Name: Ein verzögertes Impfmodell der chronischen Pseudomonas aeruginosa Wundinfektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Erfahren Sie ein verzögertes Impfmodell für chronische Pseudomonas aeruginosa-Wundinfektionen bei immunkompetenten Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bakterieller Pathogenese und Wirt-Pathogen-Interaktionen ohne Immunsuppression.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Der pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 Leuchtkonstruktvektor war ein gnädiges Geschenk von J. Hardy. Schemata wurden mit BioRender.com erstellt. Wir danken dem Labor von G. Gurtner für ihre Ratschläge zum Wundinfektionsmodell. Wir danken auch T. Doyle vom Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging für sein technisches Know-how. Diese Arbeit wurde durch Stipendien R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093 und Stipendien von Stanford SPARK, dem Falk Medical Research Trust und der Cystic Fibrosis Foundation (CFF) an P.L.B. C.R.D unterstützt, die von T32AI007502 unterstützt wurde. Ein Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineering und ein Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinary Graduate Fellowship unterstützten J.M.S.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stanford University genehmigt.
1. Vorbereitung und Wachstum von Bakterien
<ol><li>Führen Sie alle Arbeiten mit P. aeruginosa und Tieren mit BSL-2-Vorkehrungen gemäß den Richtlinien des institutionellen Ausschusses für biosicherheitspolitische Sicherheit und Tierverwendungsausschüsse des Forschers durch. Führen Sie alle hier beschriebenen Schritte mit P. aeruginosa, einschließlich der Mausimpfung, in einem Biosicherheitsschrank aus.</li>
	<li>Der leuchtende PAO1:lux-Stamm von P. aeruginosa ist auf Anfrage in unserem Labor erhältlich. Streak PAO1, gelagert als gefrorener Glycerinbestand, auf Lysogeny Broth (LB) Agar. Für den lumineszierenden PAO1:lux-Stamm sollte LB-Agar selektive Antibiotika enthalten (100 g/ml Carbenicillin und 12,5 g/ml Kanamycin). Wachsen Sie bei 37 °C über Nacht in einem bakteriellen Inkubator.</li>
	<li>Wählen Sie eine isolierte Kolonie und wachsen Sie über Nacht bei 37 °C in 3 ml LB Medium, pH 7,4. Bei lumineszierenden Stämmen sollte die Brühe 100 g/ml Carbenicillin enthalten. Wachsen Sie unter schüttelnden, aeroben Bedingungen.</li>
</ol>2. Verfahrensvorbereitung
<ol><li>Lassen Sie alle Mitarbeiter, die eine Operation durchführen, ein sauberes Kleid/Lab-Mantel, Gesichtsmaske, Haarnetz und Handschuhe tragen.</li>
	<li>Autoklaven Sie alle chirurgischen Werkzeuge, einschließlich Schere und Zange. Verwenden Sie aseptische Technik, um Werkzeuge zwischen Tieren zu sterilisieren.</li>
	<li>Reinigen Sie den OPERATIONStisch mit Ethanol und bereiten Sie ein sauberes Operationsfeld vor.</li>
</ol>3. Haarentfernung
<ol><li>Anästhetisieren Sie 8–12 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse mit 1%–3% Isofluran. Die Ermittler sollten die Richtlinien des Veterinärpersonals ihrer Institution für anästhesien befolgen, wenn isoflurane verwendet werden.<ol>
<li>Starten Sie die Anästhesie, indem Sie 1%–3% Isofluran liefern und den Sauerstoffdurchfluss auf 1,5 l/min einstellen. Platzieren Sie die Maus in der Induktionskammer.</li>
		<li>Pinch die Maus Zehen, um die Tiefe der Anästhesie zu beurteilen. Wenn die Maus nicht mehr auf Stimulation reagiert, entfernen Sie sie aus der Induktionskammer und legen Sie sie mit der Nase in den Isofluran-Nasenkegel auf die Operationsbank.</li>
		<li>Okularschmierstoff auf beide Augen auftragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiegen Sie die Maus, um ein Grundgewicht vor der Prozedur zu erhalten.</li>
	<li>Stellen Sie die Maus in eine anfällige Position. Injizieren Sie die Maus subkutan mit vorgewärmten sterilen 0,9% Natriumchlorid, 250 l an jeder Flanke für insgesamt 500 l.</li>
	<li>Rasieren Sie den dorsalen Bereich der Maus mit einem elektrischen Rasierer. Die Rasur sollte an einem anderen Ort als der chirurgischen Station erfolgen, um eine Haarkontamination der Wunde zu verhindern.</li>
	<li>Tragen Sie eine dünne Schicht Haarentfernung Lotion. Lassen Sie die Lotion für 20-60 s sitzen. Entfernen Sie das Haar und überschüssige Lotion mit Gaze in warmem Wasser befeuchtet. Nach der Haarentfernung, gehen Sie mit dem exzisionalen Verwundungsverfahren.</li>
