><td></td></tr><tr><td>PMD2G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid# 12259</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Röhrchen, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# AM12500</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-Röhrchen, 50 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# AM12502</td><td></td></tr><tr><td>Protaminsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P3369</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen polyklonale IgG-Isotypkontrolle</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab171870</td><td></td></tr><tr><td>Radioimmunoassay für 1,25(OH)2D-Messung</td><td>Heartland Assays</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, kein Glutamin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 21870076</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11360070</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Zentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 75004521</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Zellsiebe, 40 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Vorratsflaschen, 500 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# CLS431432</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo augmentation der gut-homing regulatory t cell induction

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Die entzündliche Darmerkrankung (IBD) ist eine entzündliche chronische Erkrankung im Magen-Darm-Trakt (GUT). In den Vereinigten Staaten gibt es etwa 1,4 Millionen IBD-Patienten. Es ist allgemein anerkannt, dass eine dysregulierte Immunantwort auf Darmbakterien die Krankheit auslöst und die Schleimhautepithelbarriere stört. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Darmhoming-regulatorische T (Treg)-Zellen eine vielversprechende Therapie für IBD sind. Dementsprechend stellt dieser Artikel ein Protokoll zur In-vivo-Augmentation der Darmhoming Treg-Zellinduktion dar. In diesem Protokoll werden dendritische Zellen entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen von zwei Molekülen de novo, aktivem Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und aktivem Vitamin A (Retinsäure oder RA) zu produzieren. Wir wählten 1,25(OH)2D und RA auf der Grundlage früherer Erkenntnisse, die zeigten, dass 1,25(OH)2D die Expression von regulatorischen Molekülen induzieren kann (z. B. Gabelstapler-Box P3 und Interleukin-10) und dass RA die Expression von Darm-Homing-Rezeptoren in T-Zellen stimulieren kann. Um solche technisch entwickelten dendritischen Zellen zu erzeugen, verwenden wir einen lentiviralen Vektor, um dendritische Zellen zu transduzieren, um zwei Gene zu überexprimieren. Ein Gen ist das Cytochrom P450-Unterfamilie 27-Unterfamilie B-Mitglied 1, das 25-Hydroxyvitamin D 1-Hydroxylase kodiert, das physiologisch die Synthese von 1,25(OH)2D katalysiert. Das andere Gen ist die Aldehyddehydrogenase 1 Familienmitglied A2, die Retinaldehyddehydrogenase 2 kodiert, die physiologisch die Synthese von RA katalysiert. Dieses Protokoll kann für die zukünftige Untersuchung von Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo verwendet werden.

DC-CYP-ALDH-Zellen exprimiert signifikant erhöhte Menge an 1-Hydroxylase. Um festzustellen, ob DC-CYP-ALDH-Zellen, die aus BMDCs erzeugt wurden, eine signifikant erhöhte Menge an 1-Hydroxylase exprimierten, wurden BMDCs mit dem Lenti-CYP-ALDH-Virus zur Herstellung von knochen-marrow-abgeleiteten DC-CYP-ALDH-Zellen (BMDC-CYP-ALDH-Zellen) transduziert. Anschließend wurden die BMDC-CYP-ALDH-Zellen auf die Expression von 1-Hydroxylase durch FACS untersucht. Unsere Daten zeigten, dass die BMDC-CYP-ALDH-Zellen...

Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vivo-Augmentation der Darmhoming-regulatorischen T-Zell-Induktion vor. In diesem Protokoll werden dendritische Zellen entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen des aktiven Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und des aktiven VitaminS A (Retinoinsäure oder RA) de novo zu produzieren.