</ol>4. Volle Dicke exzisionale Wundchirurgie
<ol><li>Injizieren Sie das subkutane Buprenorphin 0,6–1 mg/kg subkutan mit einer 25 G Nadel im mittleren Dorsalen bereich der Maus. Langsame Freisetzung Buprenorphin bietet Schmerzlinderung über 48-72 h.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die chirurgische Stelle. Wischen Sie die dorsale Oberfläche mit einem sterilen Betadine-Tupfer ab. Überschüssiges Betadin mit einem sterilen Alkoholtupfer abwischen. Dies sollte 3 Mal durchgeführt werden (abwechselnd zwischen Betadin und Alkohol), Abstriche, indem sie sich von der Mitte in einer kreisförmigen Weise an den Rand bewegen. Lassen Sie den Bereich trocknen.</li>
	<li>Erstellen Sie einen Vorhang, der die chirurgische Stelle mit steriler Gaze oder Kunststoff-Klebefolie umgibt.</li>
	<li>Stretch Haut straff kaudal. Verwenden Sie einen sterilen Hautbiopsie-Punch mit 6 mm Durchmesser, um einen ersten Schnitt durch die linke dorsale Epidermis zu machen. Wiederholen Sie dies auf der rechten dorsalen Epidermis.</li>
	<li>Verwenden Sie Zangen, um die Haut aus der Mitte des links umrissenen Wundbereichs zu zelten. Verbrauchen Sie die epidermalen und dermalen Schichten mit einer Schere. Wiederholen Sie dies auf der rechten Umrissbereich, um symmetrische Exzisionswunden zu erstellen.</li>
	<li>Wunden mit 50 l steriler Saline waschen. Lassen Sie die chirurgische Stelle und die umgebende Haut trocknen. Dann bedecken Sie die Wunden und dorsum mit einem transparenten Filmverband.</li>
	<li>Legen Sie die Maus wieder in einen sauberen Käfig. Haus 1 Tier pro Käfig.</li>
	<li>Legen Sie den Käfig auf ein Heizkissen und überwachen Sie, bis die Maus aufwacht.</li>
	<li>Wenn Sie die oben genannte Operation an mehreren Tieren durchführen, verwenden Sie einen heißen Perlensterilisator, um alle chirurgischen Instrumente zwischen den Tieren zu reinigen.</li>
	<li>Erlauben Sie 24 h für die Mäuse, sich vom chirurgischen Eingriff zu erholen und eine provisorische Wundmatrix über den Wunden zu bilden, bevor Sie mit Bakterien impfen.</li>
</ol>5. Impfung mit P. aeruginosa
<ol><li>Über Nacht PAO1:lux-Kultur auf OD600 = 0,05 in 75 ml LB-Medien verdünnen, die 100 g/ml Carbenicillin enthalten, und die Bakterien wachsen, bis sich die Kultur in einer frühen exponentiellen Phase befindet (OD600 x 0,3). Dies sollte etwa 2-3 h dauern.</li>
	<li>PAO1:lux in PBS auf eine Konzentration von (7,5 x 2,5) x 102 KBE/ml verdünnen. Achten Sie darauf, überschüssiges Inokulum vorzubereiten, um ausreichend Volumen zu gewährleisten und eine Beschichtung nach dem Experiment zu ermöglichen. Wenn Sie zwischen Einrichtungen (d.h. vom Labor zum Vivarium) transportieren, verwenden Sie die doppelte Einschließung in einer leckagenden Box mit deutlich emprogdiengeschützter Aufschrift Biohazard.</li>
	<li>Führen Sie alle Arbeiten mit P. aeruginosa und Mäusen mit zugelassener persönlicher Schutzausrüstung in einem tierbiologischen Sicherheitsschrank (ABSL-2) durch, der für biologische Sicherheit (BSC) zugelassen ist. Wiederverwendbare Geräte wie die Waage sollten mit Einertinkelfolie abgedeckt werden, um eine Kontamination zu verhindern.</li>
	<li>Anästhetisieren mit 3% Isofluran, wie oben beschrieben. Wiegen Sie die Maus und zeichnen Sie das Gewicht auf. Injizieren Sie die Maus subkutan mit vorgewärmten sterilen 0,9% Natriumchlorid, 250 l an jeder Flanke für insgesamt 500 l.</li>
	<li>Wenn das transparente Filmdressing der Maus über Nacht abgekommen ist, entfernen Sie alle resultierenden Schorf sorgfältig und ziehen Sie ein neues Dressing an.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 500-L-Tuberkulin-27-G-Sicherheitskappenspritze, um 40 l der PAO1:lux-Suspension durch den transparenten Folienverband in jede Wunde zu injizieren. Verschiedene Mäuse sollten für nicht geimpfte/PBS-Wundkontrollen verwendet werden, um kreuzkontaminationen von der kontralateralen Seite zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie die Maus wieder in ihren Käfig auf einem Heizkissen und überwachen Sie, bis sie aufwacht. Alle Mäuse sollten einzeln in separaten Käfigen untergebracht werden, um kreuzkontaminationen zu verhindern.</li>
	<li>Bieten Sie kalorienreiche Nahrungsergänzungsmittel Paste zwischen Lebensmittelpellets auf dem Boden des Käfigs eingeklemmt.</li>
	<li>Verwenden Sie das restliche Inokulum, um eine LB-Agarplatte zu streichen. Zählen Sie Kolonien, um die Anzahl der verabreichten Bakterien zu bestätigen.</li>
</ol>6. In-vivo-Bildgebung infizierter Wunden
<ol><li>Befolgen Sie die BSL-2-Containment-Protokolle für den Transport von Mäusen zum und vom Bildgebungsinstrument, einschließlich der Verwendung eines sekundären Behälters. Achten Sie darauf, während des Transfers der Maus in die Induktionskammer oder das Bildgebungsinstrument keine Tierbetten zu übertragen oder fallen zu lassen.</li>
	<li>Induzieren Sie die Anästhesie der Maus mit inhaliertem 1%–3% Isofluran in einer Induktionskammer, wie in Schritt 3.1 beschrieben.</li>
	<li>Sobald die Maus anästhesiert ist, legen Sie sie in eine anfällige Position in der Bildkammer eines optischen Bildgebungssystems mit der Nase im Isofluran-Nasenkegel.</li>
	<li>Öffnen Sie das Softwareprogramm.</li>
	<li>Die Erfassungsparameter variieren je nach Anzahl der gleichzeitig abgebildeten Tiere und der Intensität der Biolumineszenz. Zu den festzulegenden grundlegenden Parametern gehören Belichtungszeit, Binning, f/Stop und Sichtfeld (FOV). Unsere Standard-Starteinstellungen sind Belichtungszeit 30 Sekunden, Binning low (2), f/stop 1.2 und FOV 25. Passen Sie diese Einstellungen je nach Bedarf an den Anforderungen des Forschers an.</li>
	<li>Analysieren von Lumineszenzdaten mithilfe eines Bildgebungsprogramms (siehe Tabelle der Materialien). Lumineszenz wird als Pseudofarbbild dargestellt, das auf einem Farbfoto der Mäuse überlagert wird.<ol>
<li>Erstellen Sie eine Region von Interesse (ROI) an der Wundstelle und messen Sie den durchschnittlichen Fluss (Photonen/Sekunde) gemessen. Beachten Sie, dass Daten auch als Ausstrahlung (Photonen/Sekunde/cm2/Steradian) gemeldet werden können, aber solange der Abstand der Bildplattform von der Kamera zwischen der Bildgebung konstant bleibt, ist der Fluss ausreichend.</li>
		<li>Messen Sie den Hintergrund, indem Sie einen ROI in einem zufälligen Bereich auf der Bildverarbeitungsplattform erstellen. Subtrahieren Sie die Hintergrundanzahl der Photonen/Sekunde.</li>
		<li>Exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse in eine Kalkulationstabelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die Bildgebung wie oben beschrieben so oft wie täglich durchzuführen, um das Fortschreiten der Infektion zu verfolgen.</li>
</ol>7. Postoperatives Management
<ol><li>Überwachen Sie Mäuse gemäß den Richtlinien des IACUC-Protokolls des Forschers. Wir überwachen alle Mäuse täglich für die ersten 4 Tage, dann jeden zweiten Tag bis zum Ende des Experiments. Wiegen Sie die Mäuse einmal täglich für die ersten 4 Tage nach der Operation in einem BSC. In jizieren Sie an den Tagen 1 und 2 an den Tagen 1 und 2 2 250 l 0,9 % Natriumchlorid subkutan injizieren.</li>
	<li>Überprüfen Sie auf Anzeichen von Schmerzen/Distress bei den Mäusen, einschließlich geknickter Körperhaltung, schroffer Mantel, Lethargie, Atembeschwerden, Gesichtsgrimassen und Gewichtsverlust.</li>
	<li>Wenn Tiere Anzeichen einer Verschlechterung der Gesundheit zeigen, konsultieren Sie einen Tierarzt. Jede Maus, die sich verschlimmernde Anzeichen von Schmerz/Not und einen Gewichtsverlust von 20% oder mehr zu zeigen scheint, sollte eingeschläfert werden.</li>
</ol>8. Wundexzision
<ol><li>Am Ende des Experiments opfern Sie die Mäuse mit CO2-Inhalation, gefolgt von zervikalen Dislokationen. Entsorgen Sie den Tierkadaver gemäß den ABSL-2-Protokollen der Institution.</li>
	<li>Verbrauchen Sie Wundbetten mit steriler Schere und Zange in einem BSC. Legen Sie jedes Wundbett in 1 ml steriles PBS in ein 1,5 ml Polypropylenrohr. Das Wundgewebe mit einer Schere zerkleinern. Alle Wunden sollten als ASBL-2 behandelt werden, auch wenn sie nicht als infiziert gelten.</li>
	<li>Auf einem Shaker bei 300 Umdrehungen pro Minute für 2 h bei 4 °C inkubieren. Wirbel jede Röhre für 10 s und seriell verdünnen die bakteriellen Abwässer in PBS. Die verdünnten bakteriellen Abwässer auf LB-Agar auftragen, um die bakterielle Belastung aufzuzählen.</li>
	<li>Betrachten Sie Wunden infiziert, wenn Lumineszenz signal in der Wunde ist über Hintergrund Lumineszenz und mehr Bakterien in der Wunde Abwasser als in Wunden mit PBS als Kontrolle geimpft erkannt werden.</li>
</ol>