In Vivo Augmentation der Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Dieses Protokoll beschreibt eine potenziell neuartige therapeutische Strategie, die leicht für menschliche Anwendungen modifiziert werden kann. Diese Technik verbessert direkt die Induktion von Darm-Homing-regulatorischen T-Zellen in peripheren Lymphgeweben und kann auch in hochgradig pro-inflammatorischen Umgebungen stabil umgesetzt werden. Diese Techniken können auch verwendet werden, um die Rolle von aktivem Vitamin D und Vitamin A innerhalb des peripheren Immunsystems zu untersuchen.Diese visuelle Demonstration wird Schritt für Schritt Anweisungen für die Erzeugung von hochwertigen technischen dendritischen Zellen bereitstellen, die für den Erfolg dieser Technik entscheidend sind. Beginnen Sie mit der Aussaat von 1 mal 10 zu den sieben 293T-Zellen in 20 MillilitercmCM-10-D-Zellkulturmedium in 150 mal 25 Millimeter Kulturplatten für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag 1,62 Milliliter frisch zubereitete zweifach konzentrierte HBS-Lösung, 9,5 Mikrogramm Hüllwasserid, 17,5 Mikrogramm Verpackungsplasmid und 27 Mikrogramm des LENTI-CYP-ALDH-Plasmids zu einem 50 Milliliter konischen Rohr hinzufügen.Bringen Sie das Endvolumen des Rohrgehalts auf 3,0375 Milliliter mit Wasser, gefolgt von der Zugabe von 202,5 Mikrolitern von zwei Molcalciumchlorid tropfenweise. Lassen Sie die DNA-Niederschlagsmischung bei Raumtemperatur 20 Minuten bei gelegentlichem Mischen, bevor Sie 3,24 Milliliter der Lösung tropfenweise pro 293T-Kultur hinzufügen, während sie die Schale sanft wirbeln. Legen Sie die Platten 24 Stunden in den Inkubator, bevor Sie jede Platte vorsichtig mit PBS waschen und die Zellen mit CM-4-D-Kulturmedium füttern.Nach weiteren 24 Stunden Kultur ernten Sie die Überstande in sterile Flaschen zur Lagerung bei vier bis acht Grad Celsius und füttern die Zellen für weitere 24 Stunden mit frischem CM-4-D-Medium. Am vierten Tag die Überstände wieder ernten und die Überstände von beiden Tagen drei und vier bis zu einem 0,45 Mikrometer Filter belasten. Konzentrieren Sie dann das Pseudotyp-Virus VSV-G 24 Stunden lang durch Zentrifugation.Am nächsten Tag dekantieren die Überstande. Lassen Sie die Rohre auf einem Papiertuch in einem sterilen Bio-Sicherheitsschrank für mehrere Minuten abtropfen lassen, und setzen Sie dann die Pellets in 33,3 Mikroliter nsterilem PBS mit 5% Glycerin pro Kulturschale wieder auf. Für die knochenmarkabgeleitete dendritische Zellerzeugung, legen Sie die Tibias und Oberschenkelknochen, geerntet von BALB/c Mäusen, in ein 100 mal 20 Millimeter Kulturgericht mit frischem Kulturmedium.Verwenden Sie sezierende Schere und Zange, um Gewebe aus den Knochen zu entfernen. Wenn alle Knochen gereinigt wurden, verwenden Sie die Schere, um beide Enden jedes Knochens zu schneiden, um die Knochenmarkhöhlen freizulegen. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 30-Meter-Nadel, um jeden Knochen mit 10 Milliliter frischem Kulturmedium zu spülen und das Knochenmark in einem 15-Milliliter-Rohr zu sammeln.Wenn das gesamte Knochenmark gesammelt wurde, sedimentieren Sie das Knochenmark durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in zwei Milliliter roter Blutkörperchen Lysepuffer wieder auf. Nach vier bis fünf Minuten bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schütteln, stoppen Sie die Reaktion mit 10 Milliliterzellkulturmedium und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter CM-10-R-Kulturmedium für das Zählen wieder auf und passen Sie die Zellen für ein mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter CM-10-R-Kulturmediumkonzentration an.Als nächstes fügen Sie 100 Einheiten pro Milliliter rekombinantes murinen GM-CSF und 10 Einheiten pro Milliliter IL-4 zu den Zellen hinzu. Vier Milliliter Zellen für ihre Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 48 Stunden in einzelne Brunnen einer sechs Brunnenkulturplatte geben. Am Ende der Inkubation die nicht haftenden Zellen sanft ansaugen.Fügen Sie frisches Medium, das mit GM-CSF und IL-4 ergänzt wird, zu den Kulturen hinzu, bevor Sie die Zellen für eine Zusätzliche 48 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen. Am Ende der zweiten Inkubation ernten Sie das nicht anhaftende Knochenmark, das dendritische Zellen für ihre Zentrifugation in 50 Milliliter Konustube gewonnen hat. Um BMDC-CYP-ALDH-Zellen zu erzeugen, setzen Sie die Kulturen ein mal zehn bis sechs literarisch pro 500 Mikroliter CM-10-R-Medium pro Brunnenkonzentration wieder aus und verdichten Sie 500 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen einer neuen sechs Brunnenkulturplatte.Fügen Sie 50 Mikroliter des LENTI-CYP-ALDH-Virus und 8 Mikrogramm pro Milliliter Protamin zu jedem Brunnen hinzu, dann legen Sie die Platte 24 Stunden lang in den Inkubator. Am nächsten Tag die Überstande durch frisches Kulturmedium ersetzen und die Platten für weitere 24 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben. Am Ende der zweiten Inkubation können die Zellen 24 Stunden vor der Ernte für funktionelle Analysen mit 100 Nanogramm pro Milliliter Lipopolysaccharid pro Brunnen aktiviert werden.Im Vergleich zu den dendritischen Zellen des elterlichen Knochenmarks zeigen BMDC-CYP-ALDH-Zellen eine verbesserte Expression von 1-Alpha-Hydroxylase. Die Konzentrationen der aktiven Form von Vitamin D in den Kulturüberobnatten von BMDC-CYP- und BMDC-CYP-ALDH-Zellen sind etwa 20-mal höher als die konzentrationen, die in dendritischen Zellunden des elternknochenmarks und der BMDC-ALDH-Zellkulturen beobachtet wurden. Die mittleren fluoreszierenden Intensitäten von BMDC-CYP-ALDH-Zellen, die mit dem Substrat behandelt werden, sind etwa sechsmal höher als die von zahngebundenen Knochenmarkabgeleiteten dendritischen Zellen, die mit dem Substrat behandelt werden.Dies deutet darauf hin, dass die BMDC-CYP-ALDH-Zellen eine signifikant verbesserte retinale Dehydhydrogenase-2-Enzymaktivität ausdrücken. DC2.4-Zellen, die mit 25-Hydroxy-Vitamin D und Netzhaut behandelt werden, induzieren keine signifikante Veränderung in der Fülle von foxp3-positiven CCR9-positiven CD4-positiven T-Zellen. Im Gegensatz dazu induzieren DC2.4 CYP-ALDH-Zellen, die mit 25-Hydroxy-Vitamin D und Netzhaut behandelt werden, signifikant höhere Anzahl von Darmhoming-regulatorischen T-Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise.Darüber hinaus induzieren DC CYP-ALDH-Zellen im Vergleich zu intraperitoneal injizierten Kontrollzellen auch eine signifikante Zunahme der Anzahl der foxp3-positiven CD4-positiven CD4-positiven T-Zellen nach intraperitonealer Injektion in BALB/c-Empfängertiere. Der Erfolg des Verfahrens hängt von der Herstellung gesunder T-Zellen und einer korrekt vorbereiteten DNA-Mischung ab.