<ol><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li>
<li>Serra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+infections%3A+the+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).</li>
<li>Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infections+due+to+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa%3A+epidemiology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options.</a> Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).</li>
<li>Secor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+Bacteriophage+Produced+by+Pseudomonas+aeruginosa+Alters+the+Inflammatory+Response+and+Promotes+Noninvasive+Infection+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo.</a> Infection and Immunity. 85 (1), (2017).</li>
<li>Rice, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+life+cycle+and+virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+dependent+on+a+filamentous+prophage%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage.</a> The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).</li>
<li>Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+early+Pseudomonas+aeruginosa+lung+disease+with+transition+to+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection.</a> Scientific Reports. 6, 35838(2016).</li>
<li>van Gennip, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+polymorphonuclear+leukocytes+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+silicone+implants+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo.</a> Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).</li>
<li>Trøstrup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB%2Fc+mice+in+a+novel+chronic+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li>
<li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+study+of+delayed+wound+healing+in+a+biofilm-challenged+diabetic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model.</a> Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).</li>
<li>Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+neutrophil+chemotaxis+and+infiltration+contributes+to+delayed+resolution+of+cutaneous+wound+infection+with+advanced+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age.</a> Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).</li>
<li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li>
<li>Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide-induced+neutropenia%3A+effect+on+postischemic+skin-flap+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+wound+infection+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice.</a> Advances in Wound Care. , (2019).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+trigger+antiviral+immunity+and+prevent+clearance+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

Wir haben ein neuartiges Modell für die verzögerte Impfung P. aeruginosa Wundinfektion entwickelt. Die Strategie, die Impfung mit Bakterien nach exzissiver Verwundung um 24 stunden zu verzögern, ermöglicht die Bewertung von Wundinfektionen über einen Zeitraum von einer Woche. Durch die Verwendung eines lumineszierenden Stammes von P. aeruginosaist es möglich, das Infektionsverlauf während des Infektionsverlaufs zu verfolgen. Der längere Infektionsverlauf im Vergleich zu anderen P. aeruginosa-Infekti...

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ist ein gramnegatives, stabförmiges Bakterium mit zunehmender Relevanz für die menschliche Gesundheit und Krankheit. Es ist verantwortlich für eine umfangreiche Morbidität und Mortalität in nosokomialen Umgebungen, insbesondere mit Wundinfektionen bei immungeschwächten Patienten1,2. Das Aufkommen multiresistenter Stämme dieses Erregers hat weitere Impulse für die Untersuchung von Faktoren gegeben, die zur Virulenz von P. aeruginosa, Mechanismen der Antibiotikaresistenz von P. aeruginosa und neuen Methoden zur Vorbeugung und Behandlung dieser tödlichen Infektion beitragen3. Daher war der Bedarf an Tiermodellen chronischer Wundinfektionen als Werkzeuge zur Untersuchung dieser Forschungsfragen noch nie so groß.
Leider neigen viele Tiermodelle der P. aeruginosa-Infektion dazu, eine akute Infektion mit schneller Auflösung der Infektion oder einem schnellen Rückgang aufgrund der Sepsis4,5zu simulieren, was die oft chronische Natur dieser Infektionen nicht ausreichend simuliert. Um diesen Nachteil zu beheben, nutzen einige Modelle die Implantation von Fremdkörpern wie Agarperlen, Silikonimplantaten oder Alginatgelen6,7,8. Andere Modelle verwenden Mäuse, die aufgrund des fortgeschrittenen Alters, Adipositas oder Diabetes immungeschwächt sind, oder durch pharmakologische Mittel wie Cyclophosphamid-induzierte Neutropenie9,10,11,12. Jedoch, entweder die Verwendung von Fremdstoffen oder immungeschwächte Wirte verändert wahrscheinlich den lokalen Entzündungsprozess, so dass es schwierig, ein Verständnis der Pathophysiologie in chronischen Wundinfektionen bei Wirten mit ansonsten normalen Immunsystem beteiligt zu gewinnen.
Wir haben ein chronisches Modell der P. aeruginosa Wundinfektion bei Mäusen entwickelt, das eine verzögerte Impfung mit Bakterien nach exzisionalen Wunden beinhaltet. Verzögerte Impfung ermöglicht Experimente zur Beurteilung der bakteriellen Belastung, die sich auf mindestens 7 Tage ausdehnt. Dieses Modell eröffnet neue Möglichkeiten für die Untersuchung sowohl pathogenese als auch neuer Behandlungen von chronischen Infektionen mit P. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>0,9 % Natriumchlorid-Injektion</td><td>Hospira</td><td>2484457</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 sterile Nadel</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1 1/5 sterile Nadel</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Alkoholtupfer</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Aura Imaging Software</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Frederick Company</td><td>19-065534</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin SR LAB</td><td>Zoopharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J männliche Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Biopsie-Stanze, 6mm</td><td>Integra</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere - Wolframkarbid</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen-Trockensterilisator</td><td>Harvard-Gerät</td><td>61-0183</td><td></td></tr><tr><td>Granulierter Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9744</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Milliard</td><td>804879481218</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze mit 28 G Nadel</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Lago X Imaging System</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Leur-Lok 1 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Mini Arco Tiertrimmer</td><td>Wahl Professional</td><td>919152</td><td></td></tr><tr><td>Nair Haarentfernungslotion mit Babyöl</td><td>Church und Dwight</td><td>n/a</td><td>In jeder Apotheke erhältlich</td></tr><tr><td>Octagon Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11041-08</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Falke</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Press and Seal Frischhaltefolie</td><td>Glad</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SafetyGlide Insulinspritze mit 30 G Nadel</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Safetyglide Insulin Spritze, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Ohaus Scout Pro</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>Supplical Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Henry Schein Tiergesundheit</td><td>29908</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm, 6 cm x 7 cm</td><td>3M</td><td>1624W</td><td></td></tr></tbody></table>

ein verzögertes impfmodell der chronischen pseudomonas aeruginosa wundinfektion

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ist ein großer nosokomialer Erreger von zunehmender Relevanz für die menschliche Gesundheit und Krankheit, insbesondere bei chronischen Wundinfektionen bei Diabetikern und stationären Patienten. Es besteht ein dringender Bedarf an chronischen Infektionsmodellen, die bei der Untersuchung der Wundpathogenese und der Entwicklung neuer Therapien gegen diesen Erreger helfen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine verzögerte Impfung 24 Stunden nach der exzisionalen Verwundung mit voller Dicke verwendet. Die Infektion der provisorischen Wundmatrix, die zu diesem Zeitpunkt vorhanden ist, versichre entweder eine schnelle Clearance oder Verbreitung von Infektionen und stellt stattdessen eine chronische Infektion fest, die 7–10 Tage dauert, ohne dass Fremdstoffe implantation oder Immunsuppression erforderlich sind. Dieses Protokoll imitiert einen typischen zeitlichen Verlauf einer postoperativen Infektion beim Menschen. Die Verwendung eines lumineszierenden P. aeruginosa-Stamms (PAO1:lux) ermöglicht eine quantitative tägliche Beurteilung der bakteriellen Belastung für P. aeruginosa Wundinfektionen. Dieses neuartige Modell kann ein nützliches Werkzeug bei der Untersuchung der bakteriellen Pathogenese und der Entwicklung neuer Therapien für chronische P. aeruginosa Wundinfektionen sein.

Mit einem lumineszierenden PaO1-Stamm mit einem Plasmid, das für das luxABCDE-Reportersystem (PAO1:lux) kodiert, führten wir exzisierende Verwundungen an Mäusen durch, impften diese Wunden mit planktonischem P. aeruginosa 24 h später und maßen die bakterielle Belastung im Laufe der Zeit(Abbildung 1 und Abbildung 2). Ein repräsentatives Bild, das mit einem optischen Bildsystem gewonnen wurde, zeigt, dass dieses Modell zu ...

Wir beschreiben ein verzögertes Impfprotokoll zur Erzeugung chronischer Wundinfektionen bei immunkompetenten Mäusen.

Ein verzögertes Impfmodell der chronischen Pseudomonas aeruginosa Wundinfektion

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es ein Modell für chronische Pseudomonas aeruginosa Wundinfektion ohne die Notwendigkeit einer Fremdstoffimplantation oder Immunsuppression beschreibt. Verzögerte Impfung mit Pseudomonas aeruginosa 24 Stunden nach voller Dicke excisionalWunden prostalls die schnelle Clearance und Verbreitung der Bakterien, eine Infektion, die sieben bis zehn Tage dauert. Dieses einzigartige Modell wird ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der bakteriellen Pathogenese, Wirtspathogen-Wechselwirkungen und die Entwicklung neuer Therapien für chronische Pseudomonas aeruginosa Wundinfektionen sein.Bei einer Demonstration des Eingriffs wird Dan Liu, ein Medizinstudent des Bollyky-Labors, dabei sein. Vor Beginn des Verfahrens, wiegen Sie eine anästhesierte acht bis 12 Wochen alte Maus, um ein Grundgewicht zu erhalten und die Maus in die anfällige Position zu legen. Nach Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf den Pedalreflex, subkutan injizieren Sie die Maus mit 250 Mikroliter vorgewärmt steril0,9% Natriumchlorid auf jeder Flanke.Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer, um das Haar aus dem rückenden Bereich der Maus zu entfernen und eine dünne Schicht Enthaarungscreme auf die exponierte Haut aufzutragen. Nach 20 bis 60 Sekunden, entfernen Sie das Haar und überschüssige Lotion mit Gaze in warmem Wasser befeuchtet. Für eine volldicke exzistive Wundchirurgie verwenden Sie zunächst eine 25-Meter-Nadel, um 0,6 bis ein Milligramm pro Kilogramm anhaltendes Freisetzungsbuprenorphin im mittleren Dorsalbereich der Maus subkutan zu injizieren und die chirurgische Stelle mit drei alternativen sterilen Betadine- und Alkoholabstrichen kreisförmig abzuwischen.Legen Sie einen Kunststoff-Klammer-Wrap-Drap über die chirurgische Stelle und dehnen Sie die Haut kauend straff. Wenn die Haut getrocknet ist, verwenden Sie einen sterilen Hautbiopsie-Punch mit sechs Millimetern Durchmesser, um einen ersten Schnitt durch die linke dorsale Epidermis zu machen, gefolgt von einem zweiten Schnitt auf der rechten dorsalen Epidermis. Verwenden Sie Zangen, um die Haut aus der Mitte des links umrissenen Wundbereichs zu zelten und verwenden Sie eine Schere, um die epidermalen und dermalen Schichten zu verbrauchen.Nach dem Wiederholten des Schnittes auf der rechten umrissenen Wundfläche, um symmetrische Exzisionswunden zu erzeugen, waschen Sie beide Wunden mit 50 Mikroliter steriler Saline. Wenn die chirurgische Stelle und die umgebende Haut getrocknet sind, bedecken Sie die Wunden und dorsum mit einem transparenten Filmverband und legen Sie die Maus in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. 24 Stunden nach der Operation die reanästhetisierte Maus erneut wiegen und das Tier subkutan mit 250 Mikrolitern vorgewärmten sterilen 0,9% Natriumchlorid in beiden Flanken injizieren.Als nächstes laden Sie 100 Mikroliter der leuchtenden P.aeruginosa-Dehnungssuspension in eine 500-Mikroliter-Tuberkulin-Sicherheitskappenspritze, die mit einer 27-Spur-Nadel ausgestattet ist, und injizieren 40 Mikroliter Bakteriensuspension durch den transparenten Folienverband in jede Wunde. Stellen Sie sicher, dass die bakterielle Suspension gut gemischt ist und dass der transparente Verband intakt ist. Achten Sie darauf, dass Sie den transparenten Verband nur einmal mit der Nadellünette nach oben durchstechen.Dann kehren Sie die Maus zu ihrem Käfig auf einer Heizseite mit Überwachung und bieten kalorienreiche Nahrungsergänzungsmittel Paste zwischen Lebensmittelpellets auf dem Boden des Käfigs eingeklemmt. Das restliche Inokulum auf einer LB-Agarplatte verkleben und die Kolonien zählen, um die Anzahl der verabreichten Bakterien zu bestätigen. Für die In-vivo-Bildgebung der infizierten Wunden folgen Sie den Biosicherheitsstufen zwei Containment-Protokolle für den Transport der Mäuse zum und vom Bildgebungsinstrument und platzieren sie die anästhesierte Maus in der anfälligen Position innerhalb der Bildgebungskammer.Legen Sie in der Bildverarbeitungssoftware belichtungszeit, Binning, F-Stop und Sichtfeld als für das Experiment geeignet fest. Erstellen Sie als Nächstes eine Region, die an der Wundstelle von Interesse ist, und messen Sie den durchschnittlichen festgestellten Fluss in Photonen pro Sekunde. Um den Hintergrund zu messen, erstellen Sie einen Bereich von Interesse über einen zufälligen Bereich auf der Bildverarbeitungsplattform und subtrahieren Sie die Hintergrundanzahl der Photonen pro Sekunde.Am Ende des Experiments, in einem Bio-Sicherheitsschrank, verwenden Sie sterile Schere und Zange, um die Wundbetten zu verbrauchen und legen Sie jedes Bett in einem Milliliter sterilen PBS in einem 1,5 Milliliter Polypropylen-Rohr. Schneiden Sie das Wundgewebe mit einer Schere und inkubieren Sie die Gewebestücke auf einem Shaker bei vier Grad Celsius in 300 Umdrehungen pro Minute für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation wirbelt jede Röhre 10 Sekunden lang, bevor das bakterielle Abwasser in PBS seriell verdünnt und das verdünnte bakterielle Abwasser auf LB-Agar plattiert wird, um die bakterielle Belastung zu quantifizieren.Dieses repräsentative Bild, das mit einem optischen Bildsystem gewonnen wurde, zeigt, dass dieses Modell zu einer nachweisbaren Lumineszenz führt. In diesem Experiment erreichte die Infektion ihren Höhepunkt am dritten Tag nach der Impfung und blieb sieben Tage nach der Impfung auf der Grundlage der Biolumineszenz- und Kolonieanzahl. Die Kultur der aus der Wunde isolierten Bakterien zeigt weiter, dass die quantifizierten Koloniebildenden Einheiten pro Wunde mit der nachgewiesenen Lumineszenz korrelieren.Obwohl es eine erste schnelle Gewichtsabnahme unmittelbar nach der Injektion, Saline-Injektionen und zusätzliche Ernährung können die Mäuse zu ihren ursprünglichen Gewichten wiederherstellen. Die berechnete Impfdosis, von der 50% der Wunden im Wesentlichen infiziert werden, wurde als etwa 7,7-mal 10 bis zur zweiten Kolonie bildenden Einheiten pro Milliliter bestimmt. Dosen, die höher als ein mal 10 bis die vierte Kolonie bildende Einheiten pro Milliliter führen zu einer 100%igen Infektionsrate.Verschiedene topische und systemische Behandlungen können nach den Wund- und Impfverfahren angewendet werden, um neue mögliche Therapien für Pseudomonas aeruginosa zu untersuchen. Alle Arbeiten mit Pseudomonas aeruginosa und infizierten Mäusen sollten mit BSL-2 Sicherheitsvorkehrungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Forschers für die institutionelle Biosicherheit und den Einsatz von Tieren durchgeführt werden.

a-delayed-inoculation-model-chronic-pseudomonas-aeruginosa-wound

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: de Vries, C. R., et.al. Ein verzögertes Impfungsmodell der chronischen Wundinfektion von Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die verzögerte Impfung von leuchtender Pseudomonas aeruginosa in eine Maus, die zwei vollwertige Dorsalhautwunden trägt, die von einem transparenten Filmverband abgedeckt sind. Dies erleichtert die Bildung von Biofilmen und die Entstehung chronischer Infektionen. Regelmäßige Biolumineszenzüberwachung ermöglicht die Quantifizierung der...

Entwicklung eines Mausmodells der chronischen Pseudomonas aeruginosa-Hautwundinfektion 

Wir beschreiben die Agar-Perlen Methode, um anhaltende langfristige chronische Pseudomonas aeruginosa-Infektion der Atemwege im Mausmodell zu etablieren.

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

Wir haben ein Modell für Lungenverletzungen von Mäusen durch intratracheale Injektion des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa entwickelt. Dieses Modell ahmt Lungenschäden bei Lungenentzündungen nach und ist klinisch relevant.

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

Während in vitro Studien von Wirt-Erreger-Interaktionen die Charakterisierung spezifischer Immunantworten ermöglichen, sind in vivo Modelle erforderlich, um die Auswirkungen komplexer Reaktionen zu beobachten. Unter Verwendung der Exposition von Candida albicans, gefolgt von einer Pseudomonas aeruginosa-vermittelten Lungeninfektion, etablierten wir ein Mausmodell für mikrobielle Interaktionen, die an der Pathogenität der beatmungsassoziierten Pneumonie beteiligt sind.

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Hier beschreiben wir eine neuartige diabetische Mausmodell nutzt haarlose Mäusen für Echtzeit-, nicht-invasive Überwachung der Biofilm Wundinfektionen der Biolumineszenz Pseudomonas Aeruginosa. Diese Methode lässt sich die Infektion anderer Bakterienarten und genetisch veränderten Mikroorganismen, einschließlich Multi-Spezies Biofilme und testen die Wirksamkeit von Antibiofilm Strategien anpassen.

Besuchen Sie die Licht-Seite: In Vivo Monitoring von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Infektionen bei chronischen Wunden in einer diabetischen haarlose Mausmodell

Hier beschreiben wir ein Protokoll, histologische und molekulare Analyse von Hautproben nach Candida Albicans intradermale Injektion ermöglicht. Dieses Protokoll hält die strukturelle Integrität der Haut und erlaubt die Lokalisierung von Gewebe-Resident oder neu rekrutierten Immunzellen sowie die Verteilung der Erreger.

Tief dermalen Injektion als ein Modell von Candida Albicans Infektion der Haut für histologische Analysen

Chronische Wunden werden aus akuten Wunden auf einem diabetischen Mausmodell entwickelt, indem sie nach einer schweren Kutanwunde einen hohen Grad an oxidativem Stress induzieren. Die Wunde wird mit Inhibitoren für Katathase und Glutathionperoxidase behandelt, was zu einer beeinträchtigungen Heilung und Biofilmentwicklung durch Bakterien im Hautmikrobiom führt.

Protokoll zur Herstellung chronischer Wunden bei diabetischen Mäusen

Periprothetische Gelenkinfektionen (PJI), die durch gefährliche Krankheitserreger verursacht werden, sind in der klinischen Orthopädie weit verbreitet. Bestehende Tiermodelle können die tatsächliche Situation von PJI nicht genau simulieren. Hier haben wir ein Candida albicans-Biofilm-assoziiertes PJI-Mausmodell etabliert, um neue Therapeutika für PJI zu erforschen und zu entwickeln.

Ein periprothetisches Gelenk-Candida albicans-Infektionsmodell in der Maus

Chronische Wunden, die gegen Antibiotika resistent sind, stellen eine große Bedrohung für das Gesundheitssystem dar. Biofilminfektionen sind hartnäckig und feindlich und können zu einem mangelhaften funktionellen Wundverschluss führen. Wir berichten über ein klinisch relevantes Schweinemodell von Biofilm-infizierten chronischen Wunden voller Dicke. Dieses Modell eignet sich sowohl für mechanistische Studien als auch für das Testen von Interventionen.

Schweinemodell für Biofilminfektion und unsichtbare Wunden

Derzeit fehlt es an in vivo-Modellen , die sich für ein Wirkstoffscreening gegen chronische bakterielle Infektionen eignen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Wundinfektion mit einem klinischen Isolat von Pseudomonas aeruginosa , um eine persistierende Infektion bei Zebrafischlarven zu erzeugen.

Modellierung einer persistierenden Pseudomonas aeruginosa-Infektion bei verwundeten Zebrafischlarven

Erfahren Sie ein verzögertes Impfmodell für chronische Pseudomonas aeruginosa-Wundinfektionen bei immunkompetenten Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bakterieller Pathogenese und Wirt-Pathogen-Interaktionen ohne Immunsuppression.

Ein verzögertes Impfmodell der chronischen Pseudomonas aeruginosa Wundinfektion

Weitere Videos entdecken