in-vivo-augmentation-of-gut-homing-regulatory-t-cell-induction

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Competitive Homing Experimente erlauben die direkte Beurteilung der wandernde Eigenschaften von zwei verschiedenen Zellpopulationen in einem einzigen Mausklick. Hier veranschaulichen wir dieses Verfahren durch einen Vergleich der Migration von ex vivo generierten gut-tropic versus nicht-gut tropic T-Zellen.

Competitive Homing-Assays auf Gut-trope T-Zell-Migration Study

Murine Knochenmark-Transplantation ist eine weit verbreitete Technik, um immunologische Mechanismen für Graft-versus-Host-Krankheit beim Menschen zu studieren. Die Fähigkeit zur T-Zell-Trafficking-Muster zu...

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Wir beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen regulatorische, Speicher und naive T-Zellen aus einem einzelnen menschlichen Blutspender. Polarisierten Tregs können dann auf andere Teilmengen in einer Vielzahl von genetischen und funktionelle Anwendungen mit genetische Homogenität, einschließlich einer Unterdrückung Assay auch hier detailliert verglichen werden.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion von Dickdarmentzündungen bei Mäusen durch adoptiven Transfer von syngenen CD4+CD45RBhohen T-Zellen in T- und B-Zell-defiziente Empfänger. Klinische und histopathologische Merkmale ahmen entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen nach. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Beginns von Dickdarmentzündungen und des Fortschreitens der Krankheit.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

Wir stellen hier eine Methode zur Entwicklung von funktionellen Antigen (Ag)-spezifischen regulatorischen T-Zellen (Tregs) aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) für die Immuntherapie von Autoimmunarthritis in einem Mausmodell vor.

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Dieses Protokoll beschreibt die reproduzierbare Erzeugung und Phänotypisierung von humanen regulatorischen T - Zellen induziert (iTregs) von naiven CD4 + T - Zellen in vitro. Verschiedene Protokolle für FOXP3 Induktions ermöglichen die Untersuchung spezifischer iTreg Phänotypen mit jeweiligen Protokollen erhalten.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Methode zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten thymischen Auswanderern (iTE) durch ein dreidimensionales (3D) thymische Kultursystem. iTE sind eine homogene Teilmenge von T-Zellen, die eng mit naiven T-Zellen verwandt sind und die Fähigkeit zur Proliferation, Gedächtnisbildung und Tumorunterdrückung haben.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Wir beschreiben ein schnelles und robustes Protokoll, um invariante natürliche Killer-T-Zellen (iNKT) aus Mausmilz anzureichern und sie in vitro auf geeignete Zahlen für In-vitro- und In-vivo-Studien zu erweitern.

Aufreinigung und Expansion von mausinvarianten natürlichen Killer-T-Zellen für in vitro und in vivo Studien

In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.

Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse

Dieses Protokoll beschreibt die in vivo Reprogrammierung von Krebszellen der Maus in dendritisch-ähnliche Zellen vom Typ 1 innerhalb der Tumormikroumgebung durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren PU.1, IRF8 und BATF3.

Steuerbare in vivo Reprogrammierung von Tumorzellen zu konventionellen dendritischen zellähnlichen Zellen vom Typ 1

Erfahren Sie die Induktion von Darm-homing regulatorischen T-Zellen durch gentechnisch veränderte dendritische Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Rolle von Vitamin D und A im Immunsystem.

In Vivo Augmentation der Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

